胰腺癌是治療效果最差的惡性腫瘤之一，針對(duì)胰腺癌的治療，無論是手術(shù)方式的改進(jìn)，還是新型藥物的問世，都未能在根本上改善胰腺癌患者的預(yù)后，其5年生存率徘徊在5%左右［1-4］。胰腺癌的發(fā)生、發(fā)展是一個(gè)極其復(fù)雜的過程，是多種因素共同作用的結(jié)果。85%以上的胰腺癌來源于胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞，因此研究導(dǎo)管腺癌對(duì)胰腺癌的診療意義較大［1-3］；胰腺癌的發(fā)病率近年來呈上升趨勢，據(jù)估計(jì)，2017年美國新發(fā)53 670例，死亡人數(shù)將達(dá)到43 090例［1］。根治性手術(shù)切除作為唯一可治愈胰腺癌的方法，在胰腺癌患者中的比例很低［2］。胰腺癌的高死亡率和其早期難以發(fā)現(xiàn)、術(shù)后極易復(fù)發(fā)尤其是缺乏有效的治療有關(guān)，而突破診治胰腺癌的關(guān)鍵在于深入探究胰腺癌發(fā)生發(fā)展的機(jī)制，針對(duì)相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行有效的治療。

酪氨酸蛋白激酶-7（protein tyrosine kinase-7，PTK7）也被稱為結(jié)腸癌激酶-4（colon carcinoma kinase-4，CCK4），是一種在人體內(nèi)由PTK7基因編碼的具有催化活性的受體酪氨酸激酶，包括七個(gè)細(xì)胞外免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域，一個(gè)跨膜區(qū)域，一種黃化膜區(qū)域和一個(gè)催化惰性細(xì)胞質(zhì)的酪氨酸激酶域［5］。PTK7具有多種生物學(xué)功能，包括胚胎形成管的生成［6］和多能干細(xì)胞功能［7］，還有其在惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的具有爭議性的功能和作用。有研究報(bào)道，PTK7在多種實(shí)體腫瘤中有較高的表達(dá)水平，這些腫瘤包括結(jié)直腸腫瘤［8］、肝細(xì)胞癌［9］、肝內(nèi)膽管癌［10］、前列腺癌［11］、胃癌［12］、乳腺癌［13］、非小細(xì)胞肺癌［14］、口腔鱗癌［15］和食管鱗癌［16］等，且PTK7的異常高表達(dá)常提示不良的預(yù)后。然而，PTK7在某些腫瘤中低表達(dá)，如透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌［17］、黑色素瘤［18］和上皮性卵巢癌［19］。還有類似的研究報(bào)道，發(fā)現(xiàn)PTK7在乳腺癌中細(xì)胞株中表達(dá)水平下降［20］，以及在肺癌中PTK7通過抑制ERK和AKT的磷酸化而發(fā)揮抑癌作用［21］。此外，還有研究結(jié)果證實(shí)PTK7陰性表達(dá)的生存預(yù)后比陽性表達(dá)結(jié)果更差，從而提示PTK7可能在卵巢漿液性癌中是一種腫瘤抑制因子［22］。綜上所述，上述所有的研究結(jié)果表明，在不同腫瘤中PTK7蛋白的表達(dá)水平和生物學(xué)功能是完全不同的，其具體作用取決于特定的腫瘤和相關(guān)的機(jī)制。迄今為止，胰腺導(dǎo)管腺癌中PTK7的表達(dá)情況還不明確。

本研究通過回顧性分析天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院2011年5月至2016年1月接受胰腺癌根治手術(shù)治療的85例胰腺導(dǎo)管腺癌患者的臨床病理特征與隨訪資料，應(yīng)用免疫組織化學(xué)的方法檢測胰腺導(dǎo)管腺癌組織中蛋白酪氨酸激酶-7蛋白的表達(dá)，分析和探究PTK7蛋白在胰腺導(dǎo)管腺癌組織中的表達(dá)及其臨床意義和價(jià)值，從而為胰腺癌患者的靶向治療提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

