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(山東寶來利來生物工程股份有限公司，山東 泰安 271000)

0 引言

安卡拉病又叫雞心包積液-肝炎綜合癥，因首次發(fā)現(xiàn)于巴基斯坦卡拉奇靠近安卡拉的地方，故又名安卡拉病(Angrara disease),主要以心包積液、肝腫大為特征的疾病。是由I群禽腺病毒引起。禽腺病毒(Fowl adenovirus,FAV)是一種無囊膜的雙鏈DNA病毒，衣殼呈規(guī)則的20面體結(jié)構(gòu)，直徑80～110 nm，可分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三群，其中Ⅰ群FAV有12個(gè)血清型(FAV1～12)，Ⅰ群FAV具有共同的群抗原，比較著名的病毒株有雞包涵體肝炎病毒、胚致死孤兒病毒(CELO virus)等，產(chǎn)蛋下降綜合征病毒屬于Ⅲ群，其中Ⅰ群FAV中C種FAV-4型認(rèn)為是引起雞心包積液綜合征的病原[1]。

本病主要開始發(fā)生于1～3周齡的肉雞、817、麻雞，也可見于肉種雞和蛋雞，其中以3～7周齡的雞發(fā)病較多。發(fā)病雞群多于3周齡開始死亡，4～5周齡達(dá)高峰，高峰持續(xù)期4～8 d，5～6周齡死亡減少。病程8～15 d，死亡率達(dá)20%～80%，一般為30%。發(fā)病雞無明顯先兆而突然倒地，沉郁，羽毛成束，出現(xiàn)呼吸道癥狀，甩鼻、呼吸加快，排黃色稀糞，有神經(jīng)癥狀，兩腿劃空。本病主要垂直傳播，也可水平傳播。雞感染后可成為終身帶毒者，并可間歇性排毒。

本文介紹的這起病例是山東省泰安市某蛋雞場發(fā)生的一起大規(guī)模急性死亡病例，該養(yǎng)殖場蛋雞養(yǎng)殖量為6 000只，雞群剛開始零星死亡，幾天后傷亡程度急劇增加。死亡率達(dá)在20%。筆者從發(fā)病雞場分離出一株典型的安卡拉病毒,命名為TA001株,經(jīng)本中心出方案治療后，大群基本恢復(fù)正常?，F(xiàn)將本病診斷、病原分離及鑒定過程介紹如下。

1 材料與方法

1.1 材料

被檢病料：泰安市某蛋雞場送檢病死雞數(shù)十只；

SPF雞胚:購自濟(jì)南賽斯；

自動(dòng)加濕孵化器：南昌華拓實(shí)業(yè)有限公司；

taq酶購自上海生物工程有限公司；

DNA/RNA提取試劑盒廠家為Takara；

DNA Marker(DL2000)廠家為Takara；

2×Taq PCR Master Mix廠家solarbio；

其他試劑均為國產(chǎn)或進(jìn)口分析純。

1.2 方法

1.2.1 病料處理

無菌取病死雞脾臟、肝臟用組織研磨器研磨,用滅菌生理鹽水按照1∶4體積制備懸液,反復(fù)凍融3次,8 000 r/min離心15 min,棄沉淀,取上清加入終濃度為4000 IU/mL的青霉素、鏈霉素,37℃作用2 h除菌,- 20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 病料的PCR 檢測

根據(jù)GenBank中公布的安卡拉病毒的保守序列，設(shè)計(jì)引物，引物序列為：FAV-F- AATTTCGACCCCATGACGCGCCA ；FAV-R-TGGCGAAAGGCGTACGGAAGTA引物由博尚生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，預(yù)期擴(kuò)增片段大小為 508bp[2]。

按照Takara DNA/RNA提取試劑盒的方法從處理病料中提取病毒,隨后進(jìn)行PCR,并設(shè)陰性對(duì)照?？偡磻?yīng)體系為25 μL，含mix 12.5μL上游引物1μL，下游引物1 μL，模板DNA 1 μL，dd水9.5 μL。PCR反應(yīng)條件為：95℃5 min；94℃45 s；59℃ 退火 45 s；72℃ 延伸1 min；35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。

此外病料進(jìn)行禽流感病毒，新城疫病毒，傳染性支氣管炎病毒的PCR驗(yàn)證[3]，以排除此3種病毒存在。

1.2.3 雞胚接種

取處理過的病料上清液過0.22μm濾器除菌，并進(jìn)行無菌檢驗(yàn)。采用絨毛尿囊膜接種法接種10日齡SPF雞胚10枚,每胚接種0.2 mL,同時(shí)設(shè)等量生理鹽水對(duì)照。置37℃孵化器內(nèi)繼續(xù)孵化,每日照胚2次,記錄雞胚死亡情況,棄去24 h內(nèi)死亡的雞胚。未死雞胚至接種后5 d后置于4℃冰箱凍死，收集卵黃液，并標(biāo)記為FAV1代。

1.2.4 雞胚傳代

雞胚持續(xù)傳代，取FAV1代雞胚卵黃液,采用絨毛尿囊膜接種法傳代至FAV5代，并觀察雞胚死亡情況。

1.2.5 PCR驗(yàn)證

按照Takara DNA/ RNA 提取試劑盒的方法從FAV5代卵黃液中提取病毒,進(jìn)行PCR反應(yīng),并設(shè)陰性對(duì)照。

1.2.6 測序比對(duì)

將上述PCR產(chǎn)物送檢測序，并根據(jù)測序結(jié)果進(jìn)行比對(duì)。

1.2.7 人工感染試驗(yàn)

