張婧 薛麗 黨雅梅 趙鳳輝 李紅玲

T細胞淋巴瘤（T-cell lymphoma，TCL）是非霍奇金淋巴瘤（non-Hodgkin's lymphoma，NHL）的一種類型，發(fā)病率約占NHL的10%［1］，具有種族及地域特性、異質(zhì)性、侵襲性強、惡性程度高和療效差的特點。目前，關(guān)于TCL的發(fā)病機制尚未明確。據(jù)文獻報道，氧化/抗氧化失衡在淋巴瘤發(fā)生、發(fā)展中扮演重要的角色［2］，其中醌氧化還原酶1［NAD（P）H：quinine oxidoreductase 1，NQO1］與血紅素加氧酶-1（heme oxygenase-1，HO-1）是抗氧化應(yīng)激相關(guān)的蛋白。NQO1是機體內(nèi)一種調(diào)節(jié)氧化還原狀態(tài)的胞質(zhì)酶，在維持細胞穩(wěn)態(tài)中具有重要作用［3］；Lajin等［4］研究發(fā)現(xiàn)，NQO1蛋白第6外顯子（C609T）的多態(tài)性通過改變蛋白質(zhì)編碼氨基酸的序列，可增加細胞發(fā)生癌變的幾率；多項研究結(jié)果顯示，NQO1蛋白異常表達與乳腺癌、黑色素瘤、胰腺癌等多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，為臨床預(yù)后不良的獨立風險因素［5-7］。HO-1為血紅素分解代謝的限速酶，誘導(dǎo)血紅素降解為膽綠素/膽紅素，一氧化碳（CO）和Fe2+；HO-1具有抗炎、抗氧化應(yīng)激、抑制細胞凋亡等作用［8］；國外多項研究表明，HO-1在多種腫瘤細胞中高表達，且與腫瘤的發(fā)生發(fā)展、化療抵抗、腫瘤轉(zhuǎn)移和預(yù)后不良密切相關(guān)［9］。目前，國內(nèi)外有關(guān)NQO1和HO-1的表達與TCL臨床參數(shù)間的研究尚未見報道。本研究探討NQO1與HO-1在TCL中的表達及其臨床病理特征的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 病例資料

收集2012年12月至2018年5月甘肅省人民醫(yī)院經(jīng)病理活檢首次確診的61例TCL患者的臨床資料，其中男性34例，女性27例，中位年齡47.0歲。根據(jù)2016年世界衛(wèi)生組織（WHO）淋巴組織腫瘤分類，病理分型包括：結(jié)外NK/T細胞淋巴瘤-鼻型（extranodal NK/T-cell lymphoma，nasal type，ENKTL）33例、ALK陰性間變性大細胞淋巴瘤（anaplastic large cell lymphoma，ALK-negative，ALK-ALCL）8例、ALK陽性間變性大細胞淋巴瘤（anaplastic large cell lymphoma，ALK-positive，ALK+ALCL）6例、外周T細胞淋巴瘤-非特指型（peripheral T-cell lymphoma，not otherwise specified，PTCL-NOS）7例、血管免疫母細胞性T細胞淋巴瘤（angioimmunoblastic lymphadenopathy，AITL）4例，腸病相關(guān)T細胞淋巴瘤（enteropathy type T cell lymphoma，EATL）2例，皮下脂膜炎樣T細胞淋巴瘤（subcutaneous panniculitis like T cell lymphoma，SPTCL）1例。同期取20例反應(yīng)性增生淋巴組織作為對照。入組患者均未行放化療等抗腫瘤治療，診斷依據(jù)《淋巴瘤病理診斷》標準［10］。標本經(jīng)10%中性福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)切片，片厚4 μm，經(jīng)H&E染色后病理活檢確診。

1.2 方法

采用免疫組織化學(xué)SP兩步法檢測TCL中NQO1和HO-1的表達。兔抗人NQO1多克隆抗體、兔抗人HO-1多克隆抗體均購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司，檢測步驟嚴格按說明書操作，NQO1和HO-1抗體的稀釋濃度分別為1∶400和1∶800。結(jié)果判定：每張切片隨機觀察5個高倍視野（×400）行細胞計數(shù)，陽性結(jié)果以陽性細胞百分率與染色強度之積進行判定（由兩位經(jīng)驗豐富的病理科醫(yī)師采用雙盲法閱片）。陽性細胞百分率：0～5%計0分，6%～25%計1分，26%～50%計2分，51%～75%計3分，76%～100%計4分。細胞染色強度：未染色計0分，弱染色（淡黃色）計1分，中度染色（棕黃色）計2分，強染色（棕褐色）計3分。兩項得分乘積：0分為陰性；1～12分為陽性，其中1～4分為弱陽性（+），5～8分為中度陽性（++），9～12分為強陽性（+++）。本研究全部患者均知情同意并獲甘肅省人民醫(yī)院倫理委員會批準。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。定性資料采用χ2檢驗或Fisher確切概率法，Spearman等級相關(guān)檢驗分析兩樣本間相關(guān)性。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 免疫組織化學(xué)法檢測TCL中NQO1和HO-1的表達

