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(1.貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/農(nóng)業(yè)生物工程研究院,貴州省農(nóng)業(yè)生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/山地植物資源保護(hù)與種質(zhì)創(chuàng)新省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,貴州省山地生態(tài)與農(nóng)業(yè)生物工程2011協(xié)同創(chuàng)新中心, 貴陽(yáng) 550025;2.貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院, 貴陽(yáng) 550006)

鉀(potassium)是植物生長(zhǎng)發(fā)育所必需的三大礦質(zhì)元素之一，在植物體代謝過(guò)程中扮演著重要角色。有研究證明，鉀可作為植物體內(nèi)多達(dá)60余種酶的活化劑[1]，促進(jìn)蛋白質(zhì)、糖類的合成與轉(zhuǎn)運(yùn)[2]；是調(diào)節(jié)植物細(xì)胞滲透勢(shì)、維持細(xì)胞膨壓的重要元素，參與葉片及氣孔的運(yùn)動(dòng)和細(xì)胞伸長(zhǎng)等過(guò)程[3]。煙草(NicotianatabacumL.)，為茄科一年生或有效多年生草本植物，是我國(guó)的重要經(jīng)濟(jì)作物之一，種植面積和總產(chǎn)量居世界首位[4]，同時(shí)煙草作為喜鉀的典型作物，其產(chǎn)量及品質(zhì)與其鉀含量密切相關(guān)[5]。鉀含量高的煙葉呈深橘色，香氣足，吃味醇和，富有彈性和韌性，填充性好，陰燃持火力和燃燒性好[6]。國(guó)際市場(chǎng)上的優(yōu)質(zhì)煙葉鉀含量多大于2.5%，而我國(guó)煙葉鉀含量卻很少超過(guò)2%[7]。鉀素在土壤中以氯化鉀、硝酸鉀、硫酸鉀等鹽類形式存在，在水中鉀鹽解離成離子形式后被植物的根部吸收。研究表明，在缺鉀土壤中增施鉀肥可極顯著地增加作物產(chǎn)量[8]；在中高等施鉀水平條件下，早施追肥和分期施肥有利于煙葉品質(zhì)及產(chǎn)量的提高[9]；在同等養(yǎng)分輸入條件下，礦物態(tài)鉀肥對(duì)作物生物量和鉀營(yíng)養(yǎng)吸收沒(méi)有效果，而水溶態(tài)鉀肥和構(gòu)溶態(tài)鉀肥均能顯著提高作物的生物量、鉀素含量及鉀素積累量[10]。選擇合適的種植土壤及合理使用鉀肥均對(duì)提高煙葉的鉀含量具有重要意義。然而，我國(guó)的植煙土壤都處于低鉀狀態(tài)且我國(guó)鉀肥資源的缺乏限制了對(duì)鉀肥的大量施用。因此，通過(guò)基因工程育種方法提高煙草植株對(duì)土壤中鉀離子的吸收利用能力，對(duì)提高我國(guó)煙葉鉀含量具有重要意義。高等植物的鉀離子高親和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(high-affinity potassiumion transporter protein,HAK)是KUP/HAK/KT鉀通道蛋白家族中的一員，該家族蛋白能夠介導(dǎo)植物根細(xì)胞對(duì)鉀離子的高親和吸收與積累，并響應(yīng)外界環(huán)境對(duì)植物造成的低鉀脅迫等[11-12]。譚穎等[13]分別將含有pSH 737和pSH-TH植物表達(dá)載體的工程農(nóng)桿菌通過(guò)共轉(zhuǎn)化法遺傳轉(zhuǎn)化煙草K 326葉片，獲得了多個(gè)能夠富集鉀素的煙草株系。

本研究以共轉(zhuǎn)化法獲得的超量表達(dá)煙草HAK1的轉(zhuǎn)基因煙草為材料，對(duì)其不同時(shí)期的形態(tài)學(xué)指標(biāo)、光合特性參數(shù)及鉀離子含量進(jìn)行了測(cè)定，為篩選具有較強(qiáng)光合能力且不含選擇標(biāo)記的煙草新種質(zhì)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

