孟紅巖，郭 鶯，林文珍，林志楷，劉黎卿

(福建省亞熱帶植物研究所，福建省亞熱帶植物生理生化重點實驗室，福建 廈門 361006)

【研究意義】牛樟芝(Antrodiacamphorata)別名牛樟菇、樟內(nèi)菇或紅樟菇等，隸屬于擔(dān)子菌綱，多孔菌目，多孔菌科，薄孔菌屬，是 20世紀90年代在臺灣發(fā)現(xiàn)的食(藥)用真菌，有“森林紅寶石”的美稱。牛樟芝具有多種生理活性成分，包括多糖類、固醇類、三萜類、腺苷類、不飽和脂肪酸和免疫蛋白等[1-3]。多項研究證實，牛樟芝具有解酒保肝、消除腫瘤、補腎強心、益胃整腸、強化免疫、鎮(zhèn)痛抗菌等作用，特別在治療肝癌和子宮頸癌方面具有顯著功效[4-10]?！厩叭搜芯窟M展】野生牛樟芝只生長在臺灣百年以上的牛樟(Cinnamomumkanehirae)樹干腐朽之心材內(nèi)壁，或枯死倒伏的牛樟樹潮濕表面。臺灣學(xué)者張東柱認為牛樟木材精油會促進牛樟芝菌絲生長，同時抑制其它可能的競爭真菌，這有助于牛樟芝在牛樟木材上建立群落，但牛樟芝出菇時，牛樟精油并非必需[11]。野生牛樟芝生長速度極為緩慢，數(shù)量稀缺價格昂貴，現(xiàn)多以人工培養(yǎng)的方式來取代，并藉由不同培養(yǎng)方式來達到提高菌絲體產(chǎn)量的目的。牛樟芝的理論研究在臺灣開展的相對較多，大陸亦逐漸興起。臺灣屏東科技大學(xué)的施玉蘭在PDA(馬鈴薯葡萄糖瓊脂)培養(yǎng)基中添加的牛樟木屑浸出液會促進牛樟芝菌絲的生長[12]。南臺科技大學(xué)的鄭維仁探討了牛樟、冇樟(Cinnamomummicranthum)和樟樹(Cinnamomumcamphora)的木屑熱水提取物和乙醇提取物對牛樟芝菌絲生長的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)加入木屑萃取物后牛樟芝的生長情形、清除DPPH(1,1-二苯基-2-苦味肼基團)自由基能力，抗腫瘤實驗以及細胞抗氧化實驗，均比純PDA培養(yǎng)的效果佳，加入熱水提取物生長情形以及活性均比加入乙醇提取物效果佳[13]。張潔怡利用牛樟芝天然寄主牛樟及4種同屬的植物(冇樟、樟樹、土肉桂和蘭嶼肉桂)進行牛樟芝生長因子篩選，他認為樟樹水萃取物對牛樟芝的生長代謝力、碳水化合物產(chǎn)量、菌絲體產(chǎn)量和蛋白含量均有顯著的促進效果，可選用樟樹作為替代牛樟的參試樹種[14]。我國大陸江南大學(xué)的陸震鳴研究了香樟 (Cinnamomumcamphoravar.linaloolifera) 樹枝和樹葉不同提取物對液態(tài)搖瓶培養(yǎng)的牛樟芝生物量和三萜含量的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)香樟的石油醚提取物和乙酸乙酯提取物均能提高牛樟芝菌絲體中三萜的含量，香樟的水提取物能顯著增大牛樟芝菌絲體生物量和菌絲球直徑[15]。【本研究切入點】何種樟屬植物更有利于牛樟芝菌絲體的生長，取決于牛樟芝菌株的生長條件(包括培養(yǎng)溫度、濕度、通風(fēng)、培養(yǎng)基的狀態(tài)等)，以及所添加樟屬植物提取物的萃取方式和添加濃度等。我國大陸學(xué)者對牛樟芝皿式培養(yǎng)的研究鮮有報道。本研究團隊開展了牛樟芝的皿式培養(yǎng)和相關(guān)分子生物學(xué)研究，著眼于在皿式培養(yǎng)條件下篩選促進牛樟芝生長的樟屬植物，尋找促進牛樟芝生長的天然物質(zhì)，優(yōu)化培養(yǎng)基質(zhì)，以獲得優(yōu)質(zhì)的牛樟芝菌絲體或子實體，解決牛樟芝人工培養(yǎng)的技術(shù)瓶頸?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究以牛樟芝為實驗菌種，選用了牛樟芝的天然寄主牛樟樹，以及可能對牛樟芝菌絲體生長有促進作用的香樟和樟樹，通過在皿式培養(yǎng)基中添加一系列濃度的牛樟、香樟和樟樹的熱水提取物或乙醇提取物，分析牛樟芝菌絲的擴散直徑和菌絲體厚度等表型，比較3種樟屬植物對牛樟芝菌絲生長影響的差異，初步篩選出在皿式培養(yǎng)中對牛樟芝生長有促進作用的牛樟和樟樹，為牛樟芝的皿式培養(yǎng)提供理論基礎(chǔ)和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試菌株和植物材料 牛樟芝菌株由臺灣群益富實業(yè)有限公司惠贈，保存于福建省亞熱帶植物研究所植物生理生化重點實驗室。牛樟由臺灣林業(yè)研究所引種至本單位，3年生；香樟由廈門牡丹香化實業(yè)有限公司提供，3年生；樟樹為本研究所茶園內(nèi)種植，多年生。3種樟屬植物取材部位均為樹枝。

