李雪艷，張 濤，楊紅梅，楚 敏，高 雁，曾 軍，霍向東，張 濤，林 青，歐提庫爾，李玉國，婁 愷,史應(yīng)武,*

(1.新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830052；2.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物應(yīng)用研究所，新疆 烏魯木齊 830091)

【研究意義】內(nèi)生細(xì)菌生活于組織內(nèi)部，能夠促進(jìn)棉花生長，有些能夠抑制黃萎病菌生長[1-5]。內(nèi)生細(xì)菌種類、定殖率和定殖量等因素直接影響細(xì)菌對宿主植物的效應(yīng)。如何在短時間高靈敏度，高特異性地進(jìn)行高通量定量內(nèi)生細(xì)菌，研究內(nèi)生細(xì)菌數(shù)量在季節(jié)和空間上的動態(tài)變化，為新疆不同地區(qū)和不同季節(jié)棉花黃萎病(Verticilliumdahliae)防治提供理論依據(jù)。因此棉花黃萎病株內(nèi)生細(xì)菌數(shù)量的研究對揭示棉花黃萎病發(fā)生對內(nèi)生細(xì)菌的影響及微生態(tài)調(diào)控黃萎病具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】棉花黃萎病是一種土傳病害，從棉花的根部侵染，進(jìn)入維管束造成棉花系統(tǒng)性癥狀[6]具有分布廣、危害重、寄主范圍寬、傳播通徑多，存活時間久等特點(diǎn)，被稱為棉花的癌癥[7-8]。在中國大約有30 000 km2的棉花感染了黃萎病，年損失率達(dá)到10 %～30 %[9]。傳統(tǒng)防治黃萎病的方法是通過培育部分抗性品種，但很少有陸地棉品種能夠抗黃萎病，這種方法不僅繁瑣耗時，而且綜合防控效果不佳。在生態(tài)環(huán)境中，絕大多數(shù)化學(xué)殺菌劑不能有效地抑制甚至殺死病原菌。因此，幾乎沒有任何化學(xué)措施能有效地控制這種疾病[10]。生物防治是目前最具發(fā)展?jié)摿Φ闹参锓乐畏椒?，但根際微生物防治黃萎病效果不穩(wěn)定且受環(huán)境因子的影響不易控制[11]。而植物內(nèi)生細(xì)菌能在健康植物組織內(nèi)棲居，而不對植物造成實(shí)質(zhì)性危害，并與植物建立和諧聯(lián)合關(guān)系，具有防止病害，增強(qiáng)抗逆性的生物學(xué)作用[12],它的優(yōu)勢在于操作方便,不受環(huán)境影響且對環(huán)境安全可靠。因此使用生防菌，特別是內(nèi)生細(xì)菌，是控制該病的一種替代策略。不同內(nèi)生細(xì)菌菌株在棉花體內(nèi)的定殖規(guī)律不同且在棉苗中定殖一定數(shù)量后，才能對棉花黃萎病產(chǎn)生較高的防治效果[13-14]。因此，對棉花黃萎病株不同季節(jié)和地區(qū)的內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行定量，為內(nèi)生細(xì)菌防治棉花黃萎病提供科學(xué)依據(jù)?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】細(xì)菌定量檢測方法有細(xì)菌培養(yǎng)技術(shù)，多重PCR[15]，熒光定量PCR等。細(xì)菌培養(yǎng)技術(shù)比較費(fèi)時費(fèi)力，且對操作人員技術(shù)和設(shè)備要求較高[16]；多重?zé)晒舛縋CR由于引物之間的競爭，檢測常常受到限制，檢測后還需進(jìn)一步凝膠電泳分析，操作繁瑣[17]；熒光定量PCR具有高通量，快速，靈敏自動化程度高[18-20]等特點(diǎn)，能夠較短時間內(nèi)完成檢測與定量，技術(shù)成熟，應(yīng)用廣泛，然而實(shí)時定量PCR應(yīng)用于定量檢測棉花內(nèi)生細(xì)菌的研究鮮見報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究以新疆棉花內(nèi)生細(xì)菌為研究對象，采用實(shí)時熒光定量方法，揭示罹病棉花內(nèi)生細(xì)菌的時空動態(tài)規(guī)律，了解黃萎病對棉花內(nèi)生細(xì)菌的影響，為內(nèi)生細(xì)菌防治棉花黃萎病提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)室棉花樣品采集 在新疆東疆哈密(HM)，南疆庫爾勒(KEL)、阿拉爾(ALE)、盤木舒克(PMSK)，北疆烏蘇(WS)、精河(JH)、石河子(SHZ)這7個地區(qū)分別在苗期、蕾期、花期、吐絮期采集整個病株棉花樣品，放入裝有變色硅膠保鮮袋脫水帶回。