將FAV5代卵黃液采用腹腔注射方式接種10只1日齡SPF雞，每只0.2 mL，并設(shè)定對(duì)照組，隔離飼養(yǎng)，逐日觀察至攻毒后第14天。剖檢發(fā)病死亡雞觀察病變，并進(jìn)行PCR驗(yàn)證。

2 結(jié)果

2.1 臨床癥狀

病雞精神沉郁，食欲不振乃至廢絕，嗜睡、羽毛粗亂缺少光澤(圖1)。潛伏期短、發(fā)病快發(fā)病頭2～3 d多表現(xiàn)突然死亡，2～3 d后死亡猛地增加，死亡率上升快，高峰持續(xù)一個(gè)星期左右。

圖1 病死雞消瘦，羽毛粗亂缺少光澤

2.2 剖檢病變

本次剖檢病死雞共計(jì)12只，剖檢后發(fā)現(xiàn)腹腔油脂堆積，心肌柔軟心包積有淡黃色透明的滲出液(清水或已發(fā)黃渾濁，嚴(yán)重的為暗紅色血水)；肝臟腫脹、充血、邊緣鈍圓、質(zhì)地變脆，呈淡褐色或黃褐色，表面有密集的小出血點(diǎn)和出血斑，嚴(yán)重的有不同程度的壞死；腎臟腎小管腫脹發(fā)白、個(gè)別雞只腎臟出血；腺胃乳頭有出血點(diǎn)，肌胃角質(zhì)層出血極容易剝離；脾臟腫大(圖2)。

2.3 病料PCR檢測

分別進(jìn)安卡拉，新城疫,流感，傳染性支氣管炎病毒的PCR擴(kuò)增。結(jié)果：僅安卡拉有特異性條帶，且與預(yù)期大小(508bp)接近。說明病料中有安卡拉病毒，無其余3種疑似病毒存在(圖3)。

圖2 病雞腹腔油脂堆積，肝臟脾臟腫脹

M，Marker(DL2000) ；1，安卡拉；2，禽流感；3，新城疫；4，傳染性支氣管炎

圖3 PCR結(jié)果

2.4 雞胚傳代

FAV1代繼續(xù)傳代,依次傳代直至5代，雞胚尿囊膜增厚，胚體全身出血，頸部和頭部有嚴(yán)重的出血斑，發(fā)育較遲緩，嚴(yán)重雞胚剖檢后可見有肝壞死現(xiàn)象，符合安卡拉病毒的特性(圖4)。

圖4 FAV5代 對(duì)照組雞胚與死亡雞胚

2.5 FAV5 PCR檢測

用DNA提取試劑盒提取FAV5代卵黃液安卡拉病毒,并進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得大小約為508bp的預(yù)期目的片段(圖5)。

M ，Marker(DL2000) ；1，F(xiàn)AV5代卵黃液

2.6 測序比對(duì)

將PCR產(chǎn)物送檢測序，結(jié)果與GenBank中公布的禽腺病毒(登錄號(hào)：KY436520.1)同源性為99%。這些結(jié)果表明，成功分離到1株安卡拉病毒，遂將該分離株命名為TA001(圖6)。

圖6 TA001毒株部分基因測序結(jié)果

2.7 人工感染試驗(yàn)

從FAV5代攻毒后第3天開始，攻毒組開始死亡，攻毒后第5天50%的雞死亡，之后一直觀察到攻毒后第14天，全部死亡。對(duì)照組雞一直到觀察期結(jié)束，臨床表現(xiàn)正常未見死亡。死亡雞剖檢變化與自然發(fā)病雞一致，均可見心包積液、肝壞死等特征(見圖7)。從發(fā)病死亡雞肝也能分離到安卡拉病毒。

圖7 死亡感染雞肝臟病變

3 討論

綜上所述， 筆者從發(fā)病雞脾臟和肝臟病料中分離到一株病毒,經(jīng)SPF雞胚連續(xù)傳代、PCR鑒定和測序及動(dòng)物試驗(yàn)初步確定該病毒為安卡拉病毒,命名為TA001株。

近年我國頻繁爆發(fā)此病，安卡拉病毒已成為威脅我國養(yǎng)禽業(yè)的重要病毒之一。安卡拉病目前尚無有效的防控措施，我國大多數(shù)雞場一直未將該病納入免疫程序。針對(duì)此次疫情，筆者參考國內(nèi)外對(duì)該病的防控經(jīng)驗(yàn)，提出了一些防控措措施[4]。

(1)對(duì)發(fā)病養(yǎng)殖場實(shí)行嚴(yán)格的消毒并隔離，防止該病向周邊地區(qū)擴(kuò)散。

(2)要做好流感、新城疫等疫病的免疫預(yù)防，以減少臨床發(fā)病率與死亡率。

(3)養(yǎng)殖場采用保肝護(hù)腎和強(qiáng)心利尿的中藥，以緩解肝臟病變。

(4)發(fā)病嚴(yán)重的雞可采用組織水苗以及卵黃抗體預(yù)防治療。

(5)感染該病毒后，機(jī)體免疫力下降，往往會(huì)繼發(fā)禽流感等其他疾病，加速了病雞的死亡。該養(yǎng)殖場后期再送檢的病死雞開始出現(xiàn)新城疫和細(xì)菌混合感染的現(xiàn)象，因此此病一旦病發(fā)后應(yīng)適當(dāng)添加抗病毒和抗菌藥物藥物控制繼發(fā)感染。此外可適當(dāng)添加一些微生態(tài)制劑類產(chǎn)品，其含有的枯草芽孢桿菌、乳酸菌，高效拮抗腸道有害菌，優(yōu)化腸道菌群，增強(qiáng)機(jī)體非特異性免疫。幫助患雞重建健康的腸道內(nèi)環(huán)境。

通過以上治療，10 d后回訪，雞群死亡率大幅度減少，大群精神狀態(tài)良好。