1.1.2 主要試劑及引物 PDA和PDB(馬鈴薯葡萄糖水)培養(yǎng)基均購自廣東環(huán)凱生物科技有限公司，基因組DNA 快速抽提試劑盒(真菌)購自生工生物工程(上海)有限公司，DNA marker 購自天根生化科技(北京)有限公司， 2×TaqMaster Mix和瓊脂糖均購自廈門泰京生物技術(shù)有限公司，定性濾紙(102號)購自廈門海晟泰化工貿(mào)易有限公司，其他試劑均為分析純。PCR引物由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成。

1.2 試驗方法

1.2.1 培養(yǎng)基的配置 木屑熱水提取物的制備[13]：將木屑放至50 ℃烘箱，烘干至恒重，研磨成粉。分別稱取牛樟、香樟和樟樹的木屑各2、4、6 g于100 mL 2次去離子水中，以121 ℃萃取20 min，將萃取液用102號(快速)定性濾紙過濾，取濾液，制成濃度為20、40和60 g/L的木屑熱水提取物。木屑乙醇提取物的制備[13]：將木屑放至50 ℃烘箱，烘干至恒重，研磨成粉。分別稱取牛樟、香樟和樟樹的木屑各2、4、8 g于100 mL 的75%乙醇溶液中，超聲波萃取1 h，濾紙過濾，取濾液。重復(fù)上述步驟2次，合并3次萃取液，真空干燥后分別各用100 mL 2次去離子水復(fù)溶，制成濃度為20、40和80 g/L的木屑乙醇提取物。固體培養(yǎng)基制備：PDA培養(yǎng)基粉末(40 g/L )溶于2次去離子水、牛樟、香樟和樟樹的木屑熱水提取物或乙醇提取物中，加入微量元素MgSO4(0.5 g/L)、KH2PO4(0.5 g/L)和VB1(0.01 g/L)，混勻，調(diào)pH至5.5，定容。121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。滅菌后的培養(yǎng)基在超凈工作臺內(nèi)分裝至平皿或試管，冷卻后供接種用。液體培養(yǎng)基制備：PDB粉末(24 g/L)溶于2次去離子水，加入微量元素MgSO4(0.5 g/L)、KH2PO4(0.5 g/L)和VB1(0.01 g/L)，調(diào)pH至5.5，定容。121 ℃滅菌20 min。冷卻后供接菌用。