NQO1和HO-1的陽性表達主要位于細胞質(zhì)，散見于細胞核，呈淡黃色或棕褐色顆粒（圖1、2），在TCL組織中表達的陽性率分別為31.15%（19/61）、65.57%（40/61），分別高于對應(yīng)的反應(yīng)性增生淋巴組織5.00%（1/20）、10.00%（2/20），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，表1；P＜0.01，表2）。

圖1 免疫組織化學(xué)法檢測NQO1的表達（SP法×400）

圖2 免疫組織化學(xué)法檢測HO-1的表達（SP法×400）

2.2 NQO1和HO-1的表達與TCL患者臨床病理特征的關(guān)系

NQO1與HO-1的表達均與TCL患者的臨床分期、B癥狀有關(guān)（P＜0.05），且臨床分期越晚（Ⅰ～Ⅱ期vs.Ⅲ～Ⅳ期），表達的陽性率越高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；存在骨髓侵犯的患者，HO-1的陽性表達率高于無骨髓侵犯的患者（P＜0.05）；二者表達與患者的性別、年齡、LDH水平及病理分型無關(guān)（P＞0.05，表3）。

2.3 TCL組織中NQO1和HO-1表達的關(guān)系

Spearman相關(guān)分析統(tǒng)計顯示，TCL中NQO1與HO-1蛋白的表達存在相關(guān)性（r=0.264，P＜0.05，表4）。

表1 NQO1在TCL組和對照組中的表達 例（%）

表2 HO-1在TCL組和對照組中的表達 例（%）

表3 61例TCL患者臨床病理特征與NQO1和HO-1表達的關(guān)系 例

3 討論

表4 NQO1和HO-1在TCL中陽性表達的相關(guān)性 例

TCL是一組源自T淋巴細胞的異質(zhì)性疾病，為NHL的罕見類型，與B細胞NHL相比，TCL具有更高的侵襲性與惡性程度。TCL經(jīng)典治療方案（CHOP方案為環(huán)磷酰胺+阿霉素+長春新堿+強的松）的完全緩解率可達24%～40%［11］，但多數(shù)患者因?qū)熋舾行圆钪率箯?fù)發(fā)、耐藥頻發(fā)，除了分期較早、腫瘤負荷少的某些類型和ALK+ALCL預(yù)后較好之外（5年生存率約為71%～100%），其余的5年生存率不足30%。有研究報道，氧化/抗氧化失衡可能與淋巴瘤的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)［2］，其中NQO1和HO-1在TCL中的表達及其臨床資料間的關(guān)系未見報道。因此，本研究從氧化應(yīng)激的角度初步探討NQO1和HO-1對TCL發(fā)生、發(fā)展的作用及意義。

NQO1是一種黃素酶，由Siegel等［12］于1958年首次報道，此黃素蛋白在人體組織中廣泛存在，主要表達于細胞質(zhì)中。NQO1以NAD（P）H為受體，催化醌類及其衍生物，避免其損傷細胞并保護機體免受致癌物作用。目前，較多的研究集中于NQO1基因多態(tài)性與環(huán)境等多因素的交互作用致使大腸癌［13］、前列腺癌［14］、急性白血?。?5］等惡性腫瘤的易感性增加。越來越多的研究表明，NQO1在非小細胞肺癌、胰腺癌、腎上腺癌、甲狀腺癌［16］，乳腺癌［17］，卵巢癌和子宮內(nèi)膜癌［18］等多種實體腫瘤中過表達。Dinkovakostova等［19］研究表明，NQO1可以保護細胞免受細胞毒性醌的侵襲，但是NQO1的過表達與惡性腫瘤進展呈正相關(guān)。目前，尚未明確NQO1與TCL之間的關(guān)系。本研究顯示，與對照組相比，TCL組NQO1表達的陽性率較高，且主要位于細胞質(zhì)中，這與既往NQO1在多種惡性腫瘤中高表達的研究結(jié)果相一致，提示NQO1可能參與TCL的進展。進一步分析NQO1高表達率與TCL患者臨床病理特征的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)NQO1的過表達與患者的臨床分期和B癥狀密切相關(guān)，即NQO1高表達的患者具有臨床分期晚和有全身侵犯傾向的特點。Li等［20］研究發(fā)現(xiàn)，NQO1可當作腫瘤選擇性的靶點，并強調(diào)其不受抑癌基因，如p53或Rb的控制及細胞周期的影響；同時提出NQO1是人和小鼠胰腺癌抗腫瘤作用中的關(guān)鍵因素，監(jiān)測NQO1酶的活性并治療NQO1過表達的患者可能獲取最大療效并產(chǎn)生較少的不良反應(yīng)。Yang等［21］研究結(jié)果顯示，NQO1可作為乳腺癌初步診斷及預(yù)后預(yù)測評估的生物學(xué)標志物。因此，推測NQO1的持續(xù)異常激活可能促進TCL的發(fā)生發(fā)展。

