黃 瑤，蔣 琳，劉 影，劉 露，侯怡鈴，丁 祥

(1. 西華師范大學 生命科學學院 西南野生動植物資源保護教育部重點實驗室，四川 南充 637009；2. 西華師范大學 環(huán)境科學與工程學院，四川 南充 637009)

羊肚菌(Morehellaesculenta)隸屬于子囊菌亞門(Ascomycotina)盤菌綱(Discomycetes)盤菌目(Pezizales)羊肚菌科(Morchellaceae)羊肚菌屬(Morchella)，因其酷似羊肚，從而得名羊肚菌[1]。野生羊肚菌，子實體個頭中等或偏小，菌蓋橢圓形且表面類似蜂窩狀，頂端鈍圓，菌柄近白色，味道鮮美，是很好的食用和藥用真菌[2-3]。

真菌多糖主要是從真菌的子實體、菌絲體等中提取出來的一種生物多糖，在抗菌、抗腫瘤等方面有重要作用[4]。真菌多糖結構對其活性的影響很大，通常多糖活性好的，其結構相對復雜[5]。目前對于羊肚菌多糖的研究集中在抗腫瘤和抗氧化兩方面[6-9]，但對羊肚菌多糖免疫方面的活性報道甚少，因此，本研究主要集中在探究羊肚菌多糖對免疫細胞的活性影響，對后續(xù)羊肚菌多糖的免疫調節(jié)通路提供理論基礎。

本實驗中，筆者以四川省小金縣的野生羊肚菌為研究材料，采用熱水浸提法、DEAE-纖維素層析法得到羊肚菌多糖，通過高效凝膠滲透色譜(HPGPC)和傅里葉紅外光譜技術(FT-IR)對多糖的結構進行鑒定，并對羊肚菌多糖的免疫調節(jié)能力初步探究，以期為羊肚菌的藥用價值研究提供一定的理論支撐。

1 材料和方法

1.1 研究材料

1.1.1 實驗材料

羊肚菌子實體，由西華師范大學生命科學學院西南野生動植物資源保護教育部重點實驗室提供。

1.1.2 實驗儀器

DFT-150型高速萬能粉碎機，上海鼎廣機械設備有限公司；AR2130型電子天平、WBK-3B型電熱恒溫水浴鍋，上海奧豪斯儀器有限公司；Spring-K40型超純水儀，重慶艾科浦公司；KE-6000型旋轉蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；DHG-9140A型電熱鼓風干燥箱，上海一恒科學儀器有限公司；臺式低溫高速離心機，北京醫(yī)用離心機廠；Epoch 酶標儀，美國基因有限公司；CO2恒溫培養(yǎng)箱， Thermo 公司；SE-CJ-1F型超凈工作臺，蘇凈安泰空氣技術有限公司；96 孔微量培養(yǎng)板，上海凌初環(huán)保儀器有限公司；DMI 3000型倒置熒光顯微鏡，徠卡顯微系統(tǒng)(上海)貿易有限公司；HPGPC 220高效凝膠色譜儀，美國Aglient公司。

1.1.3 實驗藥品

本實驗涉及的實驗藥品均為分析純。無水乙醇(95%)，安徽安特生物化學有限公司；NaOH、HCl、濃H2SO4、苯酚和NaCl，四川生工科技有限公司；DEAE-纖維素，生興生物技術(南京)有限公司；CCK-8 細胞計數(shù)試劑盒(A cell counting kit)，上海碧云天生物技術研究所；磷酸鹽酸緩沖液(PBS)，自制；RPMI1640 培養(yǎng)基、0.5%Trypsin-EDTA，Gibco公司；胎牛血清、雙抗， Clark Bioscience ；小鼠巨噬細胞(RAW264.7)、淋巴細胞B、淋巴細胞T，中國科學院上海生命科學研究院生物化學與細胞生物學研究所。

1.2 方法

1.2.1 羊肚菌多糖的提取

稱取干燥后的羊肚菌子實體200.0 g，放于95%乙醇中浸泡24 h(除去多酚及少量的蛋白質等)，烘干備用。用粉碎機將烘干的羊肚菌子實體粉碎后，于裝有適量蒸餾水的90 ℃水浴鍋中煮6 h(不斷攪拌)，煮3次[10]；12 000 r/min離心后將上清液合并收集(約2 000 mL)，高溫濃縮至200 mL，加入4倍體積的無水乙醇[11]，用玻璃棒攪拌直到產生絮狀沉淀，再次12 000 r/min離心收集沉淀，干燥后得到羊肚菌粗多糖[12]。