1.2.2 菌種的培養(yǎng)及表型分析[12]用直徑7 mm的打孔器于超凈工作臺內(nèi)取距離菌落邊緣5 mm生長狀態(tài)良好，顏色鮮紅的牛樟芝菌種。所取菌塊分別接種于各種處理的平皿培養(yǎng)基上。每種處理5個重復(fù)。28 ℃培養(yǎng)30 d后測量“米”字型直徑，拍照記錄表型。

1.2.3 牛樟芝基因組DNA的提取[15-16]將牛樟芝菌塊接種到PDA斜面培養(yǎng)基上28 ℃培養(yǎng)30 d，用10 mL PDB反復(fù)沖洗菌絲，然后按照每150 mL培養(yǎng)液中接種1 mL菌液的比例轉(zhuǎn)接到液體培養(yǎng)基中。然后于28 ℃，120 r/min，震蕩培養(yǎng)10 d后過濾收集菌絲球。在液氮冷卻的研缽中加入適量菌絲球和液氮迅速研磨成粉末，裝入1.5 mL離心管中，用真菌基因組DNA提取試劑盒提取牛樟芝的基因組DNA。

1.2.4 核糖體DNA(rDNA)的內(nèi)轉(zhuǎn)錄序列(ITS)擴增及測序 ITS序列擴增采用真菌ITS通用引物引物ITS1 5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’和ITS4 5’-TCCTCC GCTTATTGATATGC-3’，擴增ITS序列全長。反應(yīng)體系為20 μl，模板DNA 0.5 μl，2×TaqMaster Mix 10 μl，10 pmol/μl的ITS1和ITS4各1 μl，無菌水7.5 μl。PCR擴增程序為94 ℃預(yù)變性50 s，30個循環(huán)(包括94 ℃變性50 s，51 ℃退火50 s，72 ℃延伸1 min)最后72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2 %瓊脂糖凝膠檢驗純度和濃度，合格的PCR產(chǎn)物純化后由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司測序。

1.2.5 供試菌株ITS rDNA擴增序列比對 將測序所得的ITS rDNA序列在NCBI中經(jīng)進行比對(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)。

2 結(jié)果與分析

2.1 牛樟芝菌種的培養(yǎng)和鑒定

本實驗用的牛樟芝菌株在PDA培養(yǎng)基生長30 d后菌落直徑可達5 cm以上，菌落最外環(huán)顏色最淺呈乳白色，菌落內(nèi)部菌絲呈現(xiàn)橘黃色至橘色(圖1A)。該菌有水蜜桃果腐味。牛樟芝菌具有多種基因型，為了確定實驗菌株的基因型，提取了該菌的基因組DNA。在基因組DNA提取過程沒有去除RNA的操作，因此電泳圖中可以看到部分RNA條帶的存在。箭頭所指為實驗菌株的基因組DNA(圖1B)。核糖體DNA的ITS序列在絕大多數(shù)的真核生物中表現(xiàn)出極廣泛的序列多態(tài)性。ITS分析在菌物系統(tǒng)發(fā)育研究中被廣泛應(yīng)用。以實驗菌株的基因組DNA為模板擴增了其ITS rDNA序列，目標(biāo)條帶介于500～750 bp之間(圖1C)。純化的PCR產(chǎn)物經(jīng)一代測序，結(jié)果顯示實驗樟芝菌株rDNA的ITS序列全長627 bp(圖1D)，與NCBI比對結(jié)果同源性達99%以上。經(jīng)鑒定本研究所用菌株為牛樟芝模式菌株BCRC35396，GeneBank登錄號為AY378094(圖1E)。

