劉宏，生書晶，蘇薇薇

(中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院∥廣東省中藥上市后質(zhì)量與藥效再評價工程技術(shù)研究中心，廣東 廣州 510275)

脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)所誘導(dǎo)的彌散性血管內(nèi)凝血(Disseminated intravascular coagulation，DIC)大鼠模型，其主要病理生理表現(xiàn)為血管內(nèi)廣泛微血栓形成、凝血功能障礙、微循環(huán)衰竭、微血管病性溶血等[1]。DIC早期主要是血小板活化、聚集而形成血小板血栓，繼而大量纖維蛋白沉積形成纖維蛋白血栓[2]。DIC后期由于廣泛微血栓的形成，造成腎、肺、心、肝、腦等全身重要臟器的嚴(yán)重功能發(fā)生障礙，甚至出現(xiàn)多臟器功能衰竭，危及生命。

前期工作中，我們已經(jīng)明確了復(fù)方血栓通膠囊在活血化瘀、氧化應(yīng)激、能量代謝等方面的作用[3-4]，預(yù)測并驗證了其抗血栓作用相關(guān)靶點及潛在通路[5]，弄清了其發(fā)揮作用的核心有效成分群[6]。由于復(fù)方血栓通膠囊成分復(fù)雜，其對機體肝腎組織是否會造成不良影響?這一問題很有研究的必要。本研究基于LPS誘導(dǎo)的DIC大鼠模型，重點探討復(fù)方血栓通膠囊對肝腎功能紊亂以及血栓沉積的影響，為其臨床合理用藥提供依據(jù)。

1 材 料

1.1 動物

健康成年SD大鼠72只，SPF級，雄性，體質(zhì)量150～200 g，由廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心提供，設(shè)施許可證號：SCXK(粵)2013-0002，實驗動物質(zhì)量合格證號：No.44007200001486。

1.2 藥品與試劑

復(fù)方血栓通膠囊(Compound Xueshuantong Capsule，CXC)，批號：141205，由廣東眾生藥業(yè)股份有限公司提供，實驗前取膠囊內(nèi)容物，用生理鹽水分別配制成38、76、152 mg/mL的低、中、高劑量藥液。低相對分子質(zhì)量肝素鈣注射液，批號：5157A，購于葛蘭素史克有限公司，實驗前量取0.1 mL，溶于2 mL生理鹽水中，配成500 IU/mL的溶液。復(fù)方丹參滴丸，批號：121207，購于天士力制藥集團有限公司，實驗前稱取12 g，溶于150 mL生理鹽水中，配成80 mg/mL的溶液。LPS：Echerichiacoli055:B5，購于Sigma公司，實驗前稱取LPS 60 mg，溶于30 mL生理鹽水中，配成2 mg/mL的溶液。水合氯醛，批號：20141210，購于國藥集團化學(xué)試劑有限公司；實驗前稱取0.3 g水合氯醛，用30 mL生理鹽水配成w=10%水合氯醛溶液。

1.3 儀器

羅氏P800全自動生化檢測儀，冷凍離心機(Eppendof，5430R)，輪轉(zhuǎn)式切片機(Leica，RMZ135)，光學(xué)顯微鏡(Olympus，DSX110)。

2 方 法

2.1 大鼠DIC模型的建立

分組及給藥：72只大鼠在適應(yīng)環(huán)境一周后，隨機分為 9 組，每組 8 只：空白對照組、LPS造模組、LPS+復(fù)方血栓通膠囊 380 mg/kg組(復(fù)方血栓通膠囊低劑量組)、LPS+復(fù)方血栓通膠囊 760 mg/kg組(復(fù)方血栓通膠囊中劑量組)、LPS+復(fù)方血栓通膠囊 1 520 mg/kg組(復(fù)方血栓通膠囊高劑量組)、LPS+肝素500 IU/kg 組、LPS+復(fù)方丹參滴丸800 mg/kg 組。各組大鼠每天給藥一次，LPS+肝素組大鼠尾靜脈注射給藥，其他各組大鼠灌胃給藥，連續(xù)給藥7 d，給藥量為10 mL/kg?？瞻讓φ战M、LPS模型組給予同體積生理鹽水。