供試材料普通煙草品種K 326由貴州省煙草科學(xué)研究院提供；轉(zhuǎn)鉀離子高親和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(HAK 1)基因煙草株系100-23、59-10均由貴州省農(nóng)業(yè)生物工程研究院保存并提供；鉀測(cè)試盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

1.2 方 法

1.2.1 植株形態(tài)指標(biāo)的測(cè)定

對(duì)種植于同一實(shí)驗(yàn)基地(土壤pH值為7.2，有機(jī)質(zhì)含量為18.3 g/kg，全氮為1.03 g/kg，全磷為1.23 g/kg，全鉀為18.2 g/kg，堿解氮為0.082 g/kg，速效磷為0.021 g/kg，速效鉀為0.053 g/kg)的轉(zhuǎn)基因株系100-23、59-10和野生型K 326，分別在長(zhǎng)至團(tuán)棵期、旺長(zhǎng)期和成熟期時(shí)的植株形態(tài)學(xué)指標(biāo)，包括株高、莖圍、葉長(zhǎng)、葉寬和葉片數(shù)等進(jìn)行觀察記錄。測(cè)定方法按煙草農(nóng)藝性狀調(diào)查標(biāo)準(zhǔn)方法(YC/T 142-2010)[14]進(jìn)行測(cè)定。

1.2.2 光合特性參數(shù)的測(cè)定

光合特性參數(shù)的測(cè)定參照孫洪榮等[15]的方法，利用LI-6400便攜式光合作用測(cè)定系統(tǒng)，分別以種植于實(shí)驗(yàn)基地的生長(zhǎng)良好、長(zhǎng)勢(shì)一致的同一時(shí)期的轉(zhuǎn)基因煙草株系100-23和59-10從下至上第6片完展葉為材料，進(jìn)行凈光合速率(net photosynthetic rate,Pn)、氣孔導(dǎo)度(stomatal conductance,Gs)等光合特性指標(biāo)的測(cè)定，同時(shí)以相同株齡野生型煙草同一葉位的展葉作為對(duì)照。在無(wú)雨日的自然條件下測(cè)定，時(shí)間為10:00—18:00，每個(gè)株系各選3株，每隔1 h測(cè)定1次，每次測(cè)定重復(fù)3次。

表1 轉(zhuǎn)基因煙草株系和野生型煙草不同時(shí)期的農(nóng)藝性狀

團(tuán)棵期 旺長(zhǎng)期 成熟期 WT59-10100-23WT59-10100-23WT59-10100-23株 高26.62±6.25A14.50±2.27B14.84±0.78B62.48±7.40a68.60±5.31a65.26±6.07a109.34±8.74a112.57±7.35a106.96±5.30a莖圍18.84±1.52A13.77±2.70B14.17±1.02B24.97±1.18a25.72±1.82a23.78±1.09a29.13±1.01A29.51±0.82A26.85±0.82B葉長(zhǎng)34.00±2.58A28.08±1.49B26.18±2.11B46.04±2.82a46.90±1.06a45.90±0.76a53.04±3.76a53.50±2.26a52.94±1.79a葉寬21.22±2.35A15.10±1.61B14.04±2.18B23.92±2.42a26.00±0.52a24.82±2.58a26.72±1.83a27.23±0.60a27.52±2.10a葉片數(shù)15±1.73A11.25±0.96B11.80±1.10B21.4±1.52C26.33±1.15A24.80±0.45AB29.20±1.79a27.67±2.08a29.00±1.55a

注：表中小寫字母、大寫字母分別為0.05及0.01水平上的顯著性差異。

1.2.3 鉀離子含量的測(cè)定

在堿性介質(zhì)中，經(jīng)蛋白沉淀劑處理后的組織樣本中的鉀離子與NA-TPB反應(yīng)產(chǎn)生混濁并有穩(wěn)定的懸浮液。懸浮液與樣本中鉀離子濃度成正比。準(zhǔn)確稱取組織重量，按重量(g)∶體積(mL)=1∶9的比例加入9倍的去離子水，冰水浴勻漿，2 500 r/min 離心10 min，取上清液20μL加蛋白沉淀劑180μL，3 500 r/min 離心5 min，取上清50μL進(jìn)行測(cè)定。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft office Excel 2016軟件和SPSS 22.0軟件對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析及作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)學(xué)指標(biāo)的測(cè)定