A：PDA培養(yǎng)基上生長30 d的實驗牛樟芝菌株表型，標(biāo)尺為1 cm； B：牛樟芝基因組DNA電泳圖； C：PCR擴增的牛樟芝ITS電泳圖； D：測序得到的牛樟芝ITS序列信息；E：ITS序列比對結(jié)果A: Morphology of A. camphorata grown on PDA medium for 30 days, Scale bar 1 cm; B: Electrophoresis of A. camphorata genomic DNA; C: Electrophoresis of A. camphorata ITS; D: ITS sequence; E: Blast result of A. camphorata ITS 圖1 本研究所用牛樟芝菌株的鑒定Fig.1 Identification of Antrodia camphorata used in this study

2.2 牛樟、香樟和樟樹木屑熱水提取物對牛樟芝生長的影響分析

為挖掘牛樟芝菌絲體生長的促進因子，選取牛樟芝的天然宿主牛樟，以及文獻報道中對牛樟芝生長可能有促進作用的香樟和樟樹，將其木屑提取物添加至培養(yǎng)基。牛樟、香樟和樟樹3種植物的木屑熱水提取物均采用20，40和 60 g/L 3個濃度梯度，分別添加到PDA培養(yǎng)基，觀察其對牛樟芝菌絲生長的影響，對照為純PDA培養(yǎng)基上生長的牛樟芝。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，牛樟、香樟和樟樹熱水提取物的添加均能明顯促進牛樟芝菌絲的生長。在添加熱水提取物培養(yǎng)基上生長30 d的牛樟芝菌落直徑顯著大于純PDA培養(yǎng)基生長的牛樟芝(圖2A)。3種樟屬植物對牛樟芝菌絲生長的促進效果不同。在實驗條件下對照PDA培養(yǎng)基上生長的牛樟芝菌落最中心(接種區(qū))附近會出現(xiàn)不同程度的老化；牛樟熱水提取物的添加會使得牛樟芝菌落更大，菌落外環(huán)菌絲更蓬松，同時中心接種區(qū)附近老化區(qū)域面積增大(圖2A)。20，40和60 g/L的牛樟提取物對牛樟芝菌絲體生長的促進效果類似(圖2B)。在本研究選擇的3種樟屬植物中，香樟對牛樟芝菌絲生長的促進作用最強的。結(jié)果顯示20，40，60 g/L的香樟熱水提取物添加后牛樟芝菌落直徑大于同濃度下牛樟和樟樹提取物的添加(圖2B)。同時，相比其他2種樟屬植物香樟熱水提取物添加后牛樟芝菌落老化更嚴重。樟樹熱水提取物的添加會使得牛樟芝菌絲長勢遠遠優(yōu)于對照條件，是3種樟屬植物添加后菌絲狀態(tài)最好的(圖2A)，但菌落直徑最小(圖2B)。結(jié)果表明，香樟的熱水提取物最能促進牛樟芝菌絲的生長，牛樟次之，樟樹最弱；綜合考慮整個菌落的生長狀態(tài)(包括直徑、厚度和致密度)，樟樹的添加是最優(yōu)的，牛樟次之，而香樟最差(圖2)。以上結(jié)果說明在以收獲牛樟芝菌絲體為目的的皿式培養(yǎng)中可以加入20 g/L低濃度的牛樟或樟樹熱水提取物來促進牛樟芝菌絲的生長。

