謝慧婷，李戰(zhàn)彪，譚海文，秦碧霞，崔麗賢，蔡健和*

(1. 廣西農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所，廣西 南寧 530007；2.廣西作物病蟲害生物學重點實驗室，廣西 南寧 530007；3.廣西桂林市蔬菜研究所，廣西 桂林 541004)

【研究意義】瓜類細菌性果斑病(Bacrerial Fruit of Blotch，BFB)是一種檢疫性植物病害，對瓜類作物具有毀滅性。目前在全國西瓜甜瓜主產(chǎn)區(qū)均有發(fā)生，其病原菌為西瓜嗜酸菌(Acidororaxcitrulli)[1]，可侵染西瓜、甜瓜等多種葫蘆科作物。病菌主要通過種子進行傳播，在種子中的存活時間可長達19年，抗干旱和衰老能力強[2-3]，病菌在含病殘體的土壤中可存活12個月，在不含病殘體的土壤中可存活8個月[4]。當條件適宜時，潛在的病菌可導致病害的大面積爆發(fā)，給西瓜甜瓜種植業(yè)造成嚴重的經(jīng)濟損失。廣西常年種植西瓜甜瓜面積約10萬hm2[5]，該病害從20世紀90年代中期開始在廣西發(fā)生為害，導致許多育苗場損失慘重[6]。因此，開展有關細菌性果斑病菌抑制藥劑的研究，建立細菌性果斑病菌的PCR檢測技術，對于預防病害通過帶病種子種苗傳播擴散，從而控制廣西疫情的蔓延具有重大意義?！厩叭搜芯窟M展】關于瓜類細菌性果斑病病害的藥劑防治研究報道較多，但是各地防治效果有所不同。趙廷昌等[7]發(fā)現(xiàn)種子消毒以3 %鹽酸處理效果最好，其次為47 %加瑞農(nóng)可濕性粉劑和新植霉素。王中武等[8]發(fā)現(xiàn)47 %加瑞農(nóng)可濕性粉劑和90 %新植霉素可溶粉劑在苗期發(fā)病時用藥效果最好。黃金艷等[9]利用春雷霉素對嫁接前西瓜接穗材料進行處理降低了發(fā)病率。王雪等[10]的研究表明，西瓜菌株和甜瓜菌株對同一藥劑的敏感性差異較大。陳海燕等[11]對海南甜瓜細菌性果斑病進行田間藥效試驗，結果表明20 %二氯異氰尿酸鈉可濕性粉劑防效最好。張路生等[12]的研究表明88 %水合霉素、33.5 %喹啉酮和72 %農(nóng)用鏈霉素對山東省瓜類細菌性果斑病菌的抑制效果較好。賈云鶴等[13]對黑龍江省西瓜細菌性果斑病進行防治藥劑的篩選，研究發(fā)現(xiàn)雙氧水、硫酸鏈霉素、噻霉酮、福爾馬林、氫氧化銅、春雷霉素和新植霉素對病菌具有較好的抑制作用。王爽等[14]的研究發(fā)現(xiàn)噻霉酮、農(nóng)用鏈霉素、中生菌素和春雷霉素對海南西瓜細菌性果斑病菌的抑菌效果較好?！颈狙芯壳腥朦c】雖然國內(nèi)關于西瓜類細菌性果斑病的藥劑防治的研究較多，但各地研究結果差異較大，對廣西該病害防治工作的參考作用有限。【擬解決的關鍵問題】有針對性地選取實際生產(chǎn)中常用的13種細菌性藥劑，采用抑菌圈法對廣西瓜類細菌性果斑病菌進行室內(nèi)毒力測定，篩選出具有較好防效的藥劑，為廣西開展該病害的藥劑防治工作提供指導。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試樣品來源：2014-2017年間廣西各地植保植檢部門、種苗公司、育苗戶等送檢的葫蘆、西瓜、南瓜、甜瓜等葫蘆科種子種苗樣品以及本研究采集到的疑似病樣。