DIC模型的建立：大鼠實驗前禁食過夜，自由攝水。實驗當(dāng)天清晨，各組大鼠(除空白組外)給藥1 h后，尾靜脈注射4 mg/kg的LPS建立大鼠DIC模型，空白組大鼠尾靜脈注射同體積的生理鹽水。各組大鼠在LPS注射4 h后每100 g體質(zhì)量腹腔注射w=10%水合氯醛0.35 mL麻醉，下腔靜脈采血并分離血清。

2.2 生化指標(biāo)檢測

大鼠麻醉后，下腔靜脈取血并分離血清(3 500 r/min，10 min，4 ℃)，取1 000 μL采用羅氏P800全自動生化儀檢測天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(Aspartic transaminase，AST)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(Alanine aminotransferase，ALT)、尿素氮(Urea nitrogen，UN)、肌酐(Creatinine，CR)。

2.3 組織病理觀察

大鼠采血后立即取腎、肝、腸系膜組織并用φ=10%甲醛固定，24 h后經(jīng)流水洗滌、梯度φ為70%、80%、90%、95%和無水酒精脫水、二甲苯透明、石蠟包埋，輪轉(zhuǎn)式切片機制備4 μm切片，進行蘇木精伊紅(Hematoxylin-Eosin，HE)染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察肝腎組織的微血管中纖維蛋白微血栓形成狀況。

3 結(jié) 果

3.1 復(fù)方血栓通膠囊對肝臟生化指標(biāo)的影響

ALT、AST主要分布在肝細(xì)胞內(nèi)，其異常升高與肝細(xì)胞受損相關(guān)。由表1及圖1可知，模型組ALT和AST顯著升高，說明LPS導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷。各給藥組都能夠顯著抑制ALT和AST的升高，說明其可以抑制LPS引起的肝損傷。其中，復(fù)方血栓通膠囊呈現(xiàn)出劑量依賴效應(yīng)，其高劑量效果優(yōu)于復(fù)方丹參滴丸。肝臟是機體合成多種凝血因子的重要場所，其功能的紊亂會直接影響凝血纖溶系統(tǒng)的平衡。復(fù)方血栓通膠囊能夠顯著改善肝臟損傷，其對肝臟的保護作用，可間接解釋其抗血栓作用。

表1 大鼠血漿中ALT、AST的水平1)Table 1 ALT、AST levels in rat plasma

1)與空白組相比：#P<0.05及##P<0.01；與模型組相比：*P<0.05及**P<0.01。

1)Compared with control group:#P<0.05 and##P<0.01; Compared with model group:*P<0.05 and**P<0.01。

圖1 復(fù)方血栓通膠囊對DIC大鼠血漿中ALT、AST的影響Fig.1 The effects of CXC on plasma ALT and AST levels in DIC rats1：空白組；2：模型組；3：LPS+CXC (380 mg/kg)；4：LPS+CXC (760 mg/kg)；5：LPS+CXC (1 520 mg/kg)；6：LPS+肝素(500 IU /kg)；7：LPS+復(fù)方丹參滴丸 (800 mg/kg)；與空白組相比：#P<0.05及##P<0.01；與模型組相比：*P<0.05及**P<0.011：Control group; 2: Model group; 3: LPS+CXC (380 mg/kg); 4: LPS+CXC (760 mg/kg); 5: LPS+CXC (1 520 mg/kg); 6: LPS+Heparin (500 IU/kg); 7: LPS+Compound Danshen Dripping Pills (800 mg/kg); Compared with control group: #P<0.05 and ##P<0.01; Compared with model group: *P<0.05 and **P<0.01

3.2 復(fù)方血栓通膠囊對腎臟生化指標(biāo)的影響

血清中CR、UN含量可反映腎臟功能，其異常升高表征著腎臟清除廢物能力的紊亂。由表2及圖2可知，模型組CR、UN含量都顯著提高，說明LPS導(dǎo)致腎臟功能損傷。各給藥組都能夠顯著抑制CR、UN升高，表明其對腎臟損傷均具有改善作用。其中，復(fù)方血栓通膠囊的高劑量組效果最好，

優(yōu)于陽性藥肝素和復(fù)方丹參滴丸。DIC模型微血栓形成后，纖維蛋白降解產(chǎn)物增多，腎臟工作負(fù)荷加重，極易形成大量的微血栓沉積。復(fù)方血栓通膠囊能夠有效改善腎臟功能紊亂，從而高效排出體內(nèi)過量的代謝產(chǎn)物。

