劉小玉，余鳳玉，付登強，楊偉波，賈效成，陳良秋

（中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院椰子研究所/油茶研究中心，海南文昌571339）

油茶為我國所特有，與油橄欖、油棕、椰子并稱為世界四大木本油料樹種，在我國已有2300多年的栽培歷史。它適應(yīng)性廣，主要生長在南方，以湖南、江西、廣西、海南等地為主。油茶炭疽病在我國油茶產(chǎn)區(qū)普遍發(fā)生，常引起嚴重落果、落蕾、落葉、枯枝，甚至整株衰亡[1]。病害落果率通常在20%～40%，嚴重時達60%以上。晚期病果雖可采收，但種子含油量僅為健康種子的一半，損失嚴重[2]。加強對油茶炭疽病的研究力度，提高油茶炭疽病的診斷和防治技術(shù)，是油茶生產(chǎn)的當務(wù)之急。因此，本文通過組織分離法對油茶炭疽病的病原菌進行分離、培養(yǎng)及致病性檢測，并通過形態(tài)學(xué)和序列分析的方法進行鑒定，旨在明確其種類，為防治該病菌奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與培養(yǎng)基

1.1.1 試驗材料

采于中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院油茶研究中心油茶種質(zhì)資源圃的感染炭疽病的病油茶葉片。

1.1.2 PDA培養(yǎng)基

去皮馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g。

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分離

采用常規(guī)組織分離法分離病原菌[3]。切取病健交界處小塊病變組織（5 mm×5 mm），經(jīng)70%乙醇消毒30 s，再用0.1%升汞浸泡1 min，后用無菌水漂洗3次，晾干移至PDA平板培養(yǎng)基上，置于25℃恒溫培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)。待長出菌絲后挑取菌落邊緣菌絲接種至新PDA平板上進行純化，再轉(zhuǎn)接到試管斜面上培養(yǎng)4 d，放入4℃冰箱保存。

1.2.2 致病性檢測

按照柯赫氏法則進行致病性檢測。從分離病原菌的油茶植株上，選取健康嫩葉，用自來水沖洗干凈，2%次氯酸鈉表面消毒2 min，然后無菌水清洗3次，無菌濾紙吸干表面水分，放置于無菌高濕的培養(yǎng)皿中。將純化保存的病原菌活化，接種至PDA培養(yǎng)基上，25℃黑暗條件下培養(yǎng)3～5 d，用無菌打孔器在菌落邊緣切取5 mm的菌絲塊，放置于培養(yǎng)皿中的油茶葉片洞口處。設(shè)空白PDA培養(yǎng)基為對照，重復(fù)3次。蓋上蓋子，放置于25℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，3 d后觀察發(fā)病情況。發(fā)病后從病斑上再分離病原菌，檢測是否與接種菌株相同。

1.2.3 病原菌形態(tài)學(xué)觀察

將純化后的病原菌接種到PDA培養(yǎng)基平板上，在25℃恒溫培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)，定期觀察記錄菌落形態(tài)學(xué)特征，并對病原菌分生孢子和厚垣孢子進行顯微形態(tài)觀測。

1.2.4 DNA提取、PCR擴增及序列測定

將分離菌株在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)5～7 d后，收集新鮮的濕菌體0.1～0.3 g，用液氮在研缽中磨碎，裝入1.5 mL的離心管中，然后用基因組DNA快速提取試劑盒（真菌）提取DNA。

PCR擴增所用引物為ITS區(qū)通用引物ITS1和ITS4。PCR反應(yīng)總體積為25 μL，包括10×PCR buffer（含Mg2+）2.5 μL，ITS1 和 ITS4 各 1 μL，dNTP Mix 0.5 μL，Taq DNA polymerase 0.5 μL，模板 DNA 2 μL，ddH2O 17.5 μL。PCR 反應(yīng)程序為：95℃預(yù)變性 3 min；95℃變性 30 s，55 ℃復(fù)性 30 s，72 ℃延伸 2 min，35個循環(huán)；最后72℃延伸10 min。取5 μLPCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，在紫外燈下觀察、并拍照保存。將PCR產(chǎn)物送至北京六合華大基因科技股份有限公司進行測序。將該序列通過Blast程序與GenBank中核酸數(shù)據(jù)進行比對分析，采用BioEdit、Mega5.0等軟件對菌株進行系統(tǒng)發(fā)育分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 油茶炭疽病癥狀