1.2.2 羊肚菌多糖的分離純化

采用DEAE-纖維素柱層析法和透析法對羊肚菌粗多糖進一步分離純化[13-14]。將烘干后的羊肚菌粗多糖加入適量的蒸餾水使其充分溶解，約150 mL離心待用；電子天平稱取50.0 g DEAE cellulose 52色譜填料樹脂[15]，并將其活化待用；配制不同濃度的NaCl溶液(0、 0.1、0.2、0.3、0.4和0.5 mol/L)作為洗脫液待用；配制0.5 mol/L的NaOH和0.5 mol/L的HCl溶液備用；將活化好的纖維素輕輕倒入玻璃柱中，靜置12 h讓纖維素自然沉淀。靜置完成后，沿壁緩緩加入5 mL多糖溶液，依次用不同濃度的洗脫液過柱，用試管收集洗脫液(每管10 mL)并用硫酸苯酚法檢測[16]，繪制洗脫曲線，合并含多糖的洗脫液濃縮后，用截留分子量為7 000的透析袋透析，濃縮干燥后得到的固體樣品即羊肚菌多糖，命名為ME-X。

1.2.3 ME-X分子量測定

參照文獻[17-18]采用HPGPC對ME-X純度進行鑒定，同時測定其分子量。精確稱取5.0 mg ME-X樣品，在1 mL重蒸水中充分溶解，超聲5 min，用HPGPC 220高效凝膠色譜儀進行測定，測得的數(shù)據(jù)用凝膠色譜(GPC)軟件進行分析。

1.2.4 ME-X的紅外光譜分析

采用KBr壓片法，稱取干燥的ME-X樣品5.0 mg于研缽，加入適量KBr粉末充分碾碎后壓片，在傅里葉紅外光譜儀(FT-IR)400～4 000 cm-1的范圍檢測[19]。

1.2.5 ME-X對淋巴細胞T和B及RAW264.7細胞的增殖作用

用CCK-8(cell counting kit)法檢測ME-X對淋巴細胞T和B及RAW264.7細胞的增殖效果[20-21]，選取對數(shù)生長期且狀態(tài)良好的細胞，將其細胞密度稀釋至1.0×105個/mL，接種到96孔培養(yǎng)板上，每孔100 μL細胞稀釋液，邊緣的孔加入200 μL PBS緩沖液，保持無菌水環(huán)境的同時可消除邊緣效應。在37 ℃、5%(體積分數(shù))CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，加入不同濃度的ME-X溶液[22-23](終質量濃度為1.25、5、10和20 μg/mL)，陽性對照組中每孔加入100 μL的脂多糖(LPS)溶液[24-25](終質量濃度為10 μg/mL)，空白對照組中則加入等體積的完全培養(yǎng)液。在恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，每孔加入CCK-8溶液5 μL放于培養(yǎng)箱孵育3 h后，拍照，并用酶標儀測定波長450 nm處吸光值(A450)[26]。將吸光值轉換為增殖率，并繪制以增殖率為縱坐標、ME-X濃度為橫坐標的曲線。按式(1)計算細胞增殖率。

(1)

式中：P為細胞增殖率，%；A1為空白對照組孔的平均吸光度值；A2為實驗組孔的平均吸光度值;實驗組即為陽性對照組和4個ME-X藥物組。

1.2.6 ME-X對RAW264.7細胞吞噬中性紅能力的影響

選取對數(shù)期的RAW264.7細胞，將其細胞密度稀釋至1.0×105個/mL，接種到96孔培養(yǎng)板上，每孔100 μL細胞稀釋液，邊緣的孔加入200 μL PBS緩沖液，保持無菌水環(huán)境的同時可消除邊緣效應。在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，加入不同濃度的ME-X溶液[22-23](終質量濃度為1.25、5、10和20 μg/mL)，陽性對照組中每孔加入100 μL的LPS溶液[24-25](終質量濃度為10 μg/mL)，空白對照組中則加入等體積的完全培養(yǎng)液。在恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，用移液槍移除上清液，每孔加入100 μL質量分數(shù)為0.075%中性紅溶液，恒溫培養(yǎng)箱中吞噬15 min。棄中性紅，并用200 μL預冷的PBS清洗3次，最后每孔加入100 μL細胞裂解液(乙醇與乙酸體積比為1∶ 1，現(xiàn)配現(xiàn)用)，在培養(yǎng)箱中37 ℃下裂解2 h，酶標儀檢測波長540 nm處吸光值A540，將吸光值轉換為吞噬率，并繪制以吞噬率為縱坐標、ME-X濃度為橫坐標的曲線[27]。按式(2)計算細胞吞噬率。

