尹明華，占學(xué)林，徐文慧，謝妮妮，蔡 紅，陳榮華

(1．上饒師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，江西上饒334001;2．上饒市紅日農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司，江西上饒334700)

三葉青(Tetrastigma hemsleyanum Diels et Gilg)是中國(guó)特有的珍稀藥用植物，為葡萄科崖爬藤屬植物三葉崖爬藤，分布于中國(guó)長(zhǎng)江中下游及南方地區(qū)海拔300～1 000 m的陰濕地區(qū)［1］?！吨袊?guó)植物志》記載三葉崖爬藤全株可供藥用，有清熱解毒、祛風(fēng)化痰、活血止痛等功效，可用于治療毒蛇咬傷、扁桃體炎、淋巴結(jié)結(jié)核、跌打損傷、小兒高熱驚厥等［2］?，F(xiàn)代藥理研究表明，三葉青具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤、抗病毒、鎮(zhèn)痛解熱、調(diào)節(jié)免疫等作用，并廣泛用于多種中成藥或保健品［3］。目前，三葉青的研究報(bào)道主要集中于植物學(xué)、化學(xué)成分、毒理藥理學(xué)、臨床應(yīng)用、人工栽培、生物技術(shù)等方面［4］，而三葉青種質(zhì)資源遺傳多樣性研究少有報(bào)道。袁帶秀等［5－6］首次對(duì)湘南湘西3個(gè)不同產(chǎn)地的三葉青種質(zhì)資源親緣關(guān)系進(jìn)行了過(guò)氧化酶(POD)和酯酶同工酶檢測(cè)，結(jié)果顯示它們是3個(gè)獨(dú)立的物種;朱波等［7］利用 inter-simple sequence repeat(ISSR)分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)24份種質(zhì)資源的遺傳多樣性進(jìn)行了研究，并將浙江種質(zhì)全部聚為第Ⅰ類，江西、廣西、湖北、湖南等種質(zhì)聚為第Ⅱ類，湖南懷化與廣西鐘山種質(zhì)聚為第Ⅲ類，貴州種質(zhì)單獨(dú)聚為第Ⅳ類。該研究樣本數(shù)量和樣本選取地偏少，且分子生物學(xué)技術(shù)在三葉青遺傳多樣性中的應(yīng)用研究還處于起步階段，應(yīng)在加強(qiáng)三葉青種質(zhì)資源收集的基礎(chǔ)上繼續(xù)采用其他DNA分子標(biāo)記來(lái)進(jìn)行深入研究，以保護(hù)我國(guó)特有的珍稀藥用植物資源。隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)DNA(random amplified polymorphic DNA，RAPD)技術(shù)是由美國(guó)科學(xué)家 Wiliams和Welsh于1990年分別研究提出的一種基于PCR的分子標(biāo)記技術(shù)［8］，可在沒(méi)有基因組信息且特異性標(biāo)記較少條件下進(jìn)行，具有DNA樣品用量少、操作簡(jiǎn)單易行、分析速度快、易檢測(cè)、實(shí)驗(yàn)成本低等優(yōu)點(diǎn)，目前已在國(guó)內(nèi)外很多物種的分類及遺傳多樣性分析中被廣為應(yīng)用［9］。三葉青基因組還沒(méi)有測(cè)序，僅有極少數(shù)基因克隆，無(wú)法大量開發(fā)簡(jiǎn)單重復(fù)序列(simple sequence repeats，SSR)、單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)和表達(dá)序列標(biāo)簽(expressed sequence tags，ESTs)標(biāo)記，研究起來(lái)進(jìn)展緩慢，而RAPD標(biāo)記能夠在未知序列的情況下快速方便找到差異。目前，我國(guó)三葉青種質(zhì)資源的遺傳多樣性及親緣關(guān)系的分子標(biāo)記研究仍不全面，可通過(guò)擴(kuò)大群體數(shù)量，增加近緣種和野生種數(shù)量來(lái)探討遺傳多樣性和親緣關(guān)系，以便在品種選育中更好地選擇中間材料，減少盲目性。雖然RAPD會(huì)產(chǎn)生假陽(yáng)性，但可通過(guò)提高退火溫度來(lái)保證實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性［10－13］。另外，本課題組的預(yù)實(shí)驗(yàn)表明，RAPD分子標(biāo)記在不同三葉青種質(zhì)中均能獲得較高的多態(tài)性比率，是理想的多態(tài)性篩選、種質(zhì)資源鑒定的分子標(biāo)記類型，可以用于三葉青種質(zhì)資源遺傳多樣性的分析。因此，本研究擬采用RAPD技術(shù)對(duì)64份三葉青種質(zhì)的遺傳多樣性進(jìn)行檢測(cè)，旨在探明三葉青種群的遺傳多樣性水平，為合理保護(hù)三葉青的基因資源及其遺傳改良提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 材料

