白羽祥，楊煥文，徐照麗，吳 濤，易建華，王 戈，*

(1．云南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草學(xué)院，云南昆明650201;2．云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，云南昆明650021;3．云南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司，云南昆明650224;4．廣西-東盟食品藥品安全檢驗(yàn)檢測中心，廣西南寧530001)

長期連作會帶來忌連作作物生長發(fā)育進(jìn)程受阻、病害和蟲害發(fā)生嚴(yán)重、產(chǎn)質(zhì)量下降等一系列問題［1－2］?？緹熓堑湫偷募蛇B作作物，長期連作會嚴(yán)重影響煙葉生長發(fā)育及產(chǎn)質(zhì)量形成［3］。雖然業(yè)界一直提倡輪作，但由于耕地面積逐年減少，加上利益驅(qū)使，我國烤煙連作現(xiàn)象依然普遍，嚴(yán)重制約了煙草行業(yè)的可持續(xù)發(fā)展［4］。

已有研究表明，連作導(dǎo)致土壤質(zhì)量趨劣［5］。隨著連作年限增加，土壤養(yǎng)分失衡［6－7］，酶活性變化［8－10］，微生物數(shù)量及多樣性降低［11］，自毒物質(zhì)積累［12］，多因素相互作用對土壤環(huán)境產(chǎn)生不利影響，進(jìn)而導(dǎo)致植株生長發(fā)育受抑。近年來，土壤中有毒物質(zhì)積累在連作中的作用機(jī)理倍受重視，其中，酚酸類物質(zhì)在土壤中的積累被認(rèn)為是導(dǎo)致連作障礙的重要因素之一［13－14］。酚酸物質(zhì)廣泛分布于土壤中，具有十分重要的生理和生態(tài)功能［15－18］。對水稻、大豆、花生、黃瓜、中藥材，以及林木等的研究發(fā)現(xiàn)，連作土壤中酚酸物質(zhì)的含量數(shù)倍于輪作，且隨連作年限增加呈明顯積累過程［19－21］。相對其他作物，連作植煙土壤中酚酸物質(zhì)的動態(tài)變化研究較少?？挛妮x［22］研究發(fā)現(xiàn)，在煙草根際土壤水浸提液中存在著化感自毒物質(zhì)，這種物質(zhì)隨著種植茬次的延長有富集效應(yīng)，但未明確浸提液中哪種物質(zhì)起到了化感作用。符建國等［23］研究發(fā)現(xiàn)，連作與輪作植煙土壤根際土壤酸性有機(jī)組分種類、數(shù)量、化學(xué)成分存在差異，且連作植煙土壤中酸性物質(zhì)含量較高。但陳冬梅等［24－25］發(fā)現(xiàn)，雖然土壤浸提液中存在自毒物質(zhì)，但煙草連作后根際土壤酸類物質(zhì)種類卻顯著減少。因此，有必要進(jìn)一步明確連作植煙土壤中酚酸類物質(zhì)種類、含量的變化趨勢，以及酚酸類物質(zhì)在植煙土壤中的可能作用機(jī)制。

土壤各因子的相互作用，共同影響土壤質(zhì)量［26］，進(jìn)入土壤的酚酸類物質(zhì)也必將參與土壤中的各種物質(zhì)和能量代謝。酚酸類物質(zhì)如何影響土壤環(huán)境中的其他因子，其相互作用關(guān)系如何等尚待探究，這對豐富酚酸類物質(zhì)在連作問題中的作用機(jī)理認(rèn)知具有積極意義［27－29］。由于酚酸類物質(zhì)與土壤酶活性和理化性狀之間可能具有復(fù)雜的關(guān)系，雙變量相關(guān)性分析未必能反映兩個變量間的真實(shí)關(guān)系，因此，本研究在相關(guān)性分析的基礎(chǔ)上，利用SPSS 19.0軟件中的逐步回歸模型進(jìn)行分析，研究了不同連作年限下植煙土壤中酚酸類物質(zhì)與土壤理化性狀、酶活性的關(guān)系，以便篩選出真正具有影響的變量，即影響因素［30］，旨在為探明酚酸類物質(zhì)在連作問題中的作用機(jī)理提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 連作植煙土壤樣品采集

于2017年在云南省保山市施甸縣姚關(guān)鎮(zhèn)陡坡村連片烤煙種植示范區(qū)采集土樣，該區(qū)域土地由同一農(nóng)戶承包，土壤質(zhì)地為砂壤土，種植烤煙品種為K326，前茬作物為大麥。每年烤煙施氮量(N)為 120 kg·hm－2，施磷量(P2O5)為 90 kg·hm－2，施鉀量(K2O)為321 kg·hm－2，肥料由當(dāng)?shù)責(zé)煵莨咎峁Ｔ耘喙芾泶胧┙y(tǒng)一按照當(dāng)?shù)貎?yōu)質(zhì)煙葉生產(chǎn)技術(shù)進(jìn)行。

