李 曼，張珍珍，楊衛(wèi)軍，曹秀梅

（河北省秦皇島市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗(yàn)中心，河北 秦皇島 066000）

四環(huán)素類藥物（TCs）是一類廣譜抗菌藥物，臨床上主要用于治療革蘭氏陽(yáng)性、陰性菌、支原體、衣原體、立克次氏體和螺旋體等病原微生物引起的感染。此外，四環(huán)素還作為生長(zhǎng)促進(jìn)劑被用在動(dòng)物生產(chǎn)中，曾以價(jià)格低、抗菌譜廣、飼料報(bào)酬高等優(yōu)點(diǎn)而廣泛應(yīng)用在畜牧養(yǎng)殖生產(chǎn)上。人食用四環(huán)素殘留超標(biāo)的動(dòng)物源食品后，藥物會(huì)在人體內(nèi)慢慢蓄積，當(dāng)藥物濃度達(dá)到一定量時(shí)，會(huì)造成人體急慢性中毒，嚴(yán)重影響人的身體健康[1]。目前，四環(huán)素類抗生素的主要檢測(cè)方法有高效液相色譜法、微生物法和分光光度法[2]，其中高效液相色譜法應(yīng)用最為廣泛。采用高效液相色譜法測(cè)定雞肉、水產(chǎn)品、雞蛋、豬肉中四環(huán)素的方法已見(jiàn)相關(guān)報(bào)道[3-6]，而采用高效液相色譜法測(cè)定測(cè)定貉子肉中四環(huán)素類藥物殘留鮮有報(bào)道。

本文通過(guò)對(duì)GB/T 21317-2007《動(dòng)物源性食品中四環(huán)素類獸藥殘留量檢測(cè)方法液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法與高效液相色譜法》中高效液相色譜法的前處理方法進(jìn)行改進(jìn)[7]，以期建立更加快速準(zhǔn)確地適用于貉子肉中四環(huán)素類藥物的殘留方法，對(duì)有效監(jiān)控該藥在貉子的養(yǎng)殖中的應(yīng)用、評(píng)價(jià)貉肉食用的安全性具有重要意義。

1材料與儀器

1.1 儀器島津LC-20A液相色譜儀配SPD-10A VP PLUS紫外檢測(cè)器；SB-5200DT超聲清洗機(jī)；3H20RI智能高速冷凍離心機(jī)；UVS-1漩渦振蕩器；TTL-Ⅱ氮吹儀；SUPELCO VISIPREP 24TM DL固相萃取濃縮裝置；FW100高速萬(wàn)能粉粹機(jī)；CP214萬(wàn)分之一天平。

1.2 試劑四環(huán)素、土霉素、金霉素、強(qiáng)力霉素標(biāo)準(zhǔn)品，純度均≥95%（德國(guó)Dr.Ehrenstorfer GmbH公司）；檸檬酸（分析純，天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科學(xué)有限公司）；磷酸氫二鈉（分析純，天津市巴斯夫化工有限公司）；乙二胺四乙酸二鈉、三氟乙酸（分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；甲醇、乙酸乙酯、乙腈（色譜純，美國(guó)TEDIA公司）；0.1 mol/L檸檬酸溶液；0.2 mol/L磷酸氫二鈉溶液；Mcllvaine緩沖溶液（pH=4±0.05）；0.1 mol/L Na2EDTAMcllvaine緩沖溶液；甲醇+水（1+19）；甲醇+乙酸乙酯（1+9）；10 mmol/L三氟乙酸水溶液。

2 方法

2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制儲(chǔ)備液：分別精密稱取土霉素、四環(huán)素、金霉素、強(qiáng)力霉素標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，用甲醇溶解并定容至100 mL，濃度為100 mg/L，置于-18℃保存。

混合標(biāo)準(zhǔn)中間液：分別精密吸取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液各1 mL置于10 mL容量瓶中，用乙腈+三氟乙酸水溶液（30+70）溶解稀釋至刻度，搖勻，即得混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液，土霉素、四環(huán)素、金霉素、強(qiáng)力霉素濃度均為10 mg/L。

混合標(biāo)準(zhǔn)工作液：精密吸取0.125、0.25、0.5、0.75、1.25 mL混合標(biāo)準(zhǔn)中間液，分別用流動(dòng)相溶液稀釋定容至25 mL，即得系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，土霉素、四環(huán)素、金霉素、強(qiáng)力霉素的濃度分別為50、100、200、300、500 μg/L?，F(xiàn)用現(xiàn)配。