收集2011年5月至2016年1月期間天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院85例胰腺導(dǎo)管腺癌患者行根治性手術(shù)切除的組織標(biāo)本，分析其臨床病理資料?；颊呔懈涡允中g(shù)切除治療，全部病例均病理證實(shí)為胰腺導(dǎo)管腺癌，術(shù)前未經(jīng)化療或放療，均具有完整的病例資料。收集患者的一般臨床資料，包括性別、年齡、腫瘤位置、腫瘤大小、手術(shù)方式和CA19-9水平等。85例患者年齡39～58歲，中位年齡（50.6±4.93）歲；其中男性44例，女性41例；腫瘤大?。骸? cm者25例，＞2 cm者60例；組織學(xué)分化程度：中高分化腺癌32例，中低分化腺癌53例；腫瘤分期：Ⅰ期6例，Ⅱ期50例，Ⅲ期29例，本組入選無Ⅳ期病例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移：陰性者37例，陽性者48例；脈管內(nèi)瘤栓者46例。

比較分析不同組患者的臨床病理學(xué)特征，包括：分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、血管受侵、脈管內(nèi)瘤栓、神經(jīng)受侵、腫瘤分期。隨訪：以電話和查閱病歷的方式隨訪。隨訪起始時(shí)間為手術(shù)時(shí)間，隨訪截止時(shí)間為2017年12月或患者死亡時(shí)間。統(tǒng)計(jì)學(xué)比較兩組患者一般臨床資料和臨床病理學(xué)資料及分析預(yù)后影響因素。

1.2 細(xì)胞和試劑

胰腺癌細(xì)胞系PANC-1（人類胰腺腺癌）和BXPC-3（胰腺的原發(fā)性腺癌）購自美國ATCC。兩種細(xì)胞前者用DMEM培養(yǎng)，后者用Roswell Park Memorial Institute 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。所有細(xì)胞培養(yǎng)介質(zhì)中含10%胎牛血清，100 μL/mL青霉素和鏈霉素，在37°C含5%二氧化碳的細(xì)胞孵育箱中培養(yǎng)細(xì)胞。PTK7購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司（Catalog No：bs-18542R），為兔抗人多克隆抗體，實(shí)驗(yàn)的稀釋濃度為1:600。免疫組織化學(xué)二步法檢測試劑盒購自北京中衫金橋生物技術(shù)有限公司（PV6002，通用型二抗）。行Western blot的抗體anti-β-actin（1:1 000稀釋，ab8226，Abcam plc，Cambridge，UK），抗體 anti-Ki67（1:1 000稀釋，ab16667，Abcam plc，Cambridge，UK），抗體 anti-proliferating cell nuclear antigen（PCNA）（1:500稀釋，ab29，Abcam plc，Cambridge，UK）。shRNA 1 for PTK7（NM_152881）購自 ViGene Biosciences公司，序列如下：AACATCAAATGGATTGAGGCAGG。Lipofectamine?2000 Transfection Reagent購自Thermo Fisher Scientific，貨號(hào)：11668027。

1.3 方法

1.3.1 免疫組織化學(xué)檢測 胰腺導(dǎo)管腺癌組織進(jìn)行福爾馬林固定，石蠟包埋，標(biāo)本進(jìn)行5 μm切片，行PTK7免疫組織化學(xué)染色。免疫組織化學(xué)采用SP二步法，DAB顯色。染色切片于顯微鏡高倍鏡下（400倍）隨機(jī)計(jì)數(shù)10個(gè)視野，計(jì)數(shù)100個(gè)腫瘤細(xì)胞，根據(jù)腫瘤細(xì)胞陽性染色百分率和染色強(qiáng)度綜合評(píng)價(jià)免疫組織化學(xué)結(jié)果。

