李美瑩，宋 依，王艷萍，閆伊狄，杜 航，臧靜楠，李敬雙，于 洋

（錦州醫(yī)科大學(xué)，遼寧 錦州 121001）

畜禽疾病特別是病毒性疾病仍然是阻礙養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展的瓶頸，在現(xiàn)代規(guī)?；B(yǎng)雞中，新城疫（Newcastal disease，ND）對(duì)養(yǎng)禽業(yè)危害尤為突出，是我國(guó)重點(diǎn)預(yù)防的重大傳染病之一，該病傳染性強(qiáng)，對(duì)養(yǎng)禽業(yè)造成很大的經(jīng)濟(jì)損失，目前疫苗是防治該疾病最有效的方法。國(guó)內(nèi)外學(xué)者在進(jìn)行疫苗免疫的同時(shí)，常將疫苗與免疫增強(qiáng)劑同時(shí)使用，以此達(dá)到加強(qiáng)免疫效果、延長(zhǎng)免疫時(shí)間等作用[1]。然而目前獸醫(yī)臨床上所常用的化學(xué)免疫增強(qiáng)劑藥物殘留量大，易引發(fā)公共衛(wèi)生問(wèn)題。因此，尋找殘留量小、安全性高、作用確切的藥物，已成為目前免疫增強(qiáng)劑開(kāi)發(fā)研究的新方向。中藥免疫增強(qiáng)劑對(duì)機(jī)體的細(xì)胞免疫和體液免疫功能具有增強(qiáng)或調(diào)節(jié)作用，可提高機(jī)體的抗病力和抵抗力，顯示了較強(qiáng)的增強(qiáng)機(jī)體免疫功能的作用，且中藥種類豐富，價(jià)格低廉，可克服抗生素和化學(xué)藥物的長(zhǎng)期大量使用導(dǎo)致的公共衛(wèi)生問(wèn)題[2]。因此，在傳統(tǒng)中醫(yī)理論與現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)基礎(chǔ)上，研究新型中藥免疫增強(qiáng)劑，提高疫苗的預(yù)防效果，對(duì)保障養(yǎng)禽業(yè)健康發(fā)展具有非常重要的意義。

黃芪、黨參、銀杏外種皮、淫羊藿和甘草都是我國(guó)傳統(tǒng)的中藥，廣泛應(yīng)用于臨床。黃芪是傳統(tǒng)中醫(yī)中常用的中藥之一，李時(shí)珍在《本草綱目》將其稱為“補(bǔ)藥之長(zhǎng)”，黃芪主要成分是多糖、黃酮、三萜等，具有增強(qiáng)免疫、抗腫瘤、抗病毒、延緩衰老等功效[3]。黨參為中國(guó)常用的傳統(tǒng)補(bǔ)益藥，黨參主要成分是多糖、苷類、生物堿、三萜等，具有增強(qiáng)免疫、調(diào)節(jié)血糖、延緩衰老、降血壓、抗缺氧、緩解疲勞等功效[4]。淫羊藿是一種傳統(tǒng)的補(bǔ)益中藥，淫羊藿主要成分是淫羊藿總黃酮、淫羊藿多糖、萜類化合物、淫羊藿苷、生物堿等，具有調(diào)節(jié)心血管系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、血脂、血糖等功效[5]。銀杏外種皮的主要成分是銀杏多糖、黃酮類、內(nèi)酯類、銀杏酚酸等，具有增強(qiáng)免疫功能、殺菌、抑菌、抗腫瘤、清除自由基等功效[6]。甘草中含有多糖類、黃酮類、三萜類等物質(zhì)，具有增強(qiáng)免疫、抗腫瘤、抗炎、抗病毒等功效[7]。

本研究采用黃芪、黨參、銀杏外種皮、淫羊藿和甘草（簡(jiǎn)稱黃黨銀淫甘）組方，從細(xì)胞和整體水平初步探討黃黨銀淫甘的免疫增強(qiáng)效果，為中藥免疫增強(qiáng)劑的開(kāi)發(fā)和利用提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 1日齡海蘭褐公雞雛（錦州醫(yī)科大學(xué)實(shí)習(xí)農(nóng)場(chǎng)）；雛雞配合飼料（北京農(nóng)大利生物技術(shù)有限公司）；黃芪、黨參、銀杏種皮、淫羊藿和甘草（錦州市東北大藥房，黃芪產(chǎn)地是甘肅隴西縣，黨參產(chǎn)地是山西潞州，銀杏種皮產(chǎn)地是江蘇省邳州市，淫羊藿產(chǎn)地是甘肅陜西，甘草產(chǎn)地是寧夏鹽池縣）；左旋咪唑（廣東華南藥業(yè)集團(tuán)有限公司）；磷酸鹽緩沖溶液（PBS）（廈門(mén)海標(biāo)科技有限公司）；RPMI-1640培養(yǎng)液（上海北諾生物科技有限公司）；新生胎牛血清（FBS）和四甲基偶氮唑鹽（MTT）標(biāo)準(zhǔn)品（鄭州九龍生物制品有限公司）；氯化銨（NH4Cl）（上海北諾生物科技有限公司）；三羥甲基氨基甲烷（tris）、臺(tái)盼藍(lán)和二甲基亞砜（DMSO）（北京索萊寶科技有限公司）。

