藍(lán)海軍，何美娟，羅晨曦，畢雙同

(1.江西贛糧實(shí)業(yè)有限公司 院士工作站，江西 南昌 330200；2.江西省兒童醫(yī)院 呼吸內(nèi)科，江西 南昌 330006)

龍牙百合(Liliumbrowniivar.viridulumBaker)是我國經(jīng)濟(jì)型食用百合中的優(yōu)良品種，因其個(gè)大、鱗片狹長且肥厚、狀若龍爪、色白若象牙，故名為“龍牙百合”[1]，以江西萬載、永豐和湖南隆回3地所產(chǎn)尤為知名[2]。龍牙百合主要可食用部分為地下鱗莖，其營養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值都很高，特別在呼吸道疾病的防治方面有積極效果，是我國首批藥食兩用植物之一。目前百合除被大量用作日常食用外，還可加工成百合粉、百合飲料、百合干、百合餅干和百合罐頭等[3]。

百合中含有豐富的多糖、多酚、黃酮和皂苷等活性成分[4-7]，其中百合多糖是百合的主要活性功能成分之一，研究發(fā)現(xiàn)其具有消炎、抗疲勞、抗抑郁、降血糖和抗氧化等作用[5-9]。劉成梅等[10]發(fā)現(xiàn)百合多糖對(duì)四氧嘧啶引起的高血糖小白鼠有明顯的降血糖功能；李化強(qiáng)等[5]發(fā)現(xiàn)龍牙百合粗多糖的清除能力強(qiáng)于精制多糖，但均弱于維生素C。

百合多糖的提取方式?jīng)Q定了其純度、結(jié)構(gòu)和活性，目前國內(nèi)外主要的提取方式有熱水浸提、微波輔助提取、超聲波輔助提取、酶法和酸堿法等。例如熊明郁等[11]用水提法提取百合多糖；張占軍等[12]用超聲輔助提取百合多糖；Zhao等[13]采用微波輔助提取百合多糖；高清雅等[14]用超聲波和酶協(xié)同作用提取百合多糖。這些方法各有優(yōu)缺點(diǎn)。熱水提取法成本低、操作簡單，但存在時(shí)間長、提取效率低的缺點(diǎn)。微波和超聲波法時(shí)間短、溶劑消耗量小、效率高，但須要專門設(shè)備，產(chǎn)業(yè)化成本和難度較高。酶法綠色、快速，但是酶制劑成本較高。高溫水提法具有快速、高效等優(yōu)點(diǎn)，但目前對(duì)其提取百合多糖的研究還較少。

因此，本研究以江西宜春市萬載縣龍牙百合為原料，采用響應(yīng)面法優(yōu)化高壓高溫水提法提取百合多糖的工藝，以期為龍牙百合的開發(fā)利用提供一定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

龍牙百合，購自江西萬載地區(qū)；濃H2SO4、苯酚和葡萄糖等均為分析純，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-2450型紫外分光光度計(jì)，日本島津儀器公司；BT224S型電子天平，北京賽多利斯儀器有限公司；TD型電子天平，余姚金諾天平儀器有限公司；HH-2型數(shù)顯恒溫水浴鍋，常州國華電器有限公司；RE52-A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；SN510C型立式壓力蒸氣滅菌鍋，重慶雅馬拓科技有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 多糖的提取方法

龍牙百合清洗干凈后，將其切成大小均勻的條狀。稱取10.0 g百合于250 mL錐形瓶中，按適當(dāng)?shù)牧弦罕燃尤胝麴s水，攪拌均勻，置于高壓滅菌鍋中，在一定條件下進(jìn)行提取，冷卻后，4 000 r/min離心15 min，抽濾取得濾液，將濾渣進(jìn)行重復(fù)提取，合并濾液，置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中濃縮定容至50 mL，得龍牙百合粗多糖溶液。

1.3.2 多糖提取得率的測定

參考熊明郁等[11]和張雪春等[15]的方法并稍作修改，精確移取1.0 mL粗多糖溶液，用蒸餾水稀釋至100 mL。從稀釋液中移取1.0 mL溶液加入干燥的帶塞試管內(nèi)，加入4.0 mL硫酸-苯酚溶液，輕微振蕩均勻，置于沸水浴中反應(yīng)30 min后迅速取出，用水冷卻至室溫，于波長490 nm處測定吸光值。同時(shí)以不同質(zhì)量濃度的葡萄糖溶液(0～100 μg/mL)代替樣品與硫酸-苯酚溶液反應(yīng)，繪制葡萄糖質(zhì)量濃度與吸光度值的標(biāo)準(zhǔn)曲線，并按式(1)計(jì)算多糖得率。