2.2 色譜分離條件 色譜柱：Incrtsil C8-5 μm，4.6 mm×250 mm；流動(dòng)相：乙腈+10 mmol/L三氟乙酸水溶液=30+70；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：350 nm；進(jìn)樣量：20 μL；柱溫：30℃。

2.3 樣品的制備及處理

2.3.1 樣品的提取 稱取經(jīng)搗碎勻漿的貉子肉樣品5.00 g（精確到0.01 g）于50 mL具塞離心管中，分別用15 mL、10 mL 0.1 mol/L Na2EDTA-Mcllvaine緩沖溶液冰水浴超聲提取2次，每次渦旋混合1 min，超聲提取10 min，3 000 r/min離心5 min（溫度低于15℃），合并上清液，并定容至25 mL，混勻，5 000 r/min離心10 min（溫度低于15℃），用快速濾紙過(guò)濾，待凈化。

2.3.2 樣品的凈化準(zhǔn)確吸取5 mL提取液以1滴/s的速度過(guò)HLB固相萃取?。ㄊ褂们胺謩e用5 mL甲醇和5 mL水預(yù)處理），待樣液完全流出后，依次用5 mL水和5 mL甲醇+水淋洗，棄去全部流出液，2.0 KPa以下減壓抽干5 min，最后用10 mL甲醇+乙酸乙酯洗脫，將洗脫液吹氮濃縮至干（溫度低于40℃），用1.0 mL流動(dòng)相溶解殘?jiān)?，過(guò)0.45 μm濾膜，待測(cè)定。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制配制系列濃度混合標(biāo)準(zhǔn)工作液,得到土霉素、四環(huán)素、金霉素、強(qiáng)力霉素的濃度分別為50、100、200、300、500 μg/L，在上述色譜條件下測(cè)定，以濃度為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)，作校正曲線，得線性回歸方程。

3 結(jié)果與分析

3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍將系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，依次從低濃度到高濃度進(jìn)行分析，按峰面積與對(duì)應(yīng)的對(duì)照溶液的濃度做標(biāo)準(zhǔn)曲線。其濃度在50～500 μg/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)見(jiàn)表1。

3.2 方法檢出限按照上述2.3方法進(jìn)行樣品處理，標(biāo)準(zhǔn)品和樣品依次在3.750 min（土霉素）、4.420 mi（n四環(huán)素）、6.953 min（金霉素）、7.848 min（強(qiáng)力霉素）出峰，空白試料對(duì)所測(cè)分析物無(wú)干擾，在該色譜條件下土霉素、四環(huán)素、金霉素、強(qiáng)力霉素均得到很好的分離。根據(jù)樣品進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)添加回收率試驗(yàn)，以3倍信噪比可測(cè)得的最低質(zhì)量濃度確定方法的檢出限，土霉素為47.5 μg/kg、四環(huán)素為48.2μg/kg、金霉素為48.9 μg/kg、強(qiáng)力霉素為49.6 μg/kg；四環(huán)素類藥物標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖見(jiàn)圖1，空白組織的色譜圖及空白組織中添加100 μg/kg四環(huán)素類藥物的色譜圖，見(jiàn)圖2和圖3。

表1 四環(huán)素類藥物線性方程及相關(guān)系數(shù)Table 1Linear equations and correlation coefficients of tetracyclines

圖1 四環(huán)素類藥物標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖（50 μg/L）Fig.1Chromatogram of standard for tetracyclines

3.3 準(zhǔn)確度和精密度采用標(biāo)準(zhǔn)添加法，在空白組織中添加3個(gè)不同濃度（50、100和200 μg/kg）的四環(huán)素類標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行回收率測(cè)定，每個(gè)濃度設(shè)定6個(gè)平行樣品，同時(shí)進(jìn)行空白試驗(yàn)，重復(fù)3次，四種藥物回收率達(dá)到80.3%～97.4%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為1.9%～5.5%，結(jié)果見(jiàn)表2。準(zhǔn)確吸取標(biāo)準(zhǔn)品溶液20 μL，重復(fù)進(jìn)樣11次，在相同色譜條件下對(duì)峰面積進(jìn)行分析，結(jié)果表明，峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0.31%，表明儀器精密度良好。

