黨凱茹，彭騰，鄒和平，陳思敏，韓笑，匡宇，趙永艷

食用土當(dāng)歸為五加科楤木屬植物食用土當(dāng)歸Aralia cordata Thunb.的干燥根莖及根莖，是商品九眼獨(dú)活的主流品種，也是一種藥食兩用的傳統(tǒng)中藥[1]，食用土當(dāng)歸主要分布于長江流域及南山區(qū)。最早收載于《本草綱目》[2]。具有祛風(fēng)活血、解熱鎮(zhèn)痛、疏風(fēng)補(bǔ)虛、利尿消腫之功效，主要用于治療風(fēng)濕痹痛、腰膝酸軟、頭痛目眩等證[3]。研究表明[4,5]食用土當(dāng)歸含有皂苷、揮發(fā)油、有機(jī)酸等多種化學(xué)成分，其中有機(jī)酸主要成分貝殼杉烯酸和海松酸，具有較好的抗炎鎮(zhèn)痛作用[6～8]。然而，未見對(duì)食用土當(dāng)歸有機(jī)酸成分抑菌性研究報(bào)道。因此，本研究在課題組前期研究基礎(chǔ)上探討食用土當(dāng)歸有機(jī)酸成分的抑菌性。

1 材料

1.1 試驗(yàn)藥物

食用土當(dāng)歸藥材，購自四川省成都市荷花池中藥材市場(chǎng)，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)蔣桂華教授鑒定為五加科楤木屬植物食用土當(dāng)歸Aralia cordata Thund的干燥根莖及根。

食用土當(dāng)歸中貝殼杉烯酸，海松酸，總有機(jī)酸，均由成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院彭騰教授實(shí)驗(yàn)室提供，DMSO助溶，備用。

1.2 菌株

大腸埃希菌標(biāo)準(zhǔn)株ATCC25922一株；金色葡萄球菌ATCC25923一株；陰溝腸桿菌2012-12一株；肺炎克雷伯菌2016-1一株；表皮葡萄球菌2016-2一株；銅綠假單胞菌PAO1一株（除標(biāo)準(zhǔn)株外，其余細(xì)菌均為三級(jí)甲等醫(yī)院住院患者的病理標(biāo)本中分離獲得的臨床分離株，已由病理科鑒定純化）。

2 方法

2.1 貝殼杉烯酸，海松酸，總有機(jī)酸的制備

食用土當(dāng)歸粗粉，8倍量95%乙醇加熱回流提取2次，每次1 h，過濾，合并濾液，減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至干，得到乙醇提取物；將乙醇提取物經(jīng)硅膠柱層析法，以石油醚-乙酸乙酯為洗脫劑梯度洗脫，減壓回收洗脫劑，再經(jīng)反復(fù)重結(jié)晶，最終得到白色粉末狀總有機(jī)酸，酸堿滴定法測(cè)得總有機(jī)酸含量為96%，取部分總有機(jī)酸經(jīng)制備得到貝殼杉烯酸和海松酸（HPLC純度均＞98%）。

2.2 菌株培養(yǎng)

將原始菌種接種于MH-A無菌固體培養(yǎng)基（15 mL于直徑9 cm培養(yǎng)皿）復(fù)蘇和純化，培養(yǎng)條件為37℃培養(yǎng)24 h；取24 h純培養(yǎng)物再次接種于MH-A無菌固體培養(yǎng)基（15 mL于直徑9 cm培養(yǎng)皿）上，傳代培養(yǎng)24 h，檢查為純培養(yǎng)物后，備用。

2.3 抑菌活性檢測(cè)

2.3.1 供試品倍比濃度制備 取5個(gè)無菌凍存管，編號(hào)1號(hào)（原濃度）和2-5，分別配100%、50%、25%、12.5%、6.25%濃度藥物：在1號(hào)管注入2 mL DMSO+100 mg供試品藥物，吹打混勻后備用；2號(hào)管注入1 mL 1號(hào)管供試品藥物+1 mL DMSO，吹打混勻后備用；3號(hào)管注入1 mL 2號(hào)管供試品藥物+1mL DMSO，吹打混勻后備用；4號(hào)管注入1mL 3號(hào)管供試品藥物+1 mLDMSO，吹打混勻后備用；5號(hào)注入1 mL 4號(hào)管供試品藥物+1 mL DMSO，吹打混勻后備用，分別對(duì)5管混合液體用移液槍打均勻，備用。

2.3.2 抑菌圈檢測(cè) 選取已經(jīng)傳代培養(yǎng)24 h 的大腸埃希菌標(biāo)準(zhǔn)株ATCC25922、金色葡萄球菌ATCC25923、陰溝腸桿菌2012-12、肺炎克雷伯菌2016-1、表皮葡萄球菌2016-2、銅綠假單胞菌PAO1分別取適量于2 mL無菌生理鹽水中，調(diào)整菌液濃度為0.5 McFarland (1.5×108CFU﹒mL-1)后，再分別吸取200 μL菌液到2 mL無菌生理鹽水中，用槍頭打勻（菌液中濃度為1.5×107 CFU﹒mL-1）。

分別取6只無菌棉簽于稀釋的菌液中，蘸取適量菌液，再分別在6個(gè)相同MH-A無菌培養(yǎng)基上涂抹均勻（大約2 min，待菌液稍干）；在提前標(biāo)號(hào)1號(hào)和2-5編號(hào)的點(diǎn)上，用無菌鑷子放上無菌牛筋管，再在1號(hào)和2-5號(hào)無菌牛津管里分別加入200 μL的對(duì)應(yīng)1號(hào)和2-5號(hào)倍比濃度藥物，蓋上培養(yǎng)皿蓋，放于孵箱孵育，孵育條件37 ℃培養(yǎng)24 h；從孵箱中取出已培養(yǎng)24 h的培養(yǎng)皿，取下牛津管，正面拍照，再分別記錄下各抑菌圈的最大直徑。