1.3.2 RNAi轉(zhuǎn)染 提前將細(xì)胞培養(yǎng)液換成不含血清培養(yǎng)基；將stealth RNAi和Lipofectamine 2000分別混勻后室溫靜置孵育，后混合兩者，加入到細(xì)胞培養(yǎng)液中。

1.3.3 Western blot 裂解細(xì)胞后測定蛋白濃度，制膠，上樣，電泳，電轉(zhuǎn)膜，封閉，將適宜濃度的一抗加到PVDF膜上，4℃過夜后，用TBST洗凈，將二抗用1%BSA稀釋到適合濃度（1:5 000）加到膜上，室溫下孵育1 h，后TBST搖床上洗滌3次，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法顯色。

1.3.4 MTT細(xì)胞存活實(shí)驗(yàn) 收集不同組別的對(duì)數(shù)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度為50 000個(gè)/mL，每孔加入100 μL細(xì)胞懸液（每孔5 000個(gè)細(xì)胞），保證細(xì)胞密度均勻，細(xì)胞放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)一定時(shí)間后每孔加入20 μL-MTT（5 mg/mL），培養(yǎng)3～4 h。終止培養(yǎng)，小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液。每孔加入150 μL DMSO 37℃溫箱孵育10 min，之后用酶標(biāo)儀檢測OD570 nm的各孔的吸光度值。

1.3.5 克隆形成實(shí)驗(yàn) 兩種細(xì)胞分別取相等數(shù)目加含有血清的培養(yǎng)液，每孔中大約放入300個(gè)細(xì)胞，使其均勻分布；培養(yǎng)大約兩周后取出6孔細(xì)胞培養(yǎng)板放在倒置顯微鏡下觀察有＞50個(gè)細(xì)胞的克隆形成；加結(jié)晶紫染色30 min左右后緩慢洗凈照相。

1.3.6 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果的判定 PTK7蛋白表達(dá)主要表達(dá)于胰腺導(dǎo)管腺癌腫瘤細(xì)胞的胞漿，也有輕微的不同程度的胞核著色，呈棕黃色顆粒狀。結(jié)果判定如下，陽性腫瘤細(xì)胞數(shù)＜10%記0分；腫瘤細(xì)胞陽性百分率為10%～25%記1分；腫瘤細(xì)胞陽性百分率為25%～50%記2分；腫瘤細(xì)胞陽性百分率＞50%記3分；同時(shí)對(duì)陽性著色的腫瘤細(xì)胞的漿、核染色強(qiáng)度進(jìn)行評(píng)價(jià)：陰性記0分，弱陽性記1分，中度陽性記2分；將陽性細(xì)胞百分率分值和染色強(qiáng)度分值之積的分值作為最后計(jì)分，計(jì)分范圍為0～6分。實(shí)際結(jié)果判斷為高表達(dá)（4～6分）或低表達(dá)（0～3分）。每個(gè)病例觀察10個(gè)高倍視野，在不知病理分級(jí)與臨床資料的情況下由兩位經(jīng)驗(yàn)豐富的病理科醫(yī)師讀片，雙盲法判斷結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。兩組計(jì)量資料的比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料的比較采用χ2檢驗(yàn)。生存率的計(jì)算采用Kaplan-Meier法，生存曲線的比較采用Log-rank檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PTK7在胰腺導(dǎo)管腺癌組織中的表達(dá)

85例原發(fā)性胰腺導(dǎo)管腺癌組織中PTK7蛋白有60例（78.9%）高表達(dá)，85例癌旁組織（距離腫瘤組織3～5 mm處的胰腺正常組織）中45例（52.9%）呈高表達(dá)，免疫組織化學(xué)的染色結(jié)果見圖1和圖2。胰腺導(dǎo)管腺癌與癌旁組織陽性率比較（χ2=5.604，P=0.018＜0.05），其表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 PTK7在胰腺導(dǎo)管腺癌組織中的表達(dá)

圖2 PTK7在胰腺導(dǎo)管腺癌癌旁組織中的表達(dá)