1.2 主要儀器超凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司）；低速離心機(jī)（湖南赫西儀器裝備有限公司）；96孔和24孔板臺(tái)式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；倒置顯微鏡（瑞士TeCan公司）。

1.3 試劑的制備四甲基偶氮唑鹽（MTT）溶液配制：稱取MTT標(biāo)準(zhǔn)品100 mg，加入新生牛血清20 mL，配制成MTT溶液，避光保存。Tris-NH4Cl配制：稱取tris 1.3 g，NH4Cl 3.735 g，加入三蒸水溶解至500 mL，0.22 μm濾膜過(guò)濾除菌。

1.4 黃黨銀淫甘的制備黃黨銀淫甘按質(zhì)量分?jǐn)?shù)計(jì)算。即40%黃芪、20%黨參、20%銀杏外種皮、10%淫羊藿和10%甘草，用材料總質(zhì)量10倍的三蒸水浸泡24 h，用武火使藥液迅速沸騰，然后改用文火使藥液保持沸騰煎煮2 h后過(guò)濾，收集濾液，濾渣加5倍量的三蒸水用武火使藥液迅速沸騰，然后改用文火使藥液保持沸騰煎煮2 h后過(guò)濾，收集濾液，兩次濾液放入一起濃縮至含中藥材1 g/mL。

1.5 試驗(yàn)分組與飼養(yǎng)方法 1日齡健康海蘭褐公雞雛150只，設(shè)空白對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組、25、50和100 g/L黃黨銀淫甘組，每組30只。自由采食、飲水，按常規(guī)免疫程序進(jìn)行免疫。1日齡在陽(yáng)性對(duì)照組飲水中按50 mg/L加入左旋咪唑，25、50和100 g/L黃黨銀淫甘組飲水中分別按25、50和100 g/L加入黃黨淫銀甘。

1.6 黃黨銀淫甘對(duì)免疫器官指數(shù)的影響參考郝璐等[8]試驗(yàn)操作方法，28日齡時(shí)采用稱重法檢測(cè)免疫器官指數(shù)，每組隨機(jī)抽取20只雛雞，空腹稱量活重，然后頸部放血致死，取出胸腺、法氏囊和脾，稱其重量。胸腺、法氏囊和脾指數(shù)分別等于胸腺、法氏囊和脾的重量（g）除以宰前空腹活重（kg）。

1.7 黃黨銀淫甘對(duì)脾淋巴細(xì)胞增殖的影響

1.7.1 脾淋巴細(xì)胞分離培養(yǎng) 參照李敬雙等[9]試驗(yàn)操作方法，在28日齡每組隨機(jī)抽取5只雞，頸部放血致死，用75%酒精浸泡5 min，無(wú)菌操作取出脾，放于培養(yǎng)皿中，用PBS沖洗2次，置于盛有RPMI-1640培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中，用注射器拉桿柄將其磨碎，200目濾網(wǎng)過(guò)濾。收集細(xì)胞懸液，1 000 r/min離心5 min，棄上清，沉淀加3 mL Tris-NH4Cl輕輕吹勻，放置5 min去除紅細(xì)胞，1 000 r/min離心5 min，棄上清，直至紅細(xì)胞完全裂解。用完全RPMI-1640培養(yǎng)液將細(xì)胞沉淀懸起，用臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)，細(xì)胞活力達(dá)到95%以上，將細(xì)胞密度調(diào)整為5×106個(gè)/mL，制成淋巴細(xì)胞懸液，備用。