圖2 復(fù)方血栓通膠囊對DIC大鼠血漿中UN、CR的影響Fig.2 The effects of CXC on plasma UN and CR levels in DIC rats1：空白組；2：模型組；3：LPS+CXC (380 mg/kg)；4：LPS+CXC (760 mg/kg)；5：LPS+CXC (1 520 mg/kg)；6：LPS+肝素(500 IU /kg)；7：LPS+復(fù)方丹參滴丸 (800 mg/kg)；與空白組相比：#P<0.05及##P<0.01；與模型組相比：*P<0.05及**P<0.011：Control group; 2: Model group; 3: LPS+CXC (380 mg/kg); 4: LPS+CXC (760 mg/kg); 5: LPS+CXC (1 520 mg/kg); 6: LPS+Heparin (500 IU /kg); 7: LPS+Compound Danshen Dripping Pills (800 mg/kg); Compared with control group: #P<0.05 and ##P<0.01; Compared with model group: *P<0.05 and **P<0.01

3.3 復(fù)方血栓通膠囊對肝臟組織病理的影響

由圖3所示，空白組大鼠肝細(xì)胞以中央靜脈為中心，向四周呈放射狀排列，形成規(guī)則的肝細(xì)胞索狀結(jié)構(gòu)。模型組大鼠經(jīng)尾靜脈注射LPS 4 h后，中央靜脈有明顯的淤血；肝細(xì)胞索間空隙有明顯的擴張充血，伴隨炎性細(xì)胞浸潤；肝細(xì)胞出現(xiàn)水腫，并有部分壞死現(xiàn)象。陽性藥肝素能夠顯著改善DIC大鼠的肝臟病理，肝細(xì)胞索排列規(guī)則，雖有少量炎性細(xì)胞浸潤，但無明顯的淤血和出血現(xiàn)象。復(fù)方丹參滴丸組大鼠血管內(nèi)無明顯淤血，但有明顯的出血和炎性細(xì)胞浸潤。復(fù)方血栓通膠囊低、中、高劑量組大鼠血管內(nèi)都無明顯的淤血，且高劑量下效果最佳。復(fù)方血栓通膠囊低劑量組大鼠有明顯的出血和炎性細(xì)胞浸潤，中劑量組大鼠癥狀減輕，而高劑量組大鼠無明顯的出血，且肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)排列整齊，其效果優(yōu)于復(fù)方丹參滴丸，與肝素相當(dāng)。上述結(jié)果表明復(fù)方血栓通膠囊對DIC大鼠的肝臟病理具有顯著的改善作用。

表2 大鼠血漿中UN、CR的水平1)Table 2 UN and CR levels in rat plasma

1)與空白組相比：#P<0.05及##P<0.01；與模型組相比：*P<0.05及**P<0.01。

1)Compared with control group:#P<0.05 and##P<0.01; Compared with model group:*P<0.05 and**P<0.01。

圖3 大鼠肝臟組織病理HE染色分析Fig.3 HE staining results of rats liver sectionsa：空白組；b：模型組；c：LPS+肝素(500 IU /kg)；d：LPS+CXC (380 mg/kg)；e：LPS+CXC (760 mg/kg)；f：LPS+CXC (1 520 mg/kg)；g：LPS+復(fù)方丹參滴丸 (800 mg/kg)a: Control group; b: Model group; c: LPS+Heparin (500 IU /kg); d: LPS+CXC (380 mg/kg); e: LPS+CXC (760 mg/kg); f: LPS+CXC (1 520 mg/kg); g: LPS+Compound Danshen Dripping Pills (800 mg/kg)