2.2 胰腺導(dǎo)管腺癌組織PTK7的表達(dá)與臨床病理特征和預(yù)后的相關(guān)性

PTK7的異常表達(dá)與胰腺導(dǎo)管腺癌分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和脈管內(nèi)瘤栓相關(guān)（P＜0.05，表1），與患者的性別、年齡、分化程度、腫瘤大小無關(guān)?；颊哳A(yù)后生存分析結(jié)果，PTK7均與患者預(yù)后明顯相關(guān)（P＜0.05，圖3）：PTK7高表達(dá)的胰腺導(dǎo)管腺癌患者術(shù)后中位生存期明顯短于PTK7低表達(dá)的胰腺導(dǎo)管腺癌患者（11.50±0.870）個(gè)月vs.（20.90±2.168）個(gè)月。

2.3 shRNA干擾PTK7后抑制細(xì)胞增殖能力

通過shRNA干擾PTK7后建立細(xì)胞穩(wěn)系，行Western blot驗(yàn)證PTK7的蛋白表達(dá)水平降低了（圖4A，P＜0.05），且MTT和克隆形成結(jié)果顯示，shRNA實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組細(xì)胞存活數(shù)顯著減少，克隆形成數(shù)顯著減少（圖4B，P＜0.05），增殖相關(guān)蛋白Ki-67和PCNA的表達(dá)水平顯著降低（圖4C和4D，P＜0.05）。

圖3 PTK7與胰腺導(dǎo)管腺癌患者術(shù)后預(yù)后相關(guān)性分析

表1 胰腺導(dǎo)管腺癌PTK7表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

圖4 shRNA干擾PTK7后抑制胰腺癌細(xì)胞增殖

3 討論

有關(guān)PTK7在不同腫瘤中的表達(dá)，多項(xiàng)研究報(bào)道不同的觀點(diǎn)與結(jié)論，這提示同一基因可能在不同類型的腫瘤中具有完全不同的作用。最新的一項(xiàng)薈萃分析通過匯總數(shù)據(jù)的元分析，提供PTK7與惡性腫瘤風(fēng)險(xiǎn)、臨床參數(shù)和DFS等的相關(guān)證據(jù)，結(jié)果顯示高表達(dá)的PTK7可能促進(jìn)惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展［5］：PTK7在惡性腫瘤組織中呈現(xiàn)高水平的異常表達(dá)，且這種高水平表達(dá)提示腫瘤組織學(xué)級(jí)別水平高，且提示較短的無病生存率和更差的總生存率。與大多既往研究的結(jié)果基本一致，本項(xiàng)研究表明PTK7在胰腺導(dǎo)管腺癌中呈現(xiàn)異常高表達(dá)，且這種異常高表達(dá)和胰腺癌分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和脈管內(nèi)瘤栓相關(guān)，提示了預(yù)后不良。有研究指出，在多種腫瘤組織中PTK7表達(dá)情況的相關(guān)性研究，選用的對(duì)照組的組織（正常組織、癌旁組織、炎性組織或者良性腫瘤組織等）不盡相同，因此可能存在結(jié)論的不一致性［5］。例如，有研究報(bào)道應(yīng)用正常結(jié)直腸黏膜和腺瘤為對(duì)照［8］。Zhang等［10］用了良性前列腺增生作為對(duì)照組。Jin等［11］使用正常的膽道組織作為對(duì)照。為了評(píng)價(jià)PTK7在腫瘤發(fā)生過程中的作用，有研究指出，對(duì)照組不能選擇從腺瘤或炎性增生中獲得的組織，而應(yīng)該選擇正常組織，這樣才能進(jìn)一步分析腫瘤發(fā)生過程中PTK7水平的變化。本研究應(yīng)用癌旁正常組織作為對(duì)照，雖然沒有完全應(yīng)用正常胰腺組織，但也能反映腫瘤發(fā)生前后PTK7水平的變化情況，并且在一定程度上消除或者減少了個(gè)體和組織微環(huán)境的差異，因此結(jié)果是可信和有價(jià)值的。此外，Asad等［19］發(fā)現(xiàn)PTK7在92.86%（13/14）正常輸卵管上皮和45.10%（92/204）上皮性卵巢腫瘤組織中表達(dá)陽性，該研究不同于既往研究的結(jié)果，是唯一報(bào)道PTK7在正常組織中比在腫瘤組織呈現(xiàn)更高比例的陽性表達(dá)；雖然其中的原因尚不清楚，但這一發(fā)現(xiàn)提示PTK7在維持組織功能方面可能也起著重要作用。并且，既往的薈萃分析研究結(jié)果表明PTK7高表達(dá)提示更高的癌癥風(fēng)險(xiǎn)、更高的組織學(xué)分級(jí)、更低的總生存率和無病生存率［5］，和本研究的結(jié)果一致。進(jìn)一步查閱文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)與PTK7表達(dá)水平低的腫瘤細(xì)胞相比較，其表達(dá)水平高的腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)出更強(qiáng)的增殖、DNA合成、入侵和遷移能力［5，16］。然而，Golubkov等［23-25］報(bào)道 PTK7則能抑制癌細(xì)胞的侵襲和遷移。目前，PTK7在不同腫瘤中的這些不同功能和機(jī)制仍不明確。本研究結(jié)果顯示，在胰腺癌細(xì)胞系中，PTK7能通過調(diào)節(jié)增殖相關(guān)因子Ki-67和PCNA的水平進(jìn)而促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞的增殖，并且其異常高表達(dá)提示不良的預(yù)后。這可能提示，在胰腺癌組織中PTK7通過促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖的機(jī)制參與胰腺癌的發(fā)生發(fā)展，產(chǎn)生了一系列的生物學(xué)效應(yīng)，進(jìn)而影響了胰腺癌分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和脈管內(nèi)瘤栓，從而導(dǎo)致患者預(yù)后不良。