血紅素加氧酶（heme oxygenase，HO）是血紅素分解代謝中的限速酶，有3種同工酶：HO-1、HO-2和HO-3，其中HO-1為誘導(dǎo)型，又稱“熱休克蛋白32（heat shock proteins 32，HSP32）”，主要分布于肝、脾、骨髓等組織［22］。HO-1基因的調(diào)控可通過下述幾種信號通路介導(dǎo)：氧化應(yīng)激激活Nrf2/HO-1軸誘導(dǎo)HO-1的表達［23］、絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）途徑中ERK和P38的誘導(dǎo)［24］以及NO依賴性的機制［25］等。Loboda等［23］研究表明，在內(nèi)、外源性有害刺激作用下，HO-1作為體內(nèi)重要的抗氧化酶，通過其酶解產(chǎn)物（膽紅素、CO）發(fā)揮抗氧化、抑制細胞凋亡、調(diào)節(jié)炎癥、促進血管生成等保護作用。而近些年研究發(fā)現(xiàn)，HO-1具有“雙重作用”［26］，在正常細胞中，HO-1的表達可防止DNA受損，避免腫瘤發(fā)生；HO-1的過度激活，可增加瘤細胞的抗凋亡能力并促進瘤細胞的生長，刺激腫瘤血管生成，誘導(dǎo)瘤細胞侵襲、遷移。國外研究顯示，HO-1在結(jié)腸癌、胃癌、肺癌、膀胱癌、乳腺癌、前列腺癌和膠質(zhì)瘤等多種瘤細胞中高表達，且與腫瘤的發(fā)生發(fā)展、化療抵抗、腫瘤轉(zhuǎn)移及預(yù)后不良密切相關(guān)［9］。在本研究中，65.57%的TCL中HO-1蛋白過表達，這與國內(nèi)外HO-1在多種實體腫瘤中過表達的研究報道一致［9］，且HO-1表達與腫瘤的臨床分期、B癥狀、骨髓侵犯密切相關(guān)，提示HO-1可能增強TCL細胞的侵襲力，促進TCL的惡性進展與腫瘤轉(zhuǎn)移。

通過分析TCL組織中NQO1和HO-1的表達水平發(fā)現(xiàn)，二者間存在良好的相關(guān)性（r=0.264，P＜0.05），考慮可能在調(diào)控二者表達的多種機制之間存在交叉，從而協(xié)同發(fā)揮作用。研究顯示，NQO1和HO-1存在共同的誘導(dǎo)因子，如Nrf2可通過Nrf2/Keap1信號通路誘導(dǎo)其表達［22］，但二者之間的表達是否可以直接相互影響，尚待深入研究。本研究的不足之處在于納入的部分患者隨訪時間較短，未能進一步開展生存分析及預(yù)后評估。因此，NQO1和（或）HO-1的高表達是否提示TCL患者的不良預(yù)后，還有待深入研究。而且，本研究為回顧性分析，樣本量相對較少，存在局限性，需要進一步前瞻性研究和長期隨訪來驗證研究結(jié)果，從而闡明NQO1和HO-1在TCL發(fā)生發(fā)展中的分子機制。

綜上所述，NQO1和HO-1作為重要的抗氧化應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)的蛋白，二者在TCL組織中高表達，其中NQO1與TCL臨床分期、B癥狀有關(guān)，HO-1和TCL的臨床分期、骨髓侵犯、B癥狀密切相關(guān)，提示NQO1和HO-1可能參與TCL的發(fā)生、發(fā)展過程。