分別于團(tuán)棵期、旺長(zhǎng)期、成熟期3個(gè)時(shí)期對(duì)轉(zhuǎn)基因株系59-10、100-23和野生型K 326進(jìn)行株高、莖圍、葉長(zhǎng)、葉寬、葉片數(shù)等形態(tài)學(xué)指標(biāo)的測(cè)定(表1)。結(jié)果顯示：團(tuán)棵期，轉(zhuǎn)基因株系59-10和100-23的株高、莖圍、葉長(zhǎng)、葉寬、葉片數(shù)的測(cè)定值分別為14.50 cm、13.77 cm、28.08 cm、15.10 cm、11.25片和14.84 cm、14.17 cm、26.18 cm、14.04 cm、11.80片，兩株系間差異達(dá)到顯著水平，但均極顯著地低于野生型K 326對(duì)應(yīng)的測(cè)定值；旺長(zhǎng)期，株系59-10葉片數(shù)的平均值比K 326高23.05%，株系100-23葉片數(shù)的平均值比K 326高15.89%，均達(dá)到極顯著水平，其它各項(xiàng)指標(biāo)均表現(xiàn)為差異不顯著；成熟期，株系100-23的莖圍測(cè)定平均值比K 326低7.81%，比株系59-10低8.99%，均達(dá)到極顯著水平，其余株高、葉長(zhǎng)、葉寬、葉片數(shù)等形態(tài)學(xué)指標(biāo)均表現(xiàn)為差異不顯著。

2.2 光合特性指標(biāo)

2.2.1 不同煙草株系凈光合速率日變化

凈光合速率日變化的測(cè)定結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因株系100-23、59-10和野生型品種K 326整體上均呈現(xiàn)10：00—15：00時(shí)間段內(nèi)先上升后下降、15：00—18：00時(shí)間段內(nèi)再上升再下降的趨勢(shì)；三者均在13：00時(shí)達(dá)到第一次峰值和16：00時(shí)達(dá)到第二次峰值，分別為22.15，21.95，21.17μmol/(m2·s)和19.29，19.88，19.28μmol/(m2·s)；10：00—15：00時(shí)，轉(zhuǎn)基因株系100-23的平均凈光合速率比野生型品種K 326高7.51%，轉(zhuǎn)基因株系59-10比K 326高2.91%；15：00—18：00時(shí)，轉(zhuǎn)基因株系100-23的平均凈光合速率比野生型品種K 326高12.12%，轉(zhuǎn)基因株系59-10比K 326高5.82%；在12：00、15：00、17：00時(shí)等3個(gè)時(shí)間點(diǎn)的凈光合速率測(cè)定結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因株系100-23均表現(xiàn)為極顯著地高于野生型品種K 326。

注：N=3;p<0.05(*),p<0.01(**) 。下同。圖1 不同煙草株系凈光合速率日變化

2.2.2 不同煙草株系氣孔導(dǎo)度日變化

氣孔導(dǎo)度日變化的測(cè)定結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因株系100-23、59-10和野生型品種K 326的整體趨勢(shì)基本一致，均接近于雙峰曲線，且株系100-23的曲線整體在K 326的曲線之上。10：00—15：00時(shí)，100-23的平均凈光合速率比K 326高25.18%，59-10比K 326高10.31%；15：00—18：00時(shí)，100-23的平均凈光合速率比K 326高41.76%，59-10比K 326高17.53%；13：00—17：00時(shí)，株系100-23的氣孔導(dǎo)度測(cè)定值均極顯著地高于K 326對(duì)應(yīng)的測(cè)定值。

