， ， ，

(1.貴州師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院， 貴陽 550018；2.貴州省生物資源開發(fā)利用特色重點實驗室， 貴陽 550018)

白術(shù)(AtractylodesmacrocephalaKoidz)屬菊科多年生草本[1]，以根莖入藥，為我國常用特產(chǎn)藥材之一，主產(chǎn)湖南、安徽等地。近現(xiàn)代藥理研究表明：白術(shù)主要含內(nèi)酯類化合物、多糖和揮發(fā)油[2]。大量研究證明，白術(shù)對子宮平滑肌、調(diào)節(jié)免疫、調(diào)節(jié)胃腸功能、抗衰老、利尿、擴張血管、抗炎、抑菌、鎮(zhèn)靜、降血糖等有重要作用[3-4]。

目前我國白術(shù)的栽培現(xiàn)狀并不樂觀，白術(shù)人工栽培品種退化、產(chǎn)量低下，藥材品質(zhì)漸差，有效成分含量不穩(wěn)定，無法滿足市場的需求。多倍體具有抗逆性強、巨型性、藥用有效成分提高等特點[5-6]。藥用植物多倍體誘導(dǎo)技術(shù)發(fā)展很快，取得了一定的成就，國內(nèi)采用人工多倍體誘導(dǎo)技術(shù)培育出的中藥多倍體新品種有當(dāng)歸、黨參、菘藍(lán)、百合、牛膝、枸杞等30多個，多倍體育種逐漸成為藥用植物育種的最重要方法之一。國外對白術(shù)研究較少，外國學(xué)者多研究白術(shù)揮發(fā)油或?qū)Π仔g(shù)體內(nèi)的某些物質(zhì)的鑒定等[7-8]。國內(nèi)對白術(shù)的研究主要集中在白術(shù)的快繁技術(shù)[9]，栽培和管理[10]，藥理作用和化學(xué)成分[11]以及同源四倍體誘導(dǎo)鑒定[12]等方面。周日寶等[12]對白術(shù)同源四倍體株系的繁育進行過研究，但未見對白術(shù)四倍體擴繁移栽方面的相關(guān)報道。通過探索白術(shù)四倍體的最佳擴繁培養(yǎng)基及適宜移栽條件，為進一步開發(fā)和利用白術(shù)及白術(shù)新品種選育提供一定參考和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器和試劑

1.1.1 供試材料

白術(shù)試管中間繁殖材料保存于貴州特色生物資源開發(fā)利用重點實驗室，經(jīng)倍性鑒定后可作為擴繁及移栽試驗材料。

1.1.2 主要儀器

立式壓力蒸汽滅菌器(LDZX-50 KB)，上海申安醫(yī)療器械廠；光照培養(yǎng)箱(GZX-250)，天津市泰斯特儀器有限公司；雙人單面凈化工作臺(SW-CJ-2 FD)，蘇州凈化設(shè)備有限公司；實驗室pH計(pHSJ-3 F)，上海雷磁儀器廠。其他儀器均為一般常規(guī)儀器。

1.2 實驗方法

1.2.1 白術(shù)試管苗倍數(shù)鑒定

1) 解剖學(xué)鑒定：為進一步確定白術(shù)試管苗的染色體倍性，于晴天09：00時氣孔張開時，取植株上的功能葉片3～5片，置于卡諾氏固定溶液中(無水乙醇∶冰乙酸∶氯仿=6∶1∶3)固定2～3 h；待葉片褪色后放入蒸餾水中浸泡3～5 min，然后撕下下表皮置于載玻片上展平，滴上1%的I-KI溶液，制成臨時裝片，觀察氣孔大小、分布及葉綠體數(shù)目，計數(shù)，篩選區(qū)分四倍體苗。

2) 細(xì)胞學(xué)鑒定：將經(jīng)解剖學(xué)鑒定后根長為1～2cm的白術(shù)試管苗參照聶楊眉和向增旭等[13-14]的方法，分別將其根尖切下，放入濃度為0.002 mol/L的8-羥基喹啉溶液中進行預(yù)處理，溫度為10～20 ℃；處理4 h后，洗干凈放入卡諾氏固定液中固定24 h；固定好后用蒸餾水洗凈放入0.075 mol/L KCl溶液中低滲20～30 min，再放入0.2 mol/L HCl溶液中解離5～10 min，溫度為60 ℃；解離后浸泡在蒸餾水中，低滲30 min；處理完后，將根尖制成臨時裝片用顯微鏡觀察，統(tǒng)計染色體數(shù)量。

注：a為白術(shù)二倍體植株的氣孔大小及分布(10×10)；b為白術(shù)四倍體植株的氣孔大小及分布(10×10)；c為白術(shù)二倍體植株的葉綠體(4×10)；d為白術(shù)二倍體植株的葉綠體(4×10)。圖1 白術(shù)二倍體和四倍體植株氣孔與保衛(wèi)細(xì)胞的比較

