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(四川省動物疫病預防控制中心，四川 成都 610041)

0 引言

沙門菌(Salmonellae)是革蘭陰性桿菌，兼性厭氧，隸屬腸桿菌科、沙門菌屬。沙門菌是一種重要的人獸共患病病原，每年全世界會有數(shù)千人因沙門菌感染而住院或死亡。沙門菌依據(jù)不同的O抗原和H抗原，迄今已檢出2 500種以上的血清型。人最常見的是鼠傷寒沙門菌和腸炎型沙門菌。豬可感染多個血清型，除鼠傷寒沙門菌和豬霍亂沙門菌外，很少有其他血清型能引起豬臨床發(fā)病[1-2]。20世紀90年代初，沙門菌耐藥性已成為一個全球性問題。臨床上由于長期或超量使用抗生素沙門菌感染被有效控制的同時也加劇了細菌耐藥性的產(chǎn)生[3]。因此，研究沙門菌的耐藥性對于獸醫(yī)臨床用藥風險的評估及指導獸醫(yī)科學合理用藥具有十分重要的意義。

本研究對分離自四川省資陽市某規(guī)模豬場的一株沙門菌進行了分離鑒定，采用全自動微生物分析系統(tǒng)對分離株的耐藥情況進行分析，并從分子水平對其毒力基因的攜帶情況進行調(diào)查，從而為養(yǎng)豬生產(chǎn)中有效控制沙門菌感染以及合理使用抗生素提供科學依據(jù)，為四川省養(yǎng)豬業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 主要儀器和試劑

PCR儀購自美國伯樂公司；VITEK 2 COMPACT 全自動微生物分析系統(tǒng)購自生物梅里埃公司；緩沖蛋白胨水(BPW)、木糖賴氨酸脫氧膽鹽(XLD)瓊脂、胰蛋白胨大豆瓊脂(TSA)、胰蛋白胨大豆肉湯(TSB)、革蘭氏染色液試劑盒購自青島海博生物有限公司；沙門氏菌屬診斷血清(60種)購自寧波天潤生物藥業(yè)有限公司；VITEK- 2 AST-GN13藥敏卡購自四川德佩萊科技有限公司；premix Taq(Ex Taq Version 2.0)購自大連寶生物工程有限公司；引物合成自生工(上海)生物工程有限公司。

1.2 樣品采集

樣品于2017年9月采集自資陽市某規(guī)模豬場。用棉拭子隨機采集不同階段表觀健康豬直腸糞便樣本30份，隨即接種于含3mL BPW培養(yǎng)基的試管中，帶回實驗室置于42℃搖床上震搖24～48 h預增菌，另取空白BPW培養(yǎng)基作為空白對照。

1.3 分離純化

吸取適量預增菌液劃線接種于XLD平板，37℃培養(yǎng)過夜；挑取可疑菌落，再次在XLD平板上劃線純化，37℃培養(yǎng)過夜；挑取單菌落進行革蘭染色鏡檢，將疑似沙門菌的單菌落接種于TSB液體培養(yǎng)基和TSA平板，37℃培養(yǎng)過夜，待用。

1.4 InvA基因PCR鑒定及16S rDNA測序

以菌液為模板，利用沙門菌特異性基因invA引物[4]及16S rRNA通用引物進行PCR擴增(引物序列見表1)。PCR反應體系為：2×PCR premix 12.5 μL，上下游引物各1μL，DNA模板2μL，補滅菌超純水使最終反應體系為25μL。PCR產(chǎn)物于1.5%瓊脂糖凝膠電泳30min后分析結(jié)果。同時，16S rRNA基因PCR產(chǎn)物送上海生工公司測序，測序結(jié)果在GenBank上進行序列比對。

1.5 血清型鑒定

按照GB 4789.4-2016的方法，用沙門氏菌屬診斷血清(60種)對分離的沙門菌進行血清型鑒定。運用玻板凝集法，先進行O抗原的鑒定，采用A-F多價O血清及單因子O血清判斷菌株所屬血清群；再采用H因子血清鑒定其鞭毛抗原，判斷菌株種屬。

1.6 耐藥性檢測

使用VITEK 2 COMPACT 全自動微生物分析系統(tǒng)對分離的菌株進行耐藥性檢測，方法按照VITEK- 2 AST-GN13藥敏卡操作說明書進行。

1.7 毒力基因檢測

根據(jù)文獻設計沙門菌毒力質(zhì)粒(spvA、spvB、spvC、spvD、spvR)[5,6]和毒力島(SPI)(ssaQ、sscA、sseC、sseD、sseE、sopB、mgtC)[5-7]兩大類毒力基因引物，由生工(上海)生物工程有限公司合成(引物序列見表1)。PCR反應體系為：2×PCR premix 12.5μL，上下游引物各1μL，DNA模板2μL，補滅菌超純水使最終反應體系為25μL。PCR產(chǎn)物于1.5%瓊脂糖凝膠電泳30min后分析結(jié)果。

表1 PCR所用引物序列

2 結(jié)果

2.1 細菌分離培養(yǎng)

從采集的表觀健康豬直腸糞便樣本中分離到疑似沙門菌1株。分離株在XLD平板上生長良好，呈現(xiàn)為帶有黑色金屬光澤的中等大小菌落，菌落周圍培養(yǎng)基呈粉紅色(圖1)；在TSA平板上生長良好，呈現(xiàn)為乳白色的中等大小菌落，邊緣光滑(圖2)。革蘭染色鏡檢為革蘭陰性、兩端鈍圓、短小桿菌、無莢膜、不形成芽孢(圖3)，與沙門菌的特征一致。