64個(gè)三葉青樣本(表1)采自上饒市紅日農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司位于懷玉山的三葉青種質(zhì)資源庫(kù)和三葉青品種園。

1．2 方法

1．2.1 基因組DNA的提取

采用CTAB法提取樣品基因組DNA［14］。

1．2.2 引物篩選與RAPD分析

用40對(duì)引物(表2)對(duì)4個(gè)樣品(隨機(jī)選擇樣本1、樣本24、樣本33和樣本62)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，篩選出10對(duì)引物進(jìn)行批量實(shí)驗(yàn)［15］。PCR擴(kuò)增體系(20 μL):2 μL DNA 模板，1 μL 引物，10 μL 2×Taq PCR Mastermix buffer(北京博友順生物技術(shù)有限公司)，7 μL去離子水。PCR擴(kuò)增程序?yàn)?94℃ 3 min;94℃ 30 s，36℃ 50 s，72℃ 1.5 min，40個(gè)循環(huán);72℃ 10 min，4℃保存。

1．2.3 數(shù)據(jù)分析

PCR產(chǎn)物用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。RAPD擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖譜中的每1條帶均視為1個(gè)分子標(biāo)記(DL 2 000 DNA marker)，代表一個(gè)引物的結(jié)合位點(diǎn)。按凝膠同一位置上DNA帶的有無(wú)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，有帶(包括弱帶)的記為“1”，無(wú)帶的記為“0”，構(gòu)成RAPD表型數(shù)據(jù)矩陣用于分析。采用POPGENE 1.31軟件對(duì)全部種群和各個(gè)單種群分別進(jìn)行遺傳參數(shù)分析［16］，分別計(jì)算觀測(cè)等位基因數(shù)(Na)、有效等位基因數(shù)(Ne)、Nei's基因多樣性指數(shù)(H)、Shannon多樣性指數(shù)(I)、多態(tài)位點(diǎn)和多態(tài)百分?jǐn)?shù)(%);利用NTSYS軟件計(jì)算相似系數(shù)(DICE系數(shù))，并且按照遺傳距離進(jìn)行UPGMA聚類分析。

表1 三葉青64個(gè)樣本信息Table 1 Information of 64 Tetrastigma hemsleyanum samples

續(xù)表1

2 結(jié)果與分析

2．1 引物篩選結(jié)果

40對(duì)RAPD引物的篩選結(jié)果見(jiàn)圖1，篩選出至少能擴(kuò)增出2條及以上多態(tài)性條帶的10對(duì)引物進(jìn)行批量實(shí)驗(yàn)。10對(duì)引物分別是 HSD1、HSD3、HSD6、HDS9、HSD14、HSD16、S10、S12、S19、S20。

2．2 RAPD引物擴(kuò)增多態(tài)性

利用篩選出的10條引物對(duì)64個(gè)三葉青DNA樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其中引物P1(HSD1)對(duì)64個(gè)三葉青樣本的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖2，10條引物PCR擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)表3。在64個(gè)三葉青樣本中共檢測(cè)到80個(gè)DNA位點(diǎn)，平均每條引物擴(kuò)增出8個(gè)DNA位點(diǎn)，有75個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，多態(tài)性位點(diǎn)比率(PPB)為93.75%。10條RAPD引物擴(kuò)增的DNA位點(diǎn)數(shù)為4～11個(gè)，多態(tài)性位點(diǎn)比率為66.67% ～100%;其中，多態(tài)性比率最低的為引物 P3(HSD3)，為 66.67%，而引物 P30(S10)擴(kuò)增出的DNA位點(diǎn)為4，位點(diǎn)數(shù)最少，但多態(tài)性位點(diǎn)比率最高，達(dá)100%。表明10條RAPD引物具有較好的多態(tài)性，64個(gè)三葉青樣本的遺傳多樣性比較豐富。每條引物平均擴(kuò)增出8個(gè)DNA位點(diǎn)和7.5個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，擴(kuò)增產(chǎn)生的DNA片段長(zhǎng)度為100～2 000 bp。結(jié)果表明，采用不同的RAPD引物對(duì)64個(gè)三葉青樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增出的位點(diǎn)數(shù)差異較大，多態(tài)性位點(diǎn)的比例差異也較大。