(1)

式中：V為提取液體積，mL；ρ為提取液中多糖質(zhì)量濃度，g/mL；N為稀釋倍數(shù)；m為樣品質(zhì)量，g。

1.3.3 單因素試驗(yàn)

1) 料液比對(duì)多糖得率的影響

固定提取溫度120 ℃，時(shí)間1 h，次數(shù)2次，選取料液比(g/mL)分別為1∶ 10、1∶ 15、1∶ 20、1∶ 25和1∶ 30進(jìn)行多糖提取，考察料液比對(duì)百合多糖得率的影響。

2) 提取溫度對(duì)多糖得率的影響

固定料液比(g/mL)為1∶ 20，時(shí)間1 h，次數(shù)2次，選取溫度分別為100、110、120、130和135 ℃進(jìn)行多糖提取，考察提取溫度對(duì)百合多糖得率的影響。

3) 提取時(shí)間對(duì)多糖得率的影響

固定料液比(g/mL)為1∶ 20，溫度120 ℃，次數(shù)2次，選取時(shí)間分別為30、60、90、120和150 min進(jìn)行多糖提取，考察提取時(shí)間對(duì)百合多糖得率的影響。

4) 提取次數(shù)對(duì)多糖得率的影響

固定料液比(g/mL)為1∶ 20，溫度120 ℃，時(shí)間1 h、選取提取次數(shù)分別為1、2、3、4和5次進(jìn)行多糖提取，考察提取次數(shù)對(duì)百合多糖得率的影響。

1.3.4 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取對(duì)百合多糖得率影響較大的因素，采用Design Expert 8.05b軟件進(jìn)行Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)，以百合多糖提取得率為響應(yīng)值，優(yōu)化后得最佳提取工藝。

2 結(jié)果與討論

2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

根據(jù)葡萄糖質(zhì)量濃度與測定的吸光度值繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。由圖1可知：蒽酮顯色后的吸光度值與葡萄糖質(zhì)量濃度呈線性關(guān)系，其回歸方程為Y=0.123 4+0.003 75X，R2=0.996，說明方程能較好地表示樣品的葡萄糖質(zhì)量濃度與吸光度之間的關(guān)系，可用于樣品的測定。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 The standard curve of glucose

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 料液比對(duì)多糖得率的影響分析

料液比對(duì)百合多糖得率影響的曲線見圖2。由圖2可知：百合多糖得率隨料液比增大而增大，在料液比(g/mL)為1∶ 20時(shí)，多糖得率為(6.21±0.04)%，此后繼續(xù)增大料液比，多糖得率增大趨勢不明顯。可能是因?yàn)榱弦罕?g/mL)在1∶ 20的條件下，百合組織中的多糖浸出已經(jīng)較為充分[16]。此后再增大料液比，雖然多糖得率有所提高，但是提高程度較低，從實(shí)驗(yàn)時(shí)間、操作方便性和成本考慮，選取料液比(g/mL)1∶ 20為最佳試驗(yàn)條件。

圖2 料液比對(duì)多糖得率的影響Fig.2 The effect of material-liquid ratio on the yield of polysaccharide

2.2.2 提取溫度對(duì)多糖得率的影響分析

提取溫度對(duì)百合多糖得率影響的曲線見圖3。由圖3可知：百合多糖得率隨溫度增大而呈現(xiàn)先增大后降低的趨勢，在提取溫度為120 ℃時(shí)，多糖得率最高為(6.20±0.09)%。原因是升高提取溫度，對(duì)百合細(xì)胞破壞程度較大，有助于多糖在體系中的溶出。但溫度過高，降低了百合表面的張力，增加了表面微氣泡的蒸氣壓，反而降低了多糖的溶出效果[12]，因此，選取提取溫度120 ℃為最佳試驗(yàn)條件。

圖3 提取溫度對(duì)多糖得率的影響Fig.3 The effect of extraction temperature on the yield of polysaccharide

2.2.3 提取時(shí)間對(duì)多糖得率的影響分析

提取時(shí)間對(duì)百合多糖得率影響的曲線見圖4。由圖4可知：隨提取時(shí)間的延長，百合多糖得率不斷上升，在90 min時(shí)多糖得率最大，達(dá)到(6.25±0.03)%，繼續(xù)延長提取時(shí)間，多糖得率反而緩慢下降。原因是提取一定時(shí)間后，百合細(xì)胞膜內(nèi)外的滲透濃度逐漸相等，多糖不再溶出，另外高溫提取時(shí)間過長，對(duì)多糖結(jié)構(gòu)可能有一定的破壞[17]。