(2)

1.2.7 統(tǒng)計與分析

所有數(shù)據(jù)均用Mean±SD表示，用t-test檢驗差異的顯著性，與對照組對比顯著以*表示(P<0.05)，極顯著以**表示(P<0.01)。

2 結果與討論

2.1 羊肚菌多糖的提取及分離純化

200 g羊肚菌子實體采用熱水浸提法和醇沉法后得到粗多糖40 g，得糖率20%。采用DEAE cellulose-52色譜柱，用不同濃度的NaCl溶液作為流動洗脫相，洗脫曲線如圖1所示。由圖1可知：除0.1 mol/L NaCl洗脫時出現(xiàn)一個較大的洗脫峰外，其他洗脫液段均未出現(xiàn)洗脫峰，說明只有0.1 mol/L NaCl洗脫液含真菌多糖。收集所有0.1 mol/L NaCl段的多糖溶液，濃縮干燥后得到的固體樣品即羊肚菌多糖，命名為ME-X。

圖1 ME-X的DEAE cellulose-52色譜柱層析洗脫曲線Fig.1 Chromatogram of ME-X on a DEAE-cellulose 52 column

2.2 ME-X高效凝膠滲透色譜(HPGPC)結果

采用HPGPC對ME-X的純度進行鑒定，結果如圖2所示。由圖2可知，ME-X的HPGPC洗脫曲線中有1個較高對稱峰，且峰較高峰面積較寬，提示ME-X是一種比較純的生物多糖，其重均分子量(Mw)為16 348，數(shù)均分子量(Mn)為13 050；峰值分子量(MP)為16 348；Z均分子量(MZ)為1 089 260；Z+1均分子量(MZ+1)為2 166 652。

圖2 ME-X的HPGPC洗脫曲線Fig.2 Chromatogram of ME-X on HPGPC

2.3 ME-X的FT-IR分析

圖3 ME-X的紅外分析圖Fig.3 FT-IR spectra of ME-X

2.4 ME-X的免疫增殖作用

2.4.1 ME-X對淋巴細胞T增殖的影響

淋巴細胞T是由部分骨髓干細胞遷移至胸腺后分化成熟的，具有免疫活性的細胞，簡稱T細胞，主要參與機體的細胞免疫[30]。ME-X刺激后T細胞增殖效果如圖4所示。由圖4可知：與空白對照組相比，ME-X藥物組與脂多糖(LPS)陽性對照能顯著地促進T細胞增殖，并呈一定的劑量關系。當藥物質量濃度為1.25～10 μg/mL時，其增殖率和藥物濃度成正相關；當藥物質量濃度為10 μg/mL時，增殖率最高為31.18%，表明該濃度的ME-X對促進T淋巴細胞增殖效果最好；當藥物質量濃度在20 μg/mL時，其增殖率隨藥物濃度升高反而有所下降。

*表示P<0.05，**表示P<0.01，ME-X組、LPS組均與空白對照組比圖4 ME-X對T細胞增殖的影響Fig.4 Effects of ME-X on the proliferation of T cell

T細胞的增殖形態(tài)如圖5所示。隨著ME-X濃度的增大，細胞加速分裂，成團變大。在用10 μg/mL的ME-X刺激T細胞時，細胞成團最大且最多。

圖5 ME-X對T細胞形態(tài)的影響Fig.5 Effects of ME-X on the cell morphology of T cell

2.4.2 ME-X對淋巴細胞B增殖的影響

淋巴細胞B簡稱B細胞，來源于骨髓的多功能干細胞，能夠分泌抗體，是體液免疫的主要介質[31]。B細胞的增殖效果如圖6所示，陽性對照組為10 μg/mL的LPS，ME-X質量濃度為1.25、5、10和20 μg/mL。由圖6可知：與空白對照組相比，藥物組增殖效果均達到極顯著，當ME-X多糖質量濃度為1.25 μg/mL時，其增殖率達到49.60%；當ME-X多糖質量濃度為10 μg/mL時，其增殖率最高，達到63.02%。同時LPS陽性對照組與空白對照組相比，也具有極顯著的統(tǒng)計學意義，但其增殖效果比藥物組差很多，其增殖率僅19.62%。