表2 RAPD引物信息Table 2 Information of RAPD primers

圖1 40對(duì)RAPD引物的PCR電泳圖Fig．1 PCR electrophoresis of 40 RAPD primers

表3 RAPD-PCR擴(kuò)增的引物及擴(kuò)增結(jié)果Table 3 RAPD primers used for RAPD-PCR amplification and their amplification results

圖2 引物P1(HSD1)對(duì)64個(gè)三葉青樣本的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)結(jié)果Fig．2 Detection results of PCR amplification products of 64 Tetrastigma hemsleyanum samples using P1(HSD1)primer

2．3 三葉青的遺傳多樣性分析

遺傳多樣性分析(表4)表明，64個(gè)三葉青樣本的觀測(cè)等位基因數(shù)(Na)為1.666 7～2.000 0，有效等位基因數(shù)(Ne)為1.247 9～1.701 3，Nei's基因多樣性指數(shù)為0.167 0～0.398 4，Shannon多樣性指數(shù)(I)為0.262 8～0.583 0，平均多態(tài)位點(diǎn)為7.5，平均多態(tài)百分?jǐn)?shù)為93.15%。

2．4 三葉青的遺傳關(guān)系聚類分析

10對(duì)引物在64個(gè)樣品中共獲得80條擴(kuò)增片段。利用NTSYS軟件計(jì)算樣品間的遺傳相似系數(shù)(GS值)，得到供試材料遺傳相似矩陣。遺傳相似系數(shù)越大，表明親緣關(guān)系越近，遺傳相似系數(shù)越小，親緣關(guān)系越遠(yuǎn)。根據(jù)遺傳相似系數(shù)矩陣，利用UPGMA法進(jìn)行聚類分析，得到UPGMA聚類分析圖(圖3)。

在遺傳相似系數(shù)0.720 56處，可以將64個(gè)三葉青樣本分成11大類:第Ⅰ類包括樣本1(JXHY1)、29(GDSG)、60(JXNF)、33(JXDX)、52(JXWY)、42(AHHS1)、53(AHHS2)、34(ZJNN)、39(JXYY)、56(FJGZ)、28(GDSX)、51(JXFC);第Ⅱ類包括樣本47(FJWYS)、61(JXNC)、54(JXGX)、46(ZJFY)、48(ZJTZ)、49(FJSM)、62(ZJJH)、64(FJJY);第Ⅲ類包括樣本 26(YNWS)、27(GZMT)、30(TWAL)、31(HNJFL)、41(JXYS1);第Ⅳ類包括樣本 2(HBYZ)、57(JXAY)、35(FJPC)、20(GZHGS)、21(GXLS1)、22(GXCR)、40(JXHY2)、38(ZJNB 1);第Ⅴ類包括樣本37(ZJCA)、43(JXYS2);第Ⅵ類包括樣本 3(CQZWY)、4(HNJS)、5(HNZJJ1)、6(CQCN)、8(HNYL)、9(CQPS)、13(HBXDS)、14(ZJWZYJ)、10(CQJFS)、15(HNZJJ2)、16(GXLY1)、11(HNFH)、12(SCEMS);第Ⅶ類包括樣本19(GXGL)、59(ZJKH)、32(JXJGS)、55(ZJZS)、44(ZJNB2)、45(ZJLIS)、50(ZJNB3)、58(JXYT)、23(GXLS2)、24(YNML);第Ⅷ類包括樣本7(HNHH)、18(GXLY2)、25(GXLS3);第Ⅸ類包括樣本36(ZJSC);第Ⅹ類包括樣本17(GXBS);第Ⅺ類包括樣本63(JXYH)。

表4 引物的多態(tài)性數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)Table 4 Polymorphic data statistics of primers

圖3 基于RAPD標(biāo)記的64個(gè)三葉青的UPGMA親緣關(guān)系聚類圖Fig．3 The UPGMA genetic relationship clustering map of 64 Tetrastigma hemsleyanum samples based on RAPD molecular markers

在遺傳相似系數(shù)0.697 04處，則可將64個(gè)三葉青樣本分成4大類:第Ⅰ類包括樣本63(JXYH);第Ⅱ類包括樣本17(GXBS);第Ⅲ類包括樣本7(HNHH)、18(GXLY2)、25(GXLS3)、36(ZJSC);剩下58個(gè)樣本均屬于第Ⅳ類。