3.4 與 G B/ T 21317-2007方法比較

3.4.1 采用GB/T 21317-2007《動(dòng)物源性食品中四環(huán)素類獸藥殘留量檢測(cè)方法——液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法與高效液相色譜法》方法中流動(dòng)相：乙腈+三氟乙酸水溶液（35+65）時(shí)，結(jié)果見(jiàn)圖4，由圖4可見(jiàn)，陽(yáng)性添加樣品中四環(huán)素峰出現(xiàn)肩峰，峰分離度不佳。

3.4.2 采用GB/T 21317-2007《動(dòng)物源性食品中四環(huán)素類獸藥殘留量檢測(cè)方法——液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法與高效液相色譜法》方法，回收率結(jié)果見(jiàn)表3，結(jié)果顯示采用國(guó)標(biāo)法對(duì)樣品進(jìn)行前處理，4種四環(huán)素類藥物的添加回收率在70.2%～75.2%之間。

圖2 空白樣品色譜圖Fig.2Chromatogram of blank sample

圖3 加標(biāo)樣品色譜圖（100 μg/kg）Fig.3 Chromatogram of positive sample

圖4 加標(biāo)樣品色譜圖（流動(dòng)相：乙腈+三氟乙酸水溶液35+65）Fig.4 Chromatogram of positive sample

4 討論

4.1 流動(dòng)相比例的調(diào)整經(jīng)比較，流動(dòng)相乙腈+三氟乙酸水溶液（35+65）與乙腈+三氟乙酸水溶液（30+70），后者作為流動(dòng)相對(duì)目標(biāo)峰的響應(yīng)最靈敏、分離度好、出峰時(shí)間短，而且檢測(cè)系統(tǒng)壓力最低，考慮到在不影響分離度的前提下，最終選定乙腈+三氟乙酸水溶液（30+70）作為流動(dòng)相，分離效果最理想。

表2 貉子肉中四環(huán)素類藥物添加回收率試驗(yàn)結(jié)果Table 2Result of recovery test for tetracyclines in nyctereutes procyonoides tissues

表3 國(guó)標(biāo)法測(cè)定貉子肉中四環(huán)素類藥物添加回收率試驗(yàn)結(jié)果Table 3Result of national standard method for tretracyclines recovery rate in nyctereutes procyonoides tissues

4.2 樣品提取過(guò)程的簡(jiǎn)化本文將GB/T 21317-2007《動(dòng)物源性食品中四環(huán)素類獸藥殘留量檢測(cè)方法液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法與高效液相色譜法》中樣品前處理方法進(jìn)行改進(jìn)，在試樣的提取過(guò)程中，分別用15 mL、10 mL 0.1 mol/L Na2EDTA-Mcllvaine緩沖溶液冰水浴超聲提取2次，每次渦旋混合1 min，超聲提取10 min，離心過(guò)濾后凈化。該方法與GB/T 21317-2007進(jìn)行比較，結(jié)果顯示，采用國(guó)標(biāo)法測(cè)定貉子肉中四環(huán)素類藥物添加回收率試驗(yàn)中，土霉素添加回收率為70.2%～75.2%，四環(huán)素添加回收率70.2%～74.2%，金霉素添加回收率70.5%～73.7%，強(qiáng)力霉素添加回收率70.6%～74.8%；而采用改進(jìn)后的樣品前處理方法時(shí)，土霉素添加回收率為80.3%～97.4%，四環(huán)素添加回收率81.8%～96.8%，金霉素添加回收率80.4%～96.6%，強(qiáng)力霉素添加回收率80.7%～93.3%。從試驗(yàn)可以看出，采用15 mL、10 mL 0.1 mol/L Na2EDTA-Mcllvaine緩沖溶液冰水浴超聲提取2次之后，貉子肉中四環(huán)素類藥物的溶出量已趨于穩(wěn)定，因此，按照前處理步驟越少越好、操作越簡(jiǎn)單越好、耗時(shí)耗材越少越佳的原則，選擇該方法為最佳樣品前處理方法。該方法簡(jiǎn)化了樣品前處理步驟，且檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確可靠，適用于高效液相色譜法測(cè)定貉子肉中四環(huán)素類藥物殘留。