2.3 牛樟、香樟和樟樹木屑乙醇提取物對牛樟芝生長的影響分析

本實驗設(shè)計了20，40和 80 g/L 3個濃度梯度的牛樟、香樟和樟樹木屑的乙醇提取物，分別添加到PDA培養(yǎng)基，培養(yǎng)30 d后觀察牛樟芝的生長狀態(tài)，對照仍為純PDA培養(yǎng)基上生長的牛樟芝。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，20和40 g/L的牛樟和樟樹的乙醇提取物的添加均能促進牛樟芝菌絲的生長，牛樟芝菌落直徑增大；而80 g/L的牛樟和樟樹乙醇提取物則會抑制牛樟芝菌絲的生長，牛樟芝直徑縮小同時菌絲變致密(圖3A)。3個牛樟乙醇提取物濃度中20 g/L對牛樟芝菌絲生長的促進作用最強，而樟樹則是40 g/L的濃度對牛樟芝菌絲促進作用最強，結(jié)果均表現(xiàn)為菌落直徑增大(圖3B)。3個濃度的香樟乙醇提取物則都能不同程度地促進牛樟芝菌絲的生長，其中低濃度提取物(20 g/L)對牛樟芝的促進作用最強，高濃度提取物(80 g/L)對牛樟芝的促進作用則最弱(圖3B)。與熱水提取物添加后的結(jié)果類似，香樟乙醇提取物的添加會使得牛樟芝菌落嚴重老化，從中心接種區(qū)至菌落最外環(huán)，菌絲稀疏，顏色淺淡(圖3A)。3種樟屬植物乙醇提取物添加至培養(yǎng)基后，牛樟芝菌落直徑最大的是添加樟樹乙醇提取物40 g/L，其次為樟樹乙醇提取物20 g/L、牛樟乙醇提取物20 g/L和香樟乙醇提取物20 g/L的添加條件，菌落直徑均有不同程度的增大(圖3B)。乙醇提取物添加后牛樟芝菌絲密集菌落生長狀態(tài)最好的是添加樟樹提取物80 g/L，其次為添加樟樹和牛樟提取物40 g/L，以及添加樟樹和牛樟提取物20 g/L的培養(yǎng)條件(圖3A)。綜合考慮菌落直徑和菌絲狀態(tài)，在牛樟芝皿式培養(yǎng)時可以添加40 g/L的牛樟或樟樹乙醇提取物來促進牛樟芝菌絲的生長。

A：牛樟芝的菌絲表型；B：牛樟芝直徑；**表示差異極顯著(P<0.01)A:Morphology of A. camphorata hyphae; B:Diameter of A. camphorata；**indicates a highly significant difference(P<0.01)圖2 在添加樟屬植物熱水提取物的培養(yǎng)基上生長30 d的牛樟芝Fig.2 Antrodia camphorata grown on medium supplied with Cinnamomum plant water-extract for 30 days

A：牛樟芝的菌絲表型；B：牛樟芝直徑；**表示差異極顯著(P<0.01)A:Morphology of A. camphorata hyphae; B:Diameter of A. camphorata；**indicates a highly significant difference(P<0.01)圖3 在添加樟屬植物乙醇提取物的培養(yǎng)基上生長30 d的牛樟芝Fig.3 Antrodia camphorata grown on medium supplied with Cinnamomum plant ethanol-extract for 30 days

3 討論與結(jié)論

牛樟芝作為中國臺灣地區(qū)特有的珍稀藥(食)用真菌，具保肝、防癌、抗癌、提高免疫力等生理活性[4-10]。在自然界中，牛樟芝僅寄生、腐生于特定宿主牛樟樹，目前并未發(fā)現(xiàn)牛樟芝生長在其他樹種上。牛樟芝子實體生長極其緩慢，生產(chǎn)周期長，再加上牛樟樹被列為臺灣一級保護樹種，能生長牛樟芝的老樹非常少見，資源有限，這些都極大限制了野生牛樟芝的產(chǎn)量。牛樟芝的人工培養(yǎng)逐漸興起。開展牛樟芝的人工培養(yǎng)，不僅可以在較短時間內(nèi)獲得牛樟芝的子實體或菌絲體滿足市場需求，同時對于牛樟芝的理論研究具有積極的推動作用。