3 討論

三葉青是我國(guó)特有的瀕危珍稀藥用植物，已有多年藥用歷史，主產(chǎn)于浙江、湖南、江西、福建、廣西、重慶、湖北、四川、廣東、貴州等地［17］。我國(guó)三葉青主要有2個(gè)品種:青色藤三葉青(主產(chǎn)于福建、湖南、四川、廣東、廣西和云南的部分地區(qū)，27.3°N以南)和褐紫藤三葉青(主產(chǎn)于江西和浙江山區(qū)，27.3°N 以北)［18］。隨著越來(lái)越多種類和數(shù)量的分子標(biāo)記被開發(fā)，分子標(biāo)記技術(shù)在各種植物的分子遺傳圖譜構(gòu)建、品種鑒定與純度分析、重要經(jīng)濟(jì)性狀相關(guān)基因定位以及種質(zhì)資源多樣性分析等領(lǐng)域中應(yīng)用已十分廣泛［19］。王一涵［20］基于雙重抑制法開發(fā)了8對(duì)有多態(tài)性的三葉青特異性微衛(wèi)星引物，基于微衛(wèi)星數(shù)據(jù)的STRUCTURE聚類分析結(jié)果表明，三葉青群體可劃分為4個(gè)地理分組，分別對(duì)應(yīng)于中國(guó)西南部、中部、東部和南部地區(qū)(包括海南)。朱波等［7］利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)三葉青全國(guó)主分布區(qū)24份種質(zhì)資源的遺傳多樣性進(jìn)行了研究，也發(fā)現(xiàn)種質(zhì)聚類分析結(jié)果與地理分布密切相關(guān)。Peng等［21］采用SRAP和ISSR標(biāo)記對(duì)27個(gè)三葉青野生或栽培居群的遺傳多樣性進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)樹狀圖顯示了三葉青的地理分布集群模式。

RAPD具有操作簡(jiǎn)便、不需提前知道材料基因信息、檢測(cè)靈敏、多態(tài)性強(qiáng)等特點(diǎn)，是目前研究植物遺傳變異、植物遺傳多樣性、植物品種鑒定等方面廣泛采用的一種分子標(biāo)記法［22］。在實(shí)際應(yīng)用中，RAPD技術(shù)可以在物種沒(méi)有任何分子生物學(xué)研究水平的背景下，對(duì)其基因組進(jìn)行多態(tài)性分析［23］，而且成本較低，操作簡(jiǎn)單，引物來(lái)源廣泛，這對(duì)于遺傳背景研究相對(duì)較少的三葉青來(lái)說(shuō)較為適宜。