1.1.2 主要試劑及儀器 試劑：Ezup柱式植物基因組DNA抽提試劑盒，購自生物工程(上海)股份有限公司； 質(zhì)粒純化試劑盒，購自生物工程股份有限公司；dNTP Mixture，購自寶生物工程有限公司。儀器：熒光定量PCR儀，LightCycler 480，羅氏醫(yī)學(xué)儀器公司；超微量分光光度計，OSE-260，濟(jì)南利科醫(yī)療器械有限公司；全自動凝膠成像系統(tǒng)，WD-9413B，北京市六一儀器廠；超低溫冰箱,DW-40L255,杭州艾普儀器設(shè)備有限公司；PCR儀，TC-96，杭州博日科技有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 棉花內(nèi)生菌總DNA提取 隨機(jī)選取每個棉區(qū)苗期、蕾期、花期、吐絮期各3棵棉花植株，共84個樣品，用Ezup柱式植物基因組DNA抽提試劑盒按照試劑盒的實(shí)驗(yàn)步驟提取棉花總DNA，每個樣品分別對應(yīng)標(biāo)記，將DNA提取的樣品放置在-20 ℃冰箱中保存待用。

1.2.2 樣品PCR擴(kuò)增及反應(yīng)系統(tǒng)的優(yōu)化 選用內(nèi)生細(xì)菌16S rDNA基因特異引物，正向引物 799F 5′-AAC AGG ATT AGA TAC CCT G-3′和反向引物1392R 5′-ACG GGC GGT GTG TRC-3′擴(kuò)增內(nèi)生細(xì)菌16S rDNA基因片段，探針用fam/BHQ1(CCGTCAATTCMTTTGAGTTT)標(biāo)記，同時設(shè)置不加模板的為陰性對照組，每個反應(yīng)體系重復(fù)3次，對棉花內(nèi)總DNA進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR擴(kuò)增。根據(jù)擴(kuò)增效率最終確定PCR優(yōu)化反應(yīng)體系為20 μl，mix 10 μl，引物0.8 μl，探針0.4 μl，水7.8 μl，模版1μl反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃予變性10 min，95 ℃變性25 s，52 ℃退火120 s，72 ℃延伸90 s，45個循環(huán)。

1.2.3 重組質(zhì)粒的構(gòu)建 將棉花內(nèi)總實(shí)時熒光定量PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)全自動凝膠成像系統(tǒng)純化。將純化的內(nèi)生細(xì)菌擴(kuò)增產(chǎn)物構(gòu)建質(zhì)粒后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中,在平板上進(jìn)行藍(lán)白斑試驗(yàn)篩選陽性克隆。

1.2.4 重組質(zhì)粒的標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 利用質(zhì)粒純化試劑盒提取上述陽性克隆重組質(zhì)粒DNA,用超微量分光光度計(OSE-260)測定重組質(zhì)粒DNA的濃度。根據(jù)已知重組質(zhì)粒全序列和阿伏伽德羅常數(shù)(6.02×1023分子數(shù)·mol-1)計算拷貝數(shù)為1.8825×107copies/g(FRW)。7個10倍梯度稀釋重組質(zhì)?？截悢?shù)范圍：1.8825×107copies/g(FRW)，1.8825×106copies/g(FRW)，1.8825×105copies/g(FRW)，1.8825×104copies/g(FRW)，1.8825×103copies/g(FRW)，1.8825×102copies/g(FRW)，1.8825×10 copies/g(FRW)。以循環(huán)數(shù)為縱坐標(biāo)，以拷貝數(shù)的對數(shù)為橫坐標(biāo)做標(biāo)準(zhǔn)曲線，在Roche LightCycle 480軟件內(nèi)拷貝數(shù)據(jù)，用Origin 94C軟件重新作出該圖，建立Ct值與內(nèi)生細(xì)菌濃度之間的線性關(guān)系。

1.2.5 不同時空樣品的熒光定量PCR檢測 利用上述重組質(zhì)粒DNA構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)曲線對不同季節(jié)棉花內(nèi)生菌DNA樣品進(jìn)行熒光定量PCR檢測。每個樣品在優(yōu)化反應(yīng)體系條件下進(jìn)行PCR擴(kuò)增，RT-PCR檢測擴(kuò)增后的內(nèi)生細(xì)菌的量；檢測完畢后得到Ct值，并將每個樣品對應(yīng)的Ct值帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程中，記錄苗期，蕾期，花期，吐絮期及所對應(yīng)地區(qū)的內(nèi)生細(xì)菌的含量(copies g-1FRW)。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理 使用Prism5和Origin94C軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組質(zhì)粒的標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

以拷貝數(shù)1.8825×107copies/g(FRW)為基礎(chǔ)，稀釋6個10倍稀釋梯度，重組質(zhì)?？截悢?shù)范圍為：1.8825×106copies/g(FRW)，1.8825×105copies/g(FRW)，1.8825×104copies/g(FRW)，1.8825×103copies/g(FRW)，1.8825×102copies/g(FRW)，1.8825×10 copies/g(FRW)。以這7個標(biāo)準(zhǔn)濃度的DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以反應(yīng)結(jié)束后LightCycler?480系統(tǒng)軟件提供的數(shù)據(jù)，用Origin作圖1～2。