1.2.2 白術(shù)試管苗增殖培養(yǎng)

(1)系統(tǒng)產(chǎn)生(0,1)內(nèi)的隨機數(shù)rv,如果粒子的變異概率pvi大于rv,則發(fā)生變異,其中pvi如式(7)所示。

將以鑒定后的白術(shù)二倍體、四倍體試管苗誘導(dǎo)的叢生芽苗切成帶有2～3個芽的小芽團，立即接種到添加不同濃度生長調(diào)節(jié)劑的增殖培養(yǎng)基培養(yǎng)。供試增殖培養(yǎng)基配方：NAA濃度為0.2 mg/L，6-BA濃度分別為0.5，1.0，1.5，2.0 mg/L。每周觀察記錄增殖生長情況，篩選最適增殖培養(yǎng)基。

1.2.3 白術(shù)試管苗生根培養(yǎng)

選擇經(jīng)擴繁莖比較粗，葉片厚且深綠的健壯二倍體試管芽苗及同源四倍體芽苗進行生根培養(yǎng)：將無根芽苗接種于1/2 MS+0.5 mg/L NAA的生根培養(yǎng)基里培養(yǎng)。

1.2.4 白術(shù)試管苗移栽

選擇長勢一致的根長為2～3 cm的白術(shù)試管苗，將其分別移栽到經(jīng)高錳酸鉀+甲醛熏蒸處理過的珍珠巖+蛭石(1∶1)、細(xì)沙+園土(2∶1)、園土+碳渣(2∶1)含水量為75%～85%的基質(zhì)中，及基質(zhì)含水量分別為85%～95%、75%～85%、65%～75%的園土+碳渣(2∶1)基質(zhì)中。觀察記錄白術(shù)試管苗的成活率和長勢，篩選最佳移栽基質(zhì)及移栽基質(zhì)含水量。

1.3 培養(yǎng)條件及移栽條件

培養(yǎng)基pH值：5.8～6.0；培養(yǎng)溫度：(25±1)℃；光照時間：16 h/d；相對濕度：35%～60%，光照度：1 500～2 000 lx。

2 結(jié)果與分析

2.1 白術(shù)試管苗倍性鑒定

2.1.1 白術(shù)二倍體和四倍體的氣孔大小和葉綠體數(shù)量

由表1可以看出，白術(shù)二倍體植株葉片氣孔個數(shù)是四倍體植株的2.7倍；白術(shù)四倍體植株的保衛(wèi)細(xì)胞葉綠體數(shù)目是二倍體植株的1.9倍；白術(shù)四倍體植株的氣孔明顯大于二倍體植株的氣孔，但其氣孔分布較少，見圖1。

表1 白術(shù)二倍體和四倍體植株的氣孔數(shù)目與葉綠體數(shù)目比較

植株類型平均每視野氣孔數(shù)(個)平均每氣孔葉綠體數(shù)(個)二倍體植株11415四倍體植株4328

在顯微鏡下觀察根尖制成的臨時裝片結(jié)果為：白術(shù)二倍體植株的染色體條數(shù)為2 n=2 x=24，四倍體植株的染色體條數(shù)為2 n=2 x=48，見圖2。

2.2 生長調(diào)節(jié)劑對白術(shù)試管苗增殖培養(yǎng)的影響

接種在增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)的小芽團，增殖情況見表2，由表2可知：小芽團接種在不同濃度配比的培養(yǎng)基上，其增殖率不同：在NAA濃度不變的條件下，隨著6-BA的濃度增高增殖倍數(shù)增加，當(dāng)6-BA濃度超過1.5 mg/L時增殖倍數(shù)降低。此外，在不同激素配比的增殖培養(yǎng)基中小芽團的增殖周期均為30 d，且在6-BA濃度為1.0～2.0 mg/L之間，芽苗色綠，生長健壯，可見在MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L的培養(yǎng)基上增殖效果較佳。

2.3 移栽條件對白術(shù)試管苗移栽的影響

2.3.1 不同基質(zhì)配比對白術(shù)試管苗移栽的影響

移栽到不同配比相同含水量的基質(zhì)中，二倍體、四倍體試管苗的成活率和生長情況見表3。由表3可知：基質(zhì)配比為園土+碳渣(2∶1)的移栽條件下，白術(shù)試管苗的成活率最高，為34.72%，在該基質(zhì)配比下苗綠，莖較粗壯，根系較發(fā)達(dá)，長勢最佳。

2.3.2不同基質(zhì)含水量對白術(shù)試管苗移栽的影響

由表4可知，移栽到相同配比不同含水量基質(zhì)中的二倍體、四倍體試管苗成活率和生長情況：基質(zhì)含水量為75%～85%的移栽條件下，試管苗的成活率最高，為44.44%，在該基質(zhì)含水量下苗的長勢也最佳。