在本實(shí)驗(yàn)中，來(lái)源于江西懷玉山太陽(yáng)坑、江西南豐泰和鎮(zhèn)果村、江西德興暖水、江西婺源段莘鄉(xiāng)五龍山、江西豐城市玉華山、江西弋陽(yáng)三縣嶺的三葉青與來(lái)源于安徽黃山玉屏景區(qū)、安徽黃山鳳凰源景區(qū)、浙江景寧大漈、廣東韶光仁化縣、廣東始興都亨鄉(xiāng)、福建光澤的三葉青聚為第Ⅰ類;來(lái)源于江西南昌梅嶺梅谷、江西貴溪樟坪畬族鄉(xiāng)、江西貴溪樟坪畬族鄉(xiāng)的三葉青與來(lái)源于福建武夷山天心永樂(lè)寺、浙江富陽(yáng)新登外官、浙江臺(tái)州三門縣花橋、福建三明三元吉口、浙江金華武義柳城、福建建陽(yáng)華家山林場(chǎng)的三葉青聚為第Ⅱ類;來(lái)源于江西玉山橫街清溪的三葉青與來(lái)源于云南文山縣古木鎮(zhèn)、貴州湄潭茅坪、臺(tái)灣阿里山、海南尖峰嶺森林公園的三葉青聚為第Ⅲ類;來(lái)源于江西安遠(yuǎn)老鼠嘴、江西懷玉山金剛峰的三葉青與來(lái)源于湖北永州黃田鋪、福建蒲城縣筊杯巖、貴州黃果樹景區(qū)、廣西龍勝銀水侗寨、廣西崇仁明仁、浙江寧波天童寺南山的三葉青聚為第Ⅳ類;來(lái)源于江西玉山必姆坳村的三葉青與來(lái)源于浙江淳安大市花石源的三葉青聚為第Ⅴ類;來(lái)源于重慶藥用植物園、湖南吉首德夯、湖南張家界森林公園、重慶潼南縣上和鎮(zhèn)、湖南沅陵清水坪、重慶彭水、湖北星斗山、重慶金佛山山泉鎮(zhèn)、湖南張家界金鞭溪、廣西樂(lè)業(yè)龍角山、湖南鳳凰南華植物園、四川峨眉山清音閣卻與來(lái)源于浙江溫州永嘉四海山的三葉青聚為第Ⅵ類;來(lái)源于江西井岡山、江西鷹潭龍虎山的三葉青與來(lái)源于廣西桂林植物研究所、浙江開化洪源、浙江舟山白泉鎮(zhèn)、浙江寧波天童寺鐘樂(lè)海、浙江麗水蓮都東西巖、寧波市天童寺小天童、廣西龍勝花坪紅毛沖、云南麻栗坡中寨村的三葉青聚為第Ⅶ類;來(lái)源于湖南懷化綏寧縣黨坪、廣西樂(lè)業(yè)龍角山、廣西桂林龍勝粗江的三葉青則聚為第Ⅷ類;來(lái)源于浙江遂昌白馬山的三葉青單獨(dú)成為第Ⅸ類;來(lái)源于廣西百色富寧的三葉青單獨(dú)成為第Ⅹ類;來(lái)源于江西宜黃徐坊鎮(zhèn)鄧家的三葉青單獨(dú)成為第Ⅺ類。以上分類結(jié)果表明，三葉青種質(zhì)資源的遺傳多樣性較高，與群體的地理分布并沒(méi)有顯著的相關(guān)性，與前人研究結(jié)果不同。究其原因，朱波等［7］指出，可能是所取材料均為一個(gè)種，屬于種內(nèi)變異，相比種間或居群間變異小，其次，可能是種源地組成較為單一;Peng等［13］也認(rèn)為，群體內(nèi)遺傳相似性高于群體間，栽培群體間的遺傳相似性遠(yuǎn)高于野生群體，可能是基因流水平低、距離隔離和無(wú)性繁殖所致。袁帶秀等［5－6］對(duì)3個(gè)不同種源地三葉青酯酶同工酶和POD同工酶進(jìn)行比較研究，發(fā)現(xiàn)小貓兒村三葉青與州黨校三葉青的親緣關(guān)系較近，與永順三葉青的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。這也為三葉青遺傳多樣性不一定與地理分布相關(guān)提供了一些依據(jù)。在本實(shí)驗(yàn)中，聚類分析的結(jié)果與種源的地理距離也存在不一致性，這可能與種源地的地形、氣候等自然因素有關(guān)。而且這些種源都采集于懷玉山種質(zhì)資源庫(kù)，三葉青對(duì)種質(zhì)資源庫(kù)的氣候、地形、土壤等條件的適應(yīng)可能也會(huì)導(dǎo)致個(gè)體遺傳性狀的改變，從而導(dǎo)致聚類分析的結(jié)果錯(cuò)綜復(fù)雜。

多態(tài)性位點(diǎn)的豐富程度間接反映了種群遺傳多樣性的豐富程度［24］。種群中的多態(tài)性位點(diǎn)多，表明群內(nèi)物種間遺傳變異的水平較高，種群遺傳多樣性豐富，對(duì)環(huán)境有較強(qiáng)的適應(yīng)能力;反之，如果其多態(tài)性位點(diǎn)較少，則表明該物種的遺傳多樣性較差，對(duì)環(huán)境沒(méi)有較好的適應(yīng)能力，在自然選擇的過(guò)程中處于劣勢(shì)［25］。在本研究驗(yàn)中，64個(gè)三葉青樣本的觀測(cè)等位基因數(shù)(Na)為1.666 7～2.000 0，有效等位基因數(shù)(Ne)為1.247 9～1.701 3，Nei's基因多樣性指數(shù)為0.167 0～0.398 4，Shannon多樣性指數(shù)(I)為0.262 8～0.583 0，平均多態(tài)位點(diǎn)為7.5，平均多態(tài)百分?jǐn)?shù)為93.75%，說(shuō)明64個(gè)三葉青樣本的遺傳多樣性較為豐富，對(duì)高山環(huán)境有較強(qiáng)適應(yīng)力。