圖1 10倍梯度稀釋陽性質(zhì)粒的熒光定量PCR擴(kuò)增曲線Fig.1 Real-time PCR amplification curve of serial 10-fold dilutions of positive recombinant plasmids

圖2 10倍梯度稀釋陽性質(zhì)粒的熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Fig.2 Real-time PCR standard curve of serial 10-fold dilutions of positive recombinant plasmids

由圖2可知，曲線的相關(guān)性系數(shù)R2=0.997，說明模版的濃度與循環(huán)數(shù)Ct之間有相關(guān)性強(qiáng)；曲線的截距為42.09645± 0.52988，斜率為-3.31684± 0.08222。故內(nèi)生細(xì)菌的DNA起始濃度對數(shù)值與Ct值之間的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=-3.317x+42.096，其中x為內(nèi)生細(xì)菌DNA起始濃度的對數(shù)值，y為擴(kuò)增反應(yīng)Ct值。

2.2 棉花黃萎病株內(nèi)生細(xì)菌在季節(jié)上的變化規(guī)律

由圖3可以看出，整體上除了哈密外其余6個城市在苗期、蕾期、花期均表現(xiàn)出先上升后下降再上升的趨勢；苗期精河達(dá)到最低值，平均值為2.32×107copies/g(FRW)，蕾期圖木舒克平均值最高，達(dá)1.35×108copies/g(FRW)，花期石河子最低，平均值達(dá)1.267348×107copies/g(FRW)，吐絮期庫爾勒平均值最高，達(dá)2.31×108copies/g(FRW)。圖木舒克、烏蘇、石河子、阿拉爾的棉花黃萎病病株的內(nèi)生細(xì)菌數(shù)量在4個時期中均在蕾期達(dá)到最高；庫爾勒，精河病株的內(nèi)生細(xì)菌數(shù)量在4個時期中在吐絮期達(dá)到最高；哈密地區(qū)的病株內(nèi)生細(xì)菌量呈現(xiàn)出先下降再上升的趨勢，在花期內(nèi)生細(xì)菌的量達(dá)到最低達(dá)2.085539×107，苗期最高達(dá)3.96×108。

圖3 棉花黃萎病株內(nèi)生細(xì)菌數(shù)量在季節(jié)上的變化Fig.3 Different growth stages changes of the total number of endophytic bacteria in cotton infected by Verticillium wilt

圖4 棉花黃萎病株內(nèi)生細(xì)菌數(shù)量在空間上的變化Fig.4 Sampling sites changes of the total number of endophytic bacteria cotton infected by Verticillium wilt

2.3 棉花黃萎病株內(nèi)生細(xì)菌在空間上的變化規(guī)律

圖4表明棉花黃萎病株內(nèi)生細(xì)菌數(shù)量在空間上的變化規(guī)律，整體來說病株的內(nèi)生細(xì)菌數(shù)東疆最高，南疆其次，北疆相對較少。其中東疆哈密的苗期高達(dá)3.96×108copies/g(FRW)，庫爾勒吐絮期高達(dá)2.31×108copies/g(FRW)；南疆庫爾勒，圖木舒克和阿拉爾的病株蕾期的內(nèi)生細(xì)菌數(shù)量均高于北疆精河石河子和烏蘇病株蕾期內(nèi)生細(xì)的菌量。

3 討 論

實(shí)時熒光定量 PCR 檢測方法快而靈敏且特異性強(qiáng)，更突破了傳統(tǒng)的PCR的僅檢測而不能定量的局限，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于植物細(xì)菌、真菌以及病毒病原的檢測與定量[13]。棉花黃枯萎病是棉花的癌癥，病原菌和拮抗菌的大規(guī)模檢測和定量方法的建立和應(yīng)用是生物防治的一種非常重要的手段，實(shí)時熒光定量PCR能夠滿足大規(guī)模的檢測的需求，但設(shè)備和試劑昂貴。本實(shí)驗(yàn)就是利用實(shí)時熒光定量PCR的方法定量棉花患黃萎病植株內(nèi)生細(xì)菌的數(shù)量，探究出了棉花患病內(nèi)生細(xì)菌的含量與空間和季節(jié)的變化規(guī)律，但這7個地區(qū)的病株內(nèi)生細(xì)菌的數(shù)量與病株體內(nèi)大麗輪枝菌數(shù)量的關(guān)系，以及各生育時期罹病植株內(nèi)生細(xì)菌的定殖量與棉花黃萎病發(fā)病程度的相關(guān)性有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

本研究應(yīng)用熒光定量PCR快速檢測定量新疆南疆，北疆，東疆部分地區(qū)及對應(yīng)地區(qū)不同季節(jié)黃萎病棉花內(nèi)生細(xì)菌，新疆棉花內(nèi)生細(xì)菌數(shù)量在季節(jié)上呈“升-降-升”和空間上從東疆、南疆、北疆依次降低的變化趨勢。