圖2 白術(shù)二倍體與四倍體植株染色體的比較

表2 不同生長調(diào)節(jié)劑配比對白術(shù)試管苗增殖的影響

激素配比(mg/L)接種芽數(shù)(個)增殖芽數(shù)(個)增殖倍數(shù)增殖周期(d)芽苗長勢6-BA0.5+NAA0.23103.3330苗綠,生長較健壯,增殖芽量略少6-BA1.0+NAA0.23237.6730苗綠,生長健壯,增殖芽量較多6-BA1.5+NAA0.23175.6730苗綠,生長健壯,增殖芽量較多6-BA2.0+NAA0.23124.0030苗綠,生長健壯,增殖芽量多

表3 不同基質(zhì)配比對白術(shù)試管苗移栽的影響

處理基質(zhì)配比移栽數(shù)(株)成活數(shù)(株)成活率(%)苗的長勢1珍珠巖+蛭石(1∶1)722331.94苗綠,莖粗壯,根系發(fā)達(dá)2細(xì)沙+園土(2∶1)721419.44苗綠,莖較細(xì),根系不發(fā)達(dá)3園土+碳渣(2∶1)722534.72苗綠,莖較粗壯,根系較發(fā)達(dá)

表4 不同基質(zhì)含水量對白術(shù)試管苗移栽的影響

處理含水量(%)移栽數(shù)(株)成活數(shù)(株)成活率(%)苗的長勢185%～95%721622.22苗綠,莖粗壯,根系發(fā)達(dá)275%～85%723244.44苗綠,莖較粗壯,根系較發(fā)達(dá)365%～75%721419.44苗綠,莖較細(xì),根系不發(fā)達(dá)

表5 相同移栽條件對白術(shù)二、四倍體試管苗移栽的影響

植株類型移栽條件移栽數(shù)(株)成活數(shù)(株)成活率(%)苗的長勢二倍體苗園土+碳渣(2∶1)含水量75%～85%241354.17苗綠,莖粗壯,根系發(fā)達(dá)四倍體苗園土+碳渣(2∶1)含水量75%～85%241666.67苗綠,莖較粗壯,根系較發(fā)達(dá)

2.3.3相同移栽條件對白術(shù)二倍體、四倍體試管苗移栽的影響

移栽到相同配比及含水量基質(zhì)中的二倍體、四倍體試管苗生長情況和成活率見表5。由表5可知：在基質(zhì)配比為園土+碳渣(2∶1)、基質(zhì)含水量為75%～85%的移栽條件下，白術(shù)二倍體試管苗的成活率為54.17%，白術(shù)四倍體試管苗的成活率為66.67%，且白術(shù)四倍體苗的長勢優(yōu)于白術(shù)二倍體苗。

3 結(jié)果與討論

3.1經(jīng)本實驗鑒定后發(fā)現(xiàn)：白術(shù)二倍體植株平均每視野的氣孔數(shù)目是四倍體植株氣孔數(shù)目的2.7倍，但其氣孔要小于四倍體植株的氣孔；白術(shù)四倍體植株平均每氣孔的葉綠體數(shù)量是二倍體植株葉綠體數(shù)量的1.9倍，但其葉綠體體積小于二倍體植株的葉綠體；白術(shù)四倍體植株的染色體數(shù)目為48條，二倍體植株的染色體數(shù)目為24條。

3.2本實驗設(shè)置了生長調(diào)節(jié)劑6-BA與NAA的不同濃度配比，發(fā)現(xiàn)不同濃度的6-BA對白術(shù)增殖有明顯的影響：6-BA的濃度過高或過低都會使白術(shù)增值率降低，當(dāng)6-BA的濃度為1.0 mg/L時，白術(shù)的增值率最大，增殖倍數(shù)為7.67，且苗的長勢最佳，即白術(shù)最適擴繁培養(yǎng)基為MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L。

3.3本實驗設(shè)置了不同的基質(zhì)配比、基質(zhì)含水量的移栽條件，將白術(shù)試管苗分別在不同的移栽條件下進行移栽生長，發(fā)現(xiàn)不同移栽條件對白術(shù)試管苗的成活率有明顯影響：基質(zhì)配比為園土+碳渣(2∶1)的基質(zhì)中，白術(shù)試管苗的成活率最高，為34.72%；基質(zhì)含水量為75%～85%的基質(zhì)中，白術(shù)試管苗的成活率最高，為44.44%。

3.4在基質(zhì)配比為園土+碳渣(2∶1)、基質(zhì)含水量為75%～85%的移栽條件下，四倍體試管苗的成活率為66.67%，二倍體試管苗的成活率為54.17%，白術(shù)四倍體試管苗的成活率高于二倍體試管苗的成活率12.50%，且四倍體苗的長勢較好。

3.5在本實驗移栽條件下，白術(shù)二倍體試管苗和四倍體試管苗的成活率均較低，使四倍體株系的繁育受到一定的影響，有待進一步優(yōu)化移栽條件提高移栽成活率。