圖2 不同煙草株系氣孔導(dǎo)度日變化

2.2.3 不同煙草株系胞間CO2濃度日變化

胞間CO2濃度日變化的測(cè)定結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因株系100-23、59-10和野生型品種K 326三者在測(cè)定時(shí)間內(nèi)的變化趨勢(shì)基本一致，均為自10：00時(shí)起緩慢下降至15：00時(shí)稍有回升，接著又繼續(xù)緩慢下降至17：00時(shí)后再次開始回升；10：00—18：00時(shí)，轉(zhuǎn)基因株系100-23的曲線整體居于K 326的曲線之上，且自13：00時(shí)起兩者之間的差異一直處于顯著或極顯著水平。

圖3 不同煙草株系胞間CO2濃度日變化

2.2.4 不同煙草株系蒸騰速率日變化

蒸騰速率日變化的測(cè)定結(jié)果顯示，10：00—18：00時(shí)，轉(zhuǎn)基因株系100-23的平均蒸騰速率比K 326高11.94%，轉(zhuǎn)基因株系59-10的平均蒸騰速率比K 326高10.86%，三者均在14：00時(shí)第1次達(dá)到最大峰值，分別為8.34，9.53，9.02 mmol/(m2·s)。14：00—18：00時(shí)，3個(gè)株系蒸騰速率均呈先下降后上升再下降的趨勢(shì)，轉(zhuǎn)基因株系100-23在17：00時(shí)再次達(dá)到最大峰值9.67 mmol/(m2·s)，59-10和K 326在16：00時(shí)再次達(dá)到最大峰值，分別為8.81，8.21 mmol/(m2·s)。

2.3 煙株鉀離子含量的測(cè)定

2.3.1 團(tuán)棵期不同株系煙草鉀離子含量的測(cè)定

由圖5可知，團(tuán)棵期，3種不同株系煙草的鉀離子含量由高到低的順序是59-10>K 326>100-23；方差分析結(jié)果顯示，3種不同煙草株系中兩兩之間差異達(dá)到極顯著水平，即轉(zhuǎn)基因煙草株系59-10的鉀含量極顯著地高于野生型煙草品種K 326，轉(zhuǎn)基因煙草株系100-23的鉀離子含量極顯著地低于野生型煙草品種K 326。

圖4 不同煙草株系蒸騰速率日變化

圖5 團(tuán)棵期不同株系煙草的鉀含量比較

2.3.2 開花期不同株系煙草鉀離子含量的測(cè)定

由圖6可知，開花期，3種不同株系煙草的鉀離子含量由高到低的順序?yàn)?00-23> K 326>59-10；方差分析結(jié)果顯示，3種不同煙草株系中兩兩之間差異達(dá)到極顯著水平，即轉(zhuǎn)基因煙草株系100-23的鉀含量極顯著地高于野生型煙草品種K 326，轉(zhuǎn)基因煙草株系59-10的鉀離子含量極顯著地低于野生型煙草品種K 326。

圖6 開花期不同株系煙草的鉀含量比較

3 結(jié)論與討論

鉀是植物生長(zhǎng)發(fā)育必需的營(yíng)養(yǎng)元素之一，也是植物體內(nèi)含量最為豐富的陽(yáng)離子。對(duì)酶的活化作用是鉀在植物體內(nèi)最重要的功能之一，目前已知植物體內(nèi)受到鉀直接或間接活化作用影響的酶超過(guò)60種，包括丙酮酸羧化酶、谷氨酰胺合成酶等合成酶類，氧化酶、脫氫酶組成的氧化還原酶類，丙酮酸激酶、肽基轉(zhuǎn)移酶等轉(zhuǎn)移酶類[16]。煙草作為典型的喜鉀作物，鉀素不僅對(duì)最終的煙葉品質(zhì)起著重要作用，而且在煙草植株生長(zhǎng)過(guò)程中，鉀營(yíng)養(yǎng)元素的含量顯著影響著其光合作用過(guò)程，決定了光合作用能量物質(zhì)轉(zhuǎn)化率[17]。研究表明，光合面積(影響光能截獲)的降低和光合同化能力的下調(diào)是缺鉀脅迫影響植物光合作用和限制其生長(zhǎng)的兩個(gè)重要原因[18-20]。