另外，在PTK7和惡性腫瘤機(jī)制的關(guān)系，也有一些有價(jià)值的線索：Golubkov等［25］發(fā)現(xiàn)全長膜PTK7通過下調(diào)肌凝蛋白的鏈磷酸化來降低纖維肉瘤HT1080細(xì)胞的遷移效率；然而，PTK7針對(duì)基質(zhì)金屬蛋白酶的蛋白水解片段則能促進(jìn)HT1080細(xì)胞的侵襲。PTK7在癌細(xì)胞通過蛋白酶的裂解，形成各種消化片段；與完整的PTK7相比，這些蛋白水解產(chǎn)物發(fā)揮不同的功能［5］。最近，有幾項(xiàng)研究試圖解釋清楚PTK7在不同類型惡性腫瘤中的明確作用和機(jī)制：Shin等［16］發(fā)現(xiàn)PTK7通過激活A(yù)P-1和NF-κB增加細(xì)胞的侵襲能力；有研究發(fā)現(xiàn)在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中，PTK7通過調(diào)節(jié)TGF-b/Smad signaling信號(hào)通路來抑制細(xì)胞增殖和致瘤潛能，并誘導(dǎo)CD44細(xì)胞凋亡［26］。但是，這些研究都是將全長的PTK7作為一個(gè)整體進(jìn)行分析，而忽視了PTK7的不同片段蛋白水解產(chǎn)物的不同作用。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，PTK7過度表達(dá)與胰腺導(dǎo)管腺癌的惡性臨床病理特征相關(guān)，提示更差的總體生存率和更短的無病生存時(shí)間，表明PTK7可以作為預(yù)測胰腺導(dǎo)管腺癌不良預(yù)后的一種生物標(biāo)志物。并且，體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)PTK7能通過調(diào)節(jié)增殖的相關(guān)因子來促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞增殖。然而，需要在體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步研究其相關(guān)的機(jī)制。相信隨著對(duì)其作用機(jī)制的深入研究，PTK可能會(huì)成為胰腺導(dǎo)管腺癌治療的一個(gè)新靶點(diǎn)。