油茶葉片感染膠孢炭疽病菌后，病斑多從葉緣或葉尖處發(fā)生，呈半圓形或不規(guī)則形，黑褐色，具水漬狀輪紋，邊緣紫紅色。老病斑中心灰白色，內(nèi)有輪生小黑點，使病斑呈波紋狀，如圖1所示。

圖1 油茶炭疽病病癥Fig.1 Anthracnose disease of Camellia oleifera

2.2 致病性測定結(jié)果

致病性檢測發(fā)現(xiàn)菌株7-2能引起健康油茶葉片發(fā)病，對照組未見發(fā)病。第4 d起已出現(xiàn)褐色病斑，隨后病斑上產(chǎn)生白色菌絲。隨著時間推移，病斑逐漸擴大，乃至蔓延到整個葉片。從這些病斑上再次分離病原菌，發(fā)現(xiàn)所獲得的分離物與接種菌一致，表明所分離的菌株為引起油茶炭疽病的病原菌。

2.3 病原菌的分離結(jié)果與形態(tài)特征

采用常規(guī)組織塊法分離得到菌株，編號為7-2，保存于中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院油茶研究中心。菌株7-2在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)后，菌落為圓形并呈等徑輻射生長，無褶皺，邊緣整齊，菌絲初期為白色，后逐漸變?yōu)榛液谏?，氣生菌絲生長旺盛，由白色變成灰白色，再漸變?yōu)樯罨疑鯛睿ㄒ妶D2）。分生孢子單孢，無色，圓柱形或圓筒形，兩頭鈍圓，中間略凹，兩端不對稱，大小為(5.18～8.29)μm×(9.47～19.37)μm。這些形態(tài)特征與膠孢炭疽菌形態(tài)特征相符[4,5]。因此，初步確認菌株7-2為膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）。

圖2 膠孢炭疽菌病原菌菌落Fig.2 Pathogenic bacteriacolony of Colletotrichum gloeosporioides

2.4 病原菌基因序列分析

經(jīng)rDNA ITS1和ITS4引物對菌株7-2進行PCR擴增，獲得一條長度為577 bp大小的片段。將該序列與GenBank中核酸數(shù)據(jù)庫（http://ncbi.nlm.nih.gov/blast）進行同源性比較，發(fā)現(xiàn)菌株7-2序列與GenBank（序列登錄號：MH265979.1、MF800896.1）庫中登錄的膠孢炭疽菌的序列完全一致，同源性為100%，因此可以確定菌株7-2為膠孢炭疽菌。

3 結(jié)論

本研究通過形態(tài)學(xué)、分子生物學(xué)及致病性檢測，證明了引起油茶炭疽病的病原菌為膠孢炭疽菌。膠孢炭疽病菌是世界上最重要的致病菌之一，至少能夠侵染1000多種植物，主要危害寄主植物的葉片和果實，也可危害枝梢，引起葉斑、落葉、果實腐爛和枝梢枯死[6]。油茶果實被害初期在果皮上出現(xiàn)褐色小斑，逐漸擴大為黑色圓形病斑，有時數(shù)個病斑連接成不規(guī)則形，無明顯邊緣，后期病斑上出現(xiàn)輪生的小黑點。嫩葉受害時，病斑多從葉緣或葉尖處發(fā)生，呈半圓形或不規(guī)則形，黑褐色，具水漬狀輪紋，邊緣紫紅色。老病斑中心灰白色，內(nèi)有輪生小黑點，使病斑呈波紋狀。枝梢受害，多發(fā)生在新梢基部，少數(shù)在梢中部，橢圓形或梭形，初為黑褐色，后變成黑色?；ㄑ亢腿~芽受害變黑色或黃褐色，無明顯邊緣，后期呈灰白色，上生小黑點，嚴重時芽枯蕾落。另外，由于膠孢炭疽病菌寄主范圍非常廣泛，對大量的經(jīng)濟作物如芒果[7]、建蘭[8-10]、橡膠[11]、梨、草莓和柑橘等易造成嚴重危害?？梢姕蚀_鑒定膠孢炭疽病菌并有效防止該病害的發(fā)生、蔓延和危害，對促進我國種植業(yè)的安全生產(chǎn)，維護種植者利益，具有十分重要的現(xiàn)實意義。