本研究以轉(zhuǎn)高親和鉀離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(HAK 1)基因煙草為材料，研究該基因?qū)Σ煌瑫r(shí)期各株系的形態(tài)學(xué)指標(biāo)、光合特性指標(biāo)及鉀離子含量的影響。發(fā)現(xiàn)2個(gè)轉(zhuǎn)基因株系59-10和100-23的各形態(tài)指標(biāo)的測(cè)量結(jié)果在團(tuán)棵期表現(xiàn)為顯著低于對(duì)照組K 326的相應(yīng)測(cè)量值，而至旺長(zhǎng)期及成熟期時(shí)，這些差異則在慢慢消失，且在旺長(zhǎng)期各株系的葉寬、葉長(zhǎng)均表現(xiàn)為差異不顯著時(shí)，轉(zhuǎn)基因株系59-10、100-23的葉片數(shù)則均極顯著地多于對(duì)照組K 326，大大提高了轉(zhuǎn)基因植株的光合面積。轉(zhuǎn)基因株系59-10、100-23的凈光合速率、氣孔導(dǎo)度、胞間CO2濃度和蒸騰速率均表現(xiàn)為整體上高于對(duì)照組K 326。研究表明，缺鉀脅迫下，植物葉片中葉綠素含量下降、二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(Rubisco)活性減小、光合同化產(chǎn)物積累并反饋抑制葉片凈光合速率[21]。因此，本研究中的轉(zhuǎn)基因煙株可能因具較高的富鉀能力，緩解了低鉀土壤對(duì)煙株的脅迫，促進(jìn)了煙株葉片葉綠素的生成量和穩(wěn)定性，加速了光合電子的傳遞及光合磷酸化，提高了光合磷酸化能力，提高了光合關(guān)鍵酶Rubisco和Rubisco活化酶(RCA)的含量和活性，且加速了碳水化合物的轉(zhuǎn)移與分配，從而削弱了光合同化產(chǎn)物積累對(duì)葉片凈光合速率的抑制作用。鉀離子可通過(guò)調(diào)節(jié)植物的氣孔開閉機(jī)制，改變CO2進(jìn)入葉肉細(xì)胞間隙的氣孔阻力，葉片鉀離子濃度的提高促使保衛(wèi)細(xì)胞吸收更多的水分以保障氣孔的開放，從而促進(jìn)葉片對(duì)CO2的吸收和同化，因此，氣孔導(dǎo)度與葉片鉀含量之間存在著顯著的正相關(guān)關(guān)系。當(dāng)葉片中的鉀充足時(shí)，能夠調(diào)節(jié)氣孔的規(guī)律性開放，提高蒸騰速率。

轉(zhuǎn)基因株系間往往也存在差異，可能是由于外源基因整合位點(diǎn)的差異造成的。從分子生物學(xué)角度來(lái)看，當(dāng)轉(zhuǎn)移一個(gè)外源基因到另一個(gè)物種基因組中時(shí)，外源基因進(jìn)入染色體上，它除產(chǎn)生了此基因編碼的外源蛋白或酶外，該外源蛋白或酶通過(guò)一系列的反應(yīng)也會(huì)導(dǎo)致其他酶或蛋白質(zhì)活性的增強(qiáng)或降低；另外，當(dāng)外源基因嵌入在染色體的某個(gè)區(qū)段時(shí)，必將對(duì)整個(gè)染色體產(chǎn)生影響，從而影響該染色體上其他基因的活性或調(diào)控機(jī)制。本研究中，轉(zhuǎn)基因株系59-10和100-23的凈光合速率、氣孔導(dǎo)度等指標(biāo)測(cè)定值也存在著不同程度的差異，具體原因仍有待進(jìn)一步研究。本研究中的轉(zhuǎn)高親和鉀離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(HAK 1)基因煙草株系與對(duì)照組K 326相比，具有較強(qiáng)的光合能力，為創(chuàng)制轉(zhuǎn)基因安全的煙草新種質(zhì)提供參考。