每年植煙之前，利用五點(diǎn)取樣法采取第1年(T1，對照)、第6年(T6)、第 8年(T8)、第 14年(T14)和第16年(T16)種植烤煙的0～20 cm土樣，每一處理采取2 kg。

1．2 土壤樣品處理及方法

各處理稱取100.00 g新鮮樣品置于離心管中(3 次重復(fù))，加入100 mL 1 mol·L－1NaOH 放置24 h，振蕩60 min，離心后將濾液用12 mol·L－1的 HCl酸化至pH 2.5，120 min后離心除去胡敏酸，然后將上清液過0.22 μm的纖維膜，濾液用高效液相色譜(HPLC)測定，結(jié)果按照烘干土質(zhì)量換算。

1．3 測定項(xiàng)目和測定方法

土壤理化性狀測定項(xiàng)目包括pH、有機(jī)質(zhì)、全N、全P、全K、堿解N、有效P、速效K，分別參照行業(yè)標(biāo)準(zhǔn) NY/T 1377—2007、NY/T 1121.6—2006、NY/T 53—1987、NY/T 88—1988、NY/T 87—1988、LY/T 1229—1999、NY/T 1121.7—2006、NY/T 889—2004進(jìn)行測定。

酶活性依據(jù)梅守榮［31］的方法進(jìn)行測定。土壤過氧化氫酶(CAT)活性采用KMnO4滴定法測定;脲酶活性利用靛酚藍(lán)比色法測定;蔗糖酶活性采用3，5-二硝基水楊酸比色法測定;酸性磷酸酶活性采用磷酸苯二鈉比色法測定。

土壤酚酸類化合物的測定采用HPLC進(jìn)行。儀器為Aglient 1200高效液相色譜儀，色譜柱為SunFireTMC18 柱(4.6 mm ×250 mm，5 μm)，流速1 mL·min－1，柱溫 25oC，檢測波長 280 nm。流動相A(甲醇)和流動相B(pH值2.5的乙酸水溶液)的梯度如下:0 min，流動相A 30%，流動相B 70%;15 min，流動相A 50%，流動相B 50%;16 min，流動相A 70%，流動相B 30%;30 min，流動相A 0，流動相B 100%。標(biāo)準(zhǔn)樣品分別為闊馬酸、對羥基苯甲酸、間苯三酚、香草酸、香蘭素、阿魏酸、鄰苯二甲酸、苯甲酸、肉桂酸和水楊酸，進(jìn)樣量10 μL。每個周期分析結(jié)束后，等待10 min，以便去除干擾成分的影響，保證分析結(jié)果的穩(wěn)定性和重復(fù)性。

1．4 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Microsoft Office 2013進(jìn)行初步處理，采用SPSS 22.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，利用Duncan's新復(fù)極差法進(jìn)行多重比較，并在相關(guān)性分析的基礎(chǔ)上利用逐步回歸模型對各項(xiàng)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2．1 連作對植煙土壤理化性狀的影響

從表1可以看出:隨著連作年限增加，植煙土壤pH值、有機(jī)質(zhì)和全氮含量降低，速效鉀含量隨連作年限延長而表現(xiàn)出升高趨勢，連作第14年和第16年的土壤速效鉀含量顯著(P＜0.05)高于其他處理;全磷、全鉀、堿解氮和有效磷含量隨連作年限延長呈現(xiàn)出先降低后升高的趨勢，最低值分別出現(xiàn)在第6年、第8年、第14年和第14年。以上結(jié)果表明，連作導(dǎo)致植煙土壤酸化，各養(yǎng)分發(fā)生非均衡變化。

2．2 連作對植煙土壤酶活性的影響

從表2可以看出，隨著連作年限延長，植煙土壤中過氧化氫酶、脲酶、酸性磷酸酶和蔗糖酶活性均呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢，但不同酶活性的峰值出現(xiàn)在不同年限，其中，第8年的過氧化氫酶和酸性磷酸酶活性顯著(P＜0.05)高于其他年限，第6年的脲酶活性顯著(P＜0.05)高于其他年限，第6年和第8年的蔗糖酶活性顯著(P＜0.05)高于其他年限。

2．3 連作對植煙土壤酚酸類物質(zhì)的影響

從表3可以看出，在植煙土壤中檢出了8種酚酸類物質(zhì)，分別為間苯三酚、闊馬酸、對羥基苯甲酸、香草酸、香蘭素、阿魏酸、苯甲酸和肉桂酸。其中，間苯三酚、闊馬酸、對羥基苯甲酸、香草酸、香蘭素、阿魏酸和總量整體表現(xiàn)出隨著連作年限延長而升高的趨勢，且均以第16年最高，顯著(P＜0.05)高于其他處理。苯甲酸和肉桂酸含量則呈先升高后降低趨勢。