1.7.2 MTT法檢測(cè)黃黨銀淫甘對(duì)脾淋巴細(xì)胞增殖的影響 參考Yu等[10]試驗(yàn)操作方法，設(shè)空白對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組、20、40和80 g/L黃黨銀淫甘組。用96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每組均設(shè)7個(gè)復(fù)孔，每孔加入100 μL淋巴細(xì)胞懸液，再分別加入100 μL的RPMI-1640完全培養(yǎng)液，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)44 h，每孔分別加入20 μL MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，1 800 r/min離心10 min，棄上清，再每孔分別加入150 μL DMSO溶液，酶標(biāo)儀在570 nm處檢測(cè)OD值。用刺激指數(shù)表示淋巴細(xì)胞的增殖，刺激指數(shù)等于用藥組OD值除以空白對(duì)照組OD值。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間差異性用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行一維方差分析，P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃黨銀淫甘對(duì)免疫器官指數(shù)的影響

2.1.1 黃黨銀淫甘對(duì)胸腺指數(shù)的影響 黃黨銀淫甘對(duì)胸腺指數(shù)的影響見(jiàn)表1。

黃黨銀淫甘組各濃度組胸腺指數(shù)均極顯著（P＜0.01）高于空白對(duì)照組，表明黃黨銀淫甘能夠促進(jìn)胸腺的發(fā)育。且呈劑量依賴關(guān)系，胸腺指數(shù)隨藥物劑量的升高而提高，當(dāng)藥物達(dá)到一定量時(shí)隨藥物劑量的升高而降低；黃黨銀淫甘組各濃度組胸腺指數(shù)均極顯著（P＜0.01）高于陽(yáng)性對(duì)照組，進(jìn)一步說(shuō)明黃黨銀淫甘能夠促進(jìn)胸腺的發(fā)育；50 g/L黃黨銀淫甘組胸腺指數(shù)均極顯著（P＜0.01）高于25 g/L和100 g/L黃黨銀淫甘組，表明50 g/L黃黨銀淫甘組對(duì)促進(jìn)胸腺發(fā)育的效果優(yōu)于25 g/L和100 g/L黃黨銀淫甘組。

表1 黃黨銀淫甘對(duì)胸腺指數(shù)的影響（n=20）Table 1 Effect of HDYYG on Thymus Index

2.1.2 黃黨淫銀甘對(duì)法氏囊指數(shù)的影響 黃黨銀淫甘對(duì)法氏囊指數(shù)的影響見(jiàn)表2。

表2 黃黨銀淫甘對(duì)法氏囊指數(shù)的影響（n=20）Table 1 Effect of HDYYG on Bursa Index

黃黨銀淫甘各濃度組法氏囊指數(shù)均極顯著（P＜0.01）高于空白對(duì)照組，表明黃黨銀淫甘能夠促進(jìn)法氏囊的發(fā)育。且呈劑量依賴關(guān)系，法氏囊指數(shù)隨藥物劑量的升高而提高，當(dāng)藥物達(dá)到一定量時(shí)隨藥物劑量的升高而降低；50 g/L和100 g/L黃黨銀淫甘組法氏囊指數(shù)均極顯著（P＜0.01）高于陽(yáng)性對(duì)照組，25 g/L黃黨銀淫甘組顯著（P＜0.05）高于陽(yáng)性對(duì)照組，進(jìn)一步表明黃黨銀淫甘能夠促進(jìn)法氏囊的發(fā)育；50 g/L黃黨銀淫甘組法氏囊指數(shù)極顯著（P＜0.01）高于25 g/L和100 g/L黃黨銀淫甘組，表明50 g/L黃黨銀淫甘組對(duì)促進(jìn)法氏囊發(fā)育的效果優(yōu)于25 g/L和100 g/L黃黨銀淫甘組。

2.1.3 黃黨銀淫甘對(duì)脾指數(shù)的影響黃黨淫銀甘對(duì)脾指數(shù)的影響見(jiàn)表3。

表3 黃黨銀淫甘對(duì)脾指數(shù)的影響（n=20）Table 3Effect of HDYYG on Spleen Index

黃黨銀淫甘各濃度組脾指數(shù)均極顯著（P＜0.01）高于空白對(duì)照組，表明黃黨銀淫甘能夠促進(jìn)脾的發(fā)育。且呈劑量依賴關(guān)系，脾指數(shù)隨藥物劑量的升高而提高，當(dāng)藥物達(dá)到一定量時(shí)隨藥物劑量的升高而降低；黃黨銀淫甘各濃度組脾指數(shù)均極顯著（P＜0.01）高于陽(yáng)性對(duì)照組，進(jìn)一步表明黃黨銀淫甘能夠促進(jìn)脾的發(fā)育；50 g/L黃黨銀淫甘組脾指數(shù)極顯著（P＜0.01）高于25 g/L黃黨銀淫甘組，顯著（P＜0.05）高于100 g/L黃黨銀淫甘組，表明50 g/L黃黨淫銀甘對(duì)促進(jìn)脾發(fā)育的效果優(yōu)于25 g/L和100 g/L黃黨銀淫甘組。