B細胞增殖形態(tài)如圖7所示，正常狀態(tài)的B細胞呈圓形，懸浮并集簇生長，但成團細胞數(shù)較少；經ME-X刺激后，細胞增殖明顯加快，細胞數(shù)量顯著升高，且成團細胞又大又多。

圖7 ME-X對B細胞形態(tài)的影響Fig.7 Effects of ME-X on the cell morphology of B cell

*表示P<0.05，**表示P<0.01，ME-X組、LPS組均與空白對照組比圖6 ME-X對B細胞增殖的影響Fig.6 Effects of ME-X on the proliferation of B cell

2.4.3 ME-X的對巨噬細胞增殖的影響

巨噬細胞來源于血液中的單核細胞，是一種具有多種功能的免疫細胞，可參與機體先天性免疫和細胞免疫[32]。本實驗中，筆者采用CCK-8法檢測ME-X對巨噬細胞增殖的影響，結果如圖8所示。由圖8可知：當加藥(ME-X和LPS)刺激時，對巨噬細胞增殖效果為極顯著(P<0.01)；細胞增殖對藥物劑量具有一定依賴性，當ME-X質量濃度僅為1.25 μg/mL時，測得的增殖率達到51.44%；值得注意的是，ME-X質量濃度為20 μg/mL時，對巨噬細胞的增殖效果最佳，增殖率達63.12%。

*表示P<0.05，**表示P<0.01，ME-X組、LPS組均與空白對照組比圖8 ME-X對巨噬細胞增殖的影響Fig.8 Effects of ME-X on the proliferation of RAW264.7 cell

圖9 ME-X對RAW264.7細胞形態(tài)的影響Fig.9 Effects of ME-X on the cell morphology of RAW264.7 cell

ME-X刺激巨噬細胞增殖形態(tài)如圖9所示。由圖9可見：空白對照組細胞較少，幾乎為圓形，分散生長；在ME-X的刺激下，巨噬細胞快速增殖分裂，細胞體積變大，不同程度伸出偽足，細胞數(shù)量明顯增多。說明ME-X能顯著促進巨噬細胞增殖。

2.5 ME-X對巨噬細胞(RAW264.7)吞噬中性紅能力的影響

在ME-X刺激下，巨噬細胞吞噬中性紅的能力如圖10所示。由圖10可知：在低濃度ME-X和LPS作用下，RAW264.7細胞吞噬中性紅的能力顯著提高；隨著藥物濃度加大，吞噬效果顯著加強，并且和藥物濃度呈正相關；值得注意的是，當藥物質量濃度達到20 μg/mL時，吞噬率最大，為22.49%，表明該濃度下RAW264.7細胞吞噬中性紅的能力最強。

*表示P<0.05，**表示P<0.01，ME-X組、LPS組均與空白對照組比圖10 不同濃度的ME-X對RAW264.7 細胞吞噬中性紅的影響Fig.10 Effects of different concentration ME-X on neutral red phagocytosis of RAW264.7 cells

3 結論

國內對多糖的研究雖然開始比較晚，但隨著各項技術的發(fā)展和進步，對真菌多糖的提取、分離純化工藝的研究越來越成熟，為后續(xù)對多糖的結構鑒定、生物活性以及機制奠定了基礎。本研究以四川省小金縣野生羊肚菌為對象，用熱水浸提法，DEAE-cellulose column柱層析法等分離純化后得到多糖ME-X。分別用ME-X刺激T淋巴細胞、B淋巴細胞和RAW264.7細胞并探究其增殖效果，同時用中性紅法檢測巨噬細胞的吞噬能力，從而探究ME-X的免疫活性。

傅里葉紅外光譜和HPGPC結果顯示，ME-X含有多糖的特征峰，且其重均分子量為1.635×104；ME-X能顯著提高免疫細胞增殖，且對ME-X濃度具有一定的依賴性。當ME-X質量濃度為10 μg/mL時，淋巴細胞T、B的增殖效果最佳，增值率分別為31.18%、63.02%；當ME-X質量濃度為20 μg/mL時，巨噬細胞增殖效果最佳，增值率為63.12%，同時該濃度刺激巨噬細胞吞噬中性紅能力也最強，吞噬率為22.49%。

綜上，ME-X作為一類生物大分子，是一種很好的免疫調控資源。但是關于ME-XD具體化學結構及免疫調控作用的相關分子機制，還有待于進一步研究。