圖4 提取時(shí)間對(duì)多糖得率的影響Fig.4 The effect of extraction time on the yield of polysaccharide

圖5 提取次數(shù)對(duì)多糖得率的影響Fig.5 The effect of extraction times on the yield of polysaccharide

2.2.4 提取次數(shù)對(duì)多糖得率的影響分析

提取次數(shù)對(duì)百合多糖得率影響的曲線見圖5。由圖5可知：百合多糖得率隨提取次數(shù)的增加而上升，提取2次時(shí)基本已被提取出來，此后繼續(xù)增加提取次數(shù)，多糖得率呈緩慢上升趨勢。因此，從工作量和成本考慮，選取2次為單因素試驗(yàn)最佳提取次數(shù)。

2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)

根據(jù)2.2節(jié)單因素試驗(yàn)的結(jié)果，固定提取次數(shù)為2次，選取料液比、提取溫度和提取時(shí)間為試驗(yàn)因素，以百合多糖得率為試驗(yàn)響應(yīng)值，設(shè)計(jì)三因素三水平響應(yīng)面進(jìn)行優(yōu)化試驗(yàn)，因素水平表和響應(yīng)面分析試驗(yàn)根據(jù)文獻(xiàn)[15]設(shè)計(jì)，其結(jié)果見表1和2。

表1 響應(yīng)面因素及水平表

通過Design Expert 8.05b軟件對(duì)表2中的試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行響應(yīng)面回歸分析，得到該試驗(yàn)的回歸模型方程Y′=6.374+0.221 25A+0.072 5B+0.081 25C+0.022 5AB-0.04AC-0.007 5BC-0.034 7A2-0.329 5B2-0.267 8C2。模型系數(shù)顯著性結(jié)果和方差分析結(jié)果見表3和4。

表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果

表3 回歸模型方差分析和系數(shù)顯著性檢驗(yàn)

表4 方差分析表

由表3可知：該模型的P值極顯著(P<0.000 1)，R2=0.975 6，表示方程能較好地反映各因子與響應(yīng)值的關(guān)系，并預(yù)測最佳合成條件。失擬項(xiàng)P值為不顯著，說明方程擬合度較好。各因素對(duì)試驗(yàn)影響程度由大到小依次為料液比(極顯著)、時(shí)間(顯著)、溫度(顯著)。

各因素之間交互作用對(duì)百合多糖得率的影響結(jié)果見圖6。比較圖6(a)、6(b)和6(c)之間可知：料液比與時(shí)間交互作用的曲線橢圓程度大于料液比與溫度的交互作用，且大于溫度與時(shí)間的交互作用。該結(jié)果與表3中影響因素A、C大于影響因素A、B，大于影響因素B、C，所得P值的結(jié)果也是一致的。

圖6 各因素相互作用對(duì)多糖得率影響的響應(yīng)面圖Fig.6 Response surface of the effects of the operating parameters on the yield of polysaccharide

2.4 方程的求導(dǎo)和驗(yàn)證

通過響應(yīng)面優(yōu)化得到百合多糖最高得率為6.258%，利用Design Expert 8.05b軟件對(duì)方程進(jìn)行求導(dǎo)，得到最佳條件為料液比(g/mL)1∶ 24.98，溫度121.44 ℃，時(shí)間92.25 min。為方便操作，取料液比(g/mL)為1∶ 25、溫度121 ℃、時(shí)間92 min，對(duì)方程進(jìn)行驗(yàn)證，在此條件下百合多糖得率為6.284%，接近預(yù)測值，證明該方程可行。

3 結(jié)論

采用高溫水溶液提取百合中的多糖，經(jīng)單因素試驗(yàn)表明，百合多糖提取的最佳條件分別為料液比(g/mL)1∶ 20，溫度120 ℃，時(shí)間90 min，次數(shù)2次。在此基礎(chǔ)上固定提取次數(shù)2次，選取料液比、溫度和時(shí)間為變量，以多糖得率為響應(yīng)值進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，得到最佳提取條件為料液比(g/mL)1∶ 25，溫度121 ℃，時(shí)間92 min。該條件下百合多糖得率為6.284%，明顯高于文獻(xiàn)報(bào)道所采用熱水浸提法的0.92%。該方法簡單、易操作，比較適用于百合多糖的提取。