2.2 黃黨銀淫甘對(duì)脾淋巴細(xì)胞增殖的影響黃黨銀淫甘對(duì)淋巴細(xì)胞增殖的影響見(jiàn)表4。

表4 黃黨銀淫甘對(duì)淋巴細(xì)胞增殖的影響（n=7）Table 4 Effect of HDYYG on Lymphocyte Proliferation

黃黨銀淫甘各濃度組脾淋巴細(xì)胞刺激指數(shù)均極顯著（P＜0.01）高于空白對(duì)照組，表明黃黨銀淫甘能夠刺激脾淋巴細(xì)胞的增殖。且呈劑量依賴關(guān)系，脾淋巴細(xì)胞刺激指數(shù)隨藥物劑量的升高而提高，當(dāng)藥物達(dá)到一定量時(shí)隨藥物劑量的升高而降低；50 g/L和100 g/L黃黨銀淫甘組脾淋巴細(xì)胞刺激指數(shù)均極顯著（P＜0.01）高于陽(yáng)性對(duì)照組，25 g/L黃黨銀淫甘組脾淋巴細(xì)胞刺激指數(shù)顯著（P＜0.05）高于陽(yáng)性對(duì)照組，進(jìn)一步表明黃黨銀淫甘能夠刺激脾淋巴細(xì)胞的增殖。50 g/L黃黨銀淫甘組脾淋巴細(xì)胞刺激指數(shù)極顯著（P＜0.01）高于25 g/L和100 g/L黃黨銀淫甘組，表明50 g/L黃黨銀淫甘組對(duì)刺激脾淋巴細(xì)胞增殖效果優(yōu)于25 g/L和100 g/L黃黨銀淫甘組。

3 討論

胸腺和法氏囊是雞的中樞淋巴器官，又稱初級(jí)免疫器官，是淋巴細(xì)胞等免疫細(xì)胞發(fā)生、分化和成熟的場(chǎng)所。胸腺是T細(xì)胞分化和成熟的場(chǎng)所，法氏囊是B細(xì)胞分化和成熟的場(chǎng)所。脾是雞的外周淋巴器官，又稱次級(jí)免疫器官，是成熟的T細(xì)胞和B細(xì)胞棲居、增殖和對(duì)抗抗原刺激產(chǎn)生免疫應(yīng)答的場(chǎng)所。脾臟是機(jī)體最大的免疫器官，含有大量免疫細(xì)胞，是體液免疫和細(xì)胞免疫的重要部位，是產(chǎn)生抗體的主要器官[11]。淋巴細(xì)胞在免疫應(yīng)答過(guò)程中起核心作用，淋巴細(xì)胞是免疫活性細(xì)胞，只有接受抗原刺激后才能分化增殖，產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答，產(chǎn)生抗體或細(xì)胞因子[12]。淋巴細(xì)胞增殖是檢測(cè)淋巴細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)活性的重要指標(biāo)[13]。

Rivas等[14]研究表明脾、胸腺和法氏囊等免疫器官的重量可用于評(píng)價(jià)雛雞的免疫狀態(tài)。Grossman[15]研究免疫器官指數(shù)對(duì)機(jī)體免疫力的影響，結(jié)果顯示免疫器官指數(shù)與免疫功能強(qiáng)弱呈正相關(guān)。本研究在28日齡雞胸腺、法氏囊和脾臟指數(shù)及脾淋巴細(xì)胞增殖均顯著高于空白對(duì)照組，提示黃黨銀淫甘能刺激胸腺中T細(xì)胞和法氏囊中B細(xì)胞分化和成熟，使胸腺和法氏囊重量增大，提高胸腺和法氏囊指數(shù)；黃黨銀淫甘能夠誘導(dǎo)脾中T細(xì)胞和B細(xì)胞活化和增殖，使脾的重量增大，提高脾指數(shù)；活化的淋巴細(xì)胞產(chǎn)生抗體或細(xì)胞因子，能夠增強(qiáng)機(jī)體的體液免疫和細(xì)胞免疫。與文獻(xiàn)結(jié)果相一致，但其作用機(jī)制還有待于進(jìn)一步深入研究。

4 結(jié)論

黃黨銀淫甘可通過(guò)促進(jìn)雞胸腺、法氏囊和脾發(fā)育，刺激脾淋巴細(xì)胞增殖來(lái)提高機(jī)體的免疫功能。