圖1 分離株在XLD平板上的形態(tài)

圖2 分離株在TSA平板上的形態(tài)

圖3 分離株革蘭染色形態(tài)

2.2 PCR鑒定及測序

以分離株純培養(yǎng)菌液為模板，PCR擴增后在1.5%瓊脂糖凝膠上進行電泳，可見invA基因約280bp、16S rRNA基因約1500bp的特異性條帶，擴增產(chǎn)物的大小與預期結(jié)果一致(圖4)。16S rRNA基因PCR產(chǎn)物經(jīng)測序后比對，結(jié)果表明該序列與NCBI上沙門菌的16S rRNA基因序列的同源性達到99%，由此確定分離株為沙門菌。

M:100bp DNA Ladder; 泳道1:invA; 泳道2:16S rRNA; 泳道3:spvA; 泳道4:spvB; 泳道5:spvC; 泳道6:spvD; 泳道7:spvR; 泳道8:ssaQ; 泳道9:sscA; 泳道10:sseC; 泳道11:sseD; 泳道12:sseE; 泳道13:sopB; 泳道14:mgtC.

圖4 PCR擴增電泳圖

2.3 血清型鑒定結(jié)果

分離株能與O多價A-F群血清發(fā)生凝集反應，經(jīng)血清型鑒定為鼠傷寒沙門菌，其血清型抗原式為O4Hi。

2.4 耐藥性檢測結(jié)果

根據(jù)VITEK 2 COMPACT 全自動微生物分析系統(tǒng)耐藥性檢測結(jié)果，分離株對哌拉西林、頭孢他啶、頭孢曲松、頭孢吡肟、氨曲南、厄他培南、亞胺培南、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、呋喃妥因、復方新諾明敏感，對氨芐西林、舒巴坦、頭孢唑啉、頭孢替坦、阿米卡星、慶大霉素、妥布霉素耐藥(表2)。

表2 分離株對不同抗菌藥的耐藥情況

注：S：敏感；R：耐藥；*R：檢測結(jié)果經(jīng)VITEK2高級專家系統(tǒng) (AES)修訂后認定為耐藥。

2.5 毒力基因攜帶情況

毒力基因檢測結(jié)果表明，分離株不攜帶spvA、spvB、spvC、spvD、spvR 5個spv毒力質(zhì)?；颍鴮saQ、sscA、sseC、sseD、sseE、sopB、mgtC 等7個SPI基因的檢測結(jié)果均為陽性。

3 討論

本文分離的沙門菌菌株屬于腸道沙門菌腸道亞種鼠傷寒血清型。鼠傷寒沙門菌具有較廣泛的宿主范圍，可引起多種動物的小腸結(jié)腸炎和敗血癥，也是導致人類食物中毒的主要細菌，對公眾健康具有潛在的威脅。沙門菌致病機制較為復雜，具有多種毒力基因，主要存在于毒力質(zhì)粒和染色體上的SPI中。在沙門氏菌的毒力質(zhì)粒中，spv與細菌的毒力表型關系最為密切，包括spvA、spvB、spvC、spvD、spvR基因等，其編碼的產(chǎn)物能增強細菌在宿主細胞內(nèi)生長，與腸系膜淋巴結(jié)、脾、肝等腸道外組織感染有關[8]。程瓊等[5]的研究結(jié)果表明，spv的存在能增強沙門菌菌株的致病力。除spv外，沙門菌大多數(shù)毒力基因由染色體上的SPI編碼。目前已發(fā)現(xiàn)的SPI有十幾個。其中，本研究中檢測的ssaQ、sscA、sseC、sseD、sseE為SPI2的主要基因，編碼與系統(tǒng)感染有關的Ⅲ型分泌系統(tǒng)；mgtC位于SPI3,與細菌在宿主巨噬細胞內(nèi)生存以及系統(tǒng)感染階段細菌在低Mg2+環(huán)境中的生長有關；sopB位于SPI5，主要與腸道疾病的發(fā)生有關，參與炎癥和氯化物分泌[7]。本研究的檢測結(jié)果表明，分離株攜帶有毒力島SPI2、SPI3、SPI5，但不攜帶毒力質(zhì)粒spv。毒力質(zhì)粒spv的缺失是否對分離株致病性有所影響還需通過動物試驗進一步驗證。

本研究對分離的豬源鼠傷寒沙門菌進行了18種抗菌藥的耐藥性分析。結(jié)果表明，分離株對其中大部分抗菌藥表現(xiàn)出較高的敏感性，可為臨床用藥提供參考；但對氨芐西林、舒巴坦、頭孢唑啉等7種抗菌藥表現(xiàn)出不同程度的耐藥，臨床上應慎用。近年來，隨著養(yǎng)殖業(yè)規(guī)?；⒓s化的不斷發(fā)展，豬群在應激、免疫抑制等不利因素作用下，很容易發(fā)生沙門菌的繼發(fā)、并發(fā)感染。由于抗生素的濫用和不規(guī)范使用，沙門菌的耐藥性不斷增強，使抗生素在沙門菌病防控中的作用大打折扣；加之沙門菌血清型眾多，使用疫苗防控的難度亦較大。因此，豬場在防控沙門菌病時，應以加強飼養(yǎng)管理、定期消毒為主，并結(jié)合藥敏試驗篩選敏感藥物等綜合措施，才能取得較好防控的效果。