表1 連作對植煙土壤理化性狀的影響Table 1 Effect of continuous cropping on soil physiochemical properties in tobacco-planted soil

表2 連作對植煙土壤酶活性的影響Table 2 Effect of continuous cropping on soil enzymes activities in tobacco-planted soil

表3 不同連作年限植煙土壤酚酸類物質(zhì)種類和含量Table 3 Species and contents of phenolic acids in tobacco-planted soil mg·kg －1

2．4 酚酸類物質(zhì)與土壤酶活性、理化性狀的相關(guān)性分析

從表4可以看出，酚酸類物質(zhì)含量與土壤酶活性、理化性狀具有不同程度的相關(guān)性。土壤過氧化氫酶與對羥基苯甲酸呈顯著負(fù)相關(guān)(P＜0.05)，與肉桂酸呈極顯著正相關(guān)(P＜0.01)。脲酶與間苯三酚、闊馬酸、阿魏酸、酚酸總量呈顯著負(fù)相關(guān)(P＜0.05)。土壤pH值與間苯三酚含量呈顯著負(fù)相關(guān)(P＜0.05)。

2．5 酚酸類物質(zhì)與土壤酶活性、理化性狀的相互影響

逐步回歸分析得出的偏回歸方程的標(biāo)準(zhǔn)化系數(shù)代表了對應(yīng)自變量的影響力，標(biāo)準(zhǔn)化系數(shù)的正負(fù)分別代表了該自變量對因變量所起到的促進(jìn)或抑制作用［30］。

由表5可以看出，以酚酸類物質(zhì)為自變量，土壤酶活性和理化性狀為因變量，通過逐步回歸分析剔除無關(guān)變量后，擬合出pH與間苯三酚、過氧化氫酶與肉桂酸、脲酶與闊馬酸的回歸方程，說明除間苯三酚影響pH、肉桂酸影響過氧化氫酶、闊馬酸影響脲酶外，其余酚酸類物質(zhì)對土壤其他酶活性和理化性狀無顯著影響。從標(biāo)準(zhǔn)化系數(shù)上來看，間苯三酚對pH有抑制作用，肉桂酸對過氧化氫酶活性有促進(jìn)作用，闊馬酸對脲酶活性有抑制作用。

表4 酚酸類化合物與土壤酶活性、化學(xué)性狀相關(guān)性分析Table 4 Correlation analysis of phenolic compounds and soil enzymes activities and physiochemical properties

表5 酚酸類物質(zhì)與土壤酶活性、理化性狀的逐步回歸分析Table 5 Stepwise regression analysis of phenolic acids and soil enzymes activities and physiochemical properties

由表6可以看出，以酚酸類物質(zhì)為因變量，以酶活性為自變量，通過逐步回歸分析剔除無關(guān)變量后，擬合出間苯三酚、闊馬酸、對羥基苯甲酸、阿魏酸、肉桂酸和酚酸類物質(zhì)總量的回歸方程，說明除香草酸、香蘭素和苯甲酸外，酶活性對酚酸類物質(zhì)有一定的影響。從標(biāo)準(zhǔn)化系數(shù)上來看，間苯三酚、闊馬酸和酚酸類物質(zhì)總量受脲酶的抑制作用，對羥基苯甲酸和肉桂酸分別受過氧化氫酶的抑制和促進(jìn)作用，阿魏酸分別受脲酶和過氧化氫酶的抑制作用、蔗糖酶的促進(jìn)作用，且以脲酶的影響最大、蔗糖酶次之、過氧化氫酶最小。

由表7可以看出，以化學(xué)性狀為自變量，酚酸類物質(zhì)為因變量，通過逐步回歸分析剔除無關(guān)變量后，擬合出間苯三酚、對羥基苯甲酸和酚酸類物質(zhì)總量與pH的回歸方程，說明pH對這3種酚酸有影響，其他土壤理化性狀對其他酚酸類物質(zhì)無顯著影響。從回歸方程的標(biāo)準(zhǔn)化系數(shù)來看，pH對間苯三酚、對羥基苯甲酸和酚酸類物質(zhì)總量均有具有抑制作用。

表6 酶活性與酚酸類物質(zhì)的逐步回歸分析Table 6 Stepwise regression analysis of enzymes activities and phenolic compounds

表7 土壤理化性狀與酚酸類物質(zhì)的逐步回歸分析Table 7 Stepwise regression analysis of soil physiochemical properties and phenolic compounds