3 結(jié)果

貝殼杉烯酸、海松酸、總有機(jī)酸對(duì)6種不同種細(xì)菌的抑制作用見下圖1-圖6。由下圖可知：貝殼杉烯酸、海松酸、總有機(jī)酸對(duì)6種細(xì)菌均表現(xiàn)出一定的抑制作用；銅綠假單胞菌中抑菌圈直徑大于大腸埃希菌、金色葡萄球菌、陰溝腸桿菌、肺炎克雷伯菌和表皮葡萄球菌抑菌圈的直徑，說明對(duì)銅綠假單胞菌的抑菌性更明顯。

3.1 食用土當(dāng)歸有機(jī)酸成分對(duì)大腸埃希菌的抑制作用

圖1 食用土當(dāng)歸有機(jī)酸成分對(duì)大腸埃希菌標(biāo)準(zhǔn)株的抑制效果

3.2 食用土當(dāng)歸有機(jī)酸成分對(duì)金色葡萄球菌的抑制作用

圖2 食用土當(dāng)歸有機(jī)酸成分對(duì)金色葡萄球菌的抑制效果

3.3 食用土當(dāng)歸有機(jī)酸成分對(duì)陰溝腸桿菌的抑制作用

圖3 食用土當(dāng)歸有機(jī)酸成分對(duì)陰溝腸桿菌的抑制效果

3.4 食用土當(dāng)歸有機(jī)酸成分對(duì)肺炎克雷伯菌的抑制作用

圖4 食用土當(dāng)歸有機(jī)酸成分對(duì)肺炎克雷伯菌的抑制效果

3.5 食用土當(dāng)歸有機(jī)酸成分對(duì)表皮葡萄球菌的抑制作用

圖5 食用土當(dāng)歸有機(jī)酸成分對(duì)表皮葡萄球菌的抑制效果

3.6 食用土當(dāng)歸有機(jī)酸成分對(duì)銅綠假單胞菌的抑制作用

圖6 食用土當(dāng)歸有機(jī)酸成分對(duì)銅綠假單胞菌的抑制效果

4 討論

病菌感染與人類疾病密切相關(guān)。隨著化學(xué)藥抗生素的廣泛使用，細(xì)菌耐藥性已成為全球化的問題了，濫用抗生素容易產(chǎn)生交叉耐藥性，加之耐藥性的不斷增強(qiáng)，近幾年來陸續(xù)出現(xiàn)了耐藥性極強(qiáng)的“超級(jí)細(xì)菌”，“多藥耐藥菌”等。細(xì)菌耐藥是伴隨著抗生素存在的，耐藥性一旦產(chǎn)生，耐藥菌不但可通過基因傳遞給子代同時(shí)還會(huì)傳遞給其他細(xì)菌[9]。細(xì)菌耐藥性對(duì)人類的危害愈發(fā)嚴(yán)重，且有不可抑制的趨勢(shì)。

在抗生素耐藥性凸顯的今天，人們把更多的目光投向了來源廣泛、安全性高、毒副作用小、抗耐藥機(jī)制神秘的中藥，希望加強(qiáng)對(duì)中藥抗菌有效成分的研究[10]，能從中找到解決耐藥性問題的新成分，故研究從傳統(tǒng)中藥中尋找抑菌和抗耐藥性的成分，已成為藥學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。

本研究采用牛津杯法從藥食兩用的傳統(tǒng)中藥食用土當(dāng)歸中提取貝殼杉烯酸、海松酸、總有機(jī)酸探討其對(duì)6種臨床常見耐藥菌株大腸埃希菌標(biāo)準(zhǔn)株ATCC25922、金色葡萄球菌ATCC25923、陰溝腸桿菌2012-12、肺炎克雷伯菌2016-1、表皮葡萄球菌2016-2、銅綠假單胞菌PAO1的抑菌效應(yīng)。研究結(jié)果表明：食用土當(dāng)歸的有機(jī)酸成分對(duì)大腸埃希菌、金色葡萄球菌、陰溝腸桿菌、肺炎克雷伯菌、表皮葡萄球菌、銅綠假單胞菌均具有一定的抑制作用，其中尤其對(duì)銅綠假單胞菌的抑制作用最強(qiáng)。實(shí)驗(yàn)為初步研究結(jié)果，對(duì)各病原菌的最低抑菌濃度( MIC) 和最低殺菌濃度( MBC)的測(cè)定還需進(jìn)一步深入。

銅綠假單胞菌是一種以呼吸道為主的醫(yī)院感染常見的重要病原菌之一，報(bào)道稱[11]近年來其耐多藥菌檢出率逐漸增高，為了預(yù)防和控制銅綠假單胞菌感染的發(fā)生，在對(duì)其耐藥性監(jiān)測(cè)的同時(shí)也應(yīng)加強(qiáng)對(duì)環(huán)境的整體嚴(yán)格消毒以及對(duì)個(gè)體的有效護(hù)理；食用土當(dāng)歸中的有機(jī)酸成分對(duì)銅綠假單胞菌顯著的抑菌能力表明其將不僅在臨床感染疾病的治療方面發(fā)揮優(yōu)勢(shì)，而且在殺菌消毒產(chǎn)品方面有一定的研發(fā)價(jià)值。