3.4 復(fù)方血栓通膠囊對腎臟組織病理的影響

由圖4可以看出，空白組大鼠腎小球結(jié)構(gòu)清晰，腎小管結(jié)構(gòu)正常、排列整齊，未見擴張及萎縮。模型組大鼠經(jīng)尾靜脈注射LPS 4 h后，腎小球可見明顯的血栓形成，部分腎小管擴張，且有明顯的出血現(xiàn)象。陽性藥肝素組大鼠雖有部分腎小管擴張，但腎小球內(nèi)未見明顯的淤血和出血。復(fù)方丹參滴丸對血栓形成有抑制作用，腎小球內(nèi)未見血栓，但存在明顯的出血現(xiàn)象。復(fù)方血栓通膠囊低劑量組大鼠有少量血栓存在，且有明顯出血；中劑量組大鼠雖有少量出血，但無明顯的血栓形成；高劑量組大鼠未見明顯的血栓和出血現(xiàn)象。復(fù)方血栓通膠囊中劑量整體效果與復(fù)方丹參滴丸相當(dāng)。上述結(jié)果表明，復(fù)方血栓通膠囊對于腎臟的血栓形成具有抑制作用，從而改善腎臟功能。

圖4 大鼠腎臟組織病理HE染色分析Fig.4 HE staining results of rats kidney sectionsa：空白組；b：模型組；c：LPS+肝素(500 IU /kg)；d：LPS+CXC (380 mg/kg)；e：LPS+CXC (760 mg/kg)；f：LPS+CXC (1520 mg/kg)；g：LPS+復(fù)方丹參滴丸 (800 mg/kg)a: Control group; b: Model group; c: LPS+Heparin (500 IU /kg); d: LPS+CXC (380 mg/kg); e: LPS+CXC (760 mg/kg); f: LPS+CXC (1 520 mg/kg); g: LPS+Compound Danshen Dripping Pills (800 mg/kg)

4 討 論

肝臟是人體內(nèi)多種凝血因子生成的主要場所，在13種凝血因子中，纖維蛋白原、凝血酶原、凝血因子Ⅱ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ均在在肝臟內(nèi)合成[7]。正常的肝細(xì)胞還能夠合成抗凝物質(zhì)，并清除激活的凝血因子和纖溶物質(zhì)。因此，肝臟在凝血和抗凝血的平衡中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。LPS誘導(dǎo)的DIC模型中，肝臟的清除功能發(fā)生障礙，導(dǎo)致活化的凝血因子上升、部分促凝物質(zhì)上升、血清纖維蛋白降解產(chǎn)物濃度上升，從而形成了廣泛的微血栓。在DIC模型后期，肝臟功能嚴(yán)重受損，凝血因子合成減少或合成的凝血因子異常，纖溶酶原與纖溶酶原激活物的抑制物合成減少，再加之機體凝血因子的大量消耗，極易導(dǎo)致出血的發(fā)生。本研究中，復(fù)方血栓通膠囊給藥后，血清轉(zhuǎn)氨酶ALT 、AST顯著降低，肝細(xì)胞損傷得到抑制，同時可觀察到肝臟組織中血栓的形成、出血以及炎性細(xì)胞的浸潤明顯減少，明確了其對DIC模型大鼠的肝臟保護作用。

腎臟是人體的重要器官，其主要功能是排出體內(nèi)多余的水分和廢物。DIC模型后期，機體會出現(xiàn)多臟器功能受損，其中腎臟最易受累[8]，這是由于廣泛微血栓形成后，纖溶系統(tǒng)異常激活，纖維蛋白降解產(chǎn)物等增多，而這些代謝產(chǎn)物絕大部分通過腎小球濾過、腎小管分泌排出體外，因此造成了腎小球部位大量微血栓的沉積，最終導(dǎo)致腎臟功能嚴(yán)重受損。本研究中，復(fù)方血栓通膠囊給藥后，血清CR、UN顯著下降，腎臟的排泄功能得到改善，同時可觀察到腎臟組織中未出現(xiàn)明顯的瘀血現(xiàn)象，明確了其對DIC模型大鼠的腎臟保護作用。

中藥的有效性、安全性是開展上市后質(zhì)量與藥效再評價工作的關(guān)鍵，二者同等重要、缺一不可。前期工作中，我們明確了復(fù)方血栓通膠囊的作用特點、靶點及潛在通路，找出了與其關(guān)聯(lián)的核心活性成分群，驗證了其有效性。本研究在此基礎(chǔ)上，進一步考察復(fù)方血栓通膠囊對肝腎等器官的損傷以及血栓沉積的影響，明確了其對肝腎功能具有保護作用，為其臨床用藥的安全性提供了依據(jù)。