牛樟芝人工培養(yǎng)方式主要包括固態(tài)培養(yǎng)，液態(tài)發(fā)酵，椴木培養(yǎng)和皿式培養(yǎng)。大陸和臺灣學(xué)者近些年的研究發(fā)現(xiàn)，牛樟、冇樟、樟樹、香樟等都有可能促進牛樟芝菌絲的生長，只是在不同的實驗條件下研究者篩選出最有利于牛樟芝生長的樟屬植物品種不同[12-15]。有人用小葉紅心樟椴木培養(yǎng)出牛樟芝子實體，與野生牛樟芝成分一致[17]。樟屬植物不同品種之間代謝物的差異很大。曾春山等對4種樟屬植物(樟樹、陽春樟、肉桂和陰香)鮮葉的精油成分分析發(fā)現(xiàn)，樟屬植物間精油相同成分較少，種間精油成分差異較大，各植物特有精油成分突出[18]。也有研究發(fā)現(xiàn)用牛樟椴木培養(yǎng)的樟芝與用其他椴木培養(yǎng)的樟芝代謝譜明顯不同，用牛樟椴木培養(yǎng)的牛樟芝代謝物種類更豐富[19]?？梢钥隙ǖ氖?，①牛樟樹作為牛樟芝唯一的天然宿主，其中一定含有其他樟屬植物不具備的特殊代謝物組分；②能用椴木培養(yǎng)牛樟芝的樟屬植物中也一定具有促進牛樟芝生長的一種或多種共性物質(zhì)。

近年來興起牛樟芝的皿式培養(yǎng)，該方式以培養(yǎng)皿為栽培單位，可控性強，單位間交叉污染概率低，單位面積產(chǎn)量高，同時菌體品質(zhì)穩(wěn)定，也易于實現(xiàn)量化生產(chǎn)[20-21]。關(guān)于皿式培養(yǎng)的研究目前只有為數(shù)不多的臺灣文獻報道[12-14]。本研究團隊在對牛樟芝進行皿式培養(yǎng)的過程中嘗試添加了牛樟、香樟和樟樹木屑的熱水和乙醇提取物。牛樟和樟樹木屑低濃度(20 g/L)、中濃度(40 g/L)和高濃度(60 g/L)的熱水提取物均能促進牛樟芝的生長，表現(xiàn)為菌落直徑大于對照條件(圖2)；牛樟和樟樹木屑低濃度(20 g/L)和中濃度(40 g/L)的乙醇提取物能促進牛樟芝菌絲的擴散，而80 g/L的乙醇提取物則會抑制菌絲生長(圖3)添加樟樹提取物培養(yǎng)的牛樟芝菌絲更致密，這一結(jié)果驗證了臺灣張潔怡提出的樟樹水萃取液促進牛樟芝菌絲生長的論斷[14]。在本研究中，與牛樟和樟樹不同的是，香樟不同濃度的熱水提取物和乙醇提取物均能促進牛樟芝菌絲的生長(圖2～3)，這與陸震鳴[15]提出的在液態(tài)搖瓶培養(yǎng)時香樟促進牛樟芝菌絲生長的結(jié)論一致。在牛樟芝皿式培養(yǎng)時加入香樟的木屑提取物，可能由于菌絲生長太快，表現(xiàn)為菌絲稀薄。筆者認為，在以收獲牛樟芝菌絲體或子實體為目的批量化皿式培養(yǎng)中不適合添加香樟的提取物來促進菌絲生長，可以添加適量牛樟和樟樹的提取物。熱水提取物的制備較乙醇提取物要簡單、經(jīng)濟、易行。但在量化生產(chǎn)時添加何種提取物不僅要考量菌絲的擴散直徑，更取決于收獲的菌絲體或子實體的質(zhì)量，即牛樟芝有效活性物質(zhì)三萜和多糖等的含量。因此在牛樟芝的大規(guī)模皿式培養(yǎng)時用何種方式萃取牛樟或樟樹的木屑加入到培養(yǎng)基中還有待進一步分析。另外，牛樟和樟樹提取物組分的異同，以及這些提取物促進牛樟芝生長的機理等都有待于后續(xù)實驗進一步研究。