3 結(jié)論與討論

本研究將酚酸類物質(zhì)作為土壤環(huán)境中的重要組分，初步明確了其與土壤中其他主要環(huán)境因子(理化性狀和酶活性)的相互關(guān)系，并在此基礎(chǔ)上利用逐步回歸分析進(jìn)一步探討酚酸類物質(zhì)與土壤酶活性、理化性狀的相互關(guān)系，研究結(jié)果進(jìn)一步明確了酚酸類物質(zhì)在連作土壤中的積累特征以及與土壤主要因子的關(guān)系，對今后深入開展酚酸類物質(zhì)與環(huán)境因子的相互作用研究提供了一定的理論依據(jù)。

前人對茄子［13］、大豆［14］、蘋果［32］和草莓［33］的連作研究表明，酚酸類物質(zhì)在連作土壤中積累并在某種程度上導(dǎo)致了連作障礙的發(fā)生。植株通過根系向周圍土壤環(huán)境分泌酸類物質(zhì)是土壤中酚酸類物質(zhì)的主要來源之一，隨著烤煙連作年限增加，酚酸物質(zhì)逐漸積累并參與土壤各種生理生化過程［34］。本實(shí)驗(yàn)在前人研究的基礎(chǔ)上，利用高效液相色譜在不同連作年限的植煙土壤中檢測出了8種酚酸類物質(zhì)，分別為間苯三酚、闊馬酸、對羥基苯甲酸、香草酸、香蘭素、阿魏酸、苯甲酸和肉桂酸，其中，間苯三酚、闊馬酸、對羥基苯甲酸、丁香酸、阿魏酸、香蘭素的含量和酚酸類物質(zhì)總含量均隨著連作年限的延長而表現(xiàn)出升高的趨勢，說明隨著連作年限延長，酚酸類物質(zhì)在土壤中表現(xiàn)出富集效應(yīng)。

業(yè)已證明，連作對土壤酶活性和土壤養(yǎng)分具有重要影響［35－38］，本研究也得到相似結(jié)論:隨著連作年限延長，過氧化氫酶、脲酸、酸性磷酸酶、蔗糖酶活性的變化趨勢均表現(xiàn)為先升高后降低，且酶活性峰值出現(xiàn)在不同年限;土壤中pH值、有機(jī)質(zhì)和全N含量均不同程度下降，有效K含量增加，全磷、全鉀、堿解氮和有效磷隨著連作年限延長呈現(xiàn)出先降低后升高的趨勢?？傮w而言，連作導(dǎo)致植煙土壤酸化和養(yǎng)分失衡。

受研究方法和手段的限制，前人相關(guān)研究大多以描述性為主，并未對連作土壤理化性狀、酶活性與酚酸類物質(zhì)的相互作用機(jī)制及相互影響進(jìn)行探討［22－23］。本研究利用相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，土壤中酚酸類物質(zhì)與酶活性、理化性狀具有相關(guān)性，并利用逐步回歸模型進(jìn)一步探究了其相互影響。逐步回歸分析結(jié)果顯示，雖然土壤中酚酸類物質(zhì)和酶活性具有相關(guān)性，但通過逐步回歸分析剔除無關(guān)變量后發(fā)現(xiàn)，酚酸類物質(zhì)對酶活性的影響較小，而酶活性對酚酸類物質(zhì)卻有較大的影響。這種影響可能是通過微生物的活動等某些不確定的因子相互作用產(chǎn)生的［19，21］。酚酸類物質(zhì)除與土壤pH相關(guān)外，與土壤養(yǎng)分并無顯著相關(guān)性，逐步回歸分析進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，pH對間苯三酚、對羥基苯甲酸和酚酸類物質(zhì)總含量存在抑制作用，即pH越低，酚酸類物質(zhì)積累越明顯，這在一定程度上說明連作導(dǎo)致植煙土壤酸化是使酚酸類物質(zhì)積累的一個因子，因此，可通過調(diào)節(jié)土壤pH值來緩解植煙土壤中酚酸類物質(zhì)的積累，從而緩解連作帶來的一系列問題。這與李亮亮等［30］對酚酸類物質(zhì)在土壤中降解的研究結(jié)果一致。酚酸類物質(zhì)與土壤理化性狀的逐步回歸分析還顯示，除間苯三酚對pH有影響外，其余酚酸類物質(zhì)對其他土壤理化性狀指標(biāo)并無直接影響?？紤]到酚酸類物質(zhì)與酶活性的互相影響，可以認(rèn)為酚酸類物質(zhì)會通過影響酶活性等因素來對植煙土壤理化性狀間接產(chǎn)生影響，從而進(jìn)一步加劇連作土壤的養(yǎng)分失衡。本文結(jié)果從統(tǒng)計(jì)分析的角度初步闡述了酚酸類物質(zhì)與酶活性、理化性狀的相互影響。在此基礎(chǔ)上，可通過外源添加酚酸等方式來進(jìn)一步驗(yàn)證其對土壤各環(huán)境因子的影響，從而進(jìn)一步明確酚酸類物質(zhì)在連作植煙土壤中的作用機(jī)制。