DNA提取及PCR擴增：參考植物基因組DNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司)提供的方法進行細菌DNA提取，檢測所選引物參考邱曉靜[15]BX-SL1:5′-CAGCTGGGAGCGATCTTCAT-3′/SR2: 5′- GCGTCAGGAGGGTGAGTAGCA-3′，273 bp，引物由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成。PCR反應體系(10.0 μl)：2×TaqMasterMix 5.0 μl，引物BX-SL1 (10 μmol/L)和SR2 (10 μmol/L)各0.5 μl，菌體DNA模板0.5 μl，雙蒸水3.5 μl。PCR反應程序：95 ℃預變性5 min；95 ℃30 s，58 ℃30 s和72 ℃45 s，共進行30個循環(huán)；72 ℃10 min，4 ℃下保存。PCR產(chǎn)物用1 %的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。

供試藥劑：1號殺菌劑(中國農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所趙廷昌教授贈送)、40 %甲醛(成都市科龍化工試劑廠)、硫酸鏈霉素(南京奧多福尼生物科技有限公司)、72 %農(nóng)用硫酸鏈霉素可溶粉劑(華北制藥股份有限公司)、80 %乙蒜素乳油(河南科邦化工有限公司)、12 %中生菌素母藥(福建凱立生物制品有限公司)、64 %殺毒礬可濕性粉劑(先正達作物保護有限公司)、47 %加瑞農(nóng)可濕性粉劑(日本北興化學工業(yè)株式會社)、30 %琥膠肥酸銅可濕性粉劑(齊齊哈爾四友化工有限公司)、20 %嗎胍·乙酸銅可濕性粉劑(齊齊哈爾四友化工有限公司)、46 %氫氧化銅水分散粒劑(美國杜邦公司)、20 %噻菌銅懸浮劑(浙江龍灣化工有限公司)和2 %春雷霉素水劑(日本北興化學工業(yè)株式會社)。

供試病原菌：菌株WM0922-3分離自厚皮甜瓜葉片，菌株XD0611-7分離自薄皮甜瓜果實，菌株XD0819-2分離自西瓜品種(籽瓜)果實，3個供試菌株均已完成科赫氏法則，結合16S rDNA序列分析，證明供試菌株均為西瓜嗜酸菌(Acidororaxcitrulli)[16]。供試菌株在YDC培養(yǎng)基中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗方法

1.2.1 BFB檢出率統(tǒng)計方法 對種子種苗及樣品進行BFB檢測，統(tǒng)計分析檢出率。

1.2.2 藥劑濃度配制 參考各藥劑推薦使用劑量，每個藥劑選擇5個梯度濃度，按照濃度由高到低的順序依次使用無菌水稀釋，各濃度藥劑現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.2.3 帶菌培養(yǎng)基制備采用抑菌圈打孔法[17]將KB培養(yǎng)基與各菌懸液濃度約為1(108cfu/mL)按10∶1的體積比分別混勻，每皿20 mL，制成帶菌平板，用直徑5 mm的滅菌打孔器在每皿打5個孔，將40 μl藥劑分別加入已編號孔中，每濃度3個重復，于28 ℃恒溫箱中培養(yǎng)，48 h后采用十字交叉法測量抑菌圈直徑。

1.2.4 統(tǒng)計方法 根據(jù)公式計算菌落生長抑菌率(%)=[(處理抑菌圈直徑-對照抑菌圈直徑)/處理抑菌圈直徑]×100；采用DPS v7.05版軟件進行毒力回歸方程數(shù)據(jù)分析，以藥劑濃度對數(shù)值為自變量，抑菌率的幾率值為因變量，建立毒力回歸方程，并求出各藥劑的EC50及相關系數(shù)R2，比較不同藥劑的抑菌率[18]。

2 結果與分析

2.1 BFB檢測情況

2014-2017年送檢的葫蘆種子包括韓砧一號、安生、金砧一號、本地葫蘆和來自山東、甘肅等地的散裝葫蘆種，南瓜種子包括雪砧金剛、壯士、吉冠373等，西瓜種子包括農(nóng)優(yōu)新一號、珠農(nóng)大美人、甜王三號等，甜瓜種子包括蜜語香瓜、丁型香瓜等。送檢的葫蘆種子、南瓜種子、西瓜種子及種苗、果實均檢出BFB(表1)。4年合計送檢種子345份，其中葫蘆種子203份，檢出率為6.4 %；南瓜種子31份，檢出率為9.68 %；西瓜種子66份，檢出率為4.55 %；甜瓜種子45份，檢出率為26.67 %；送檢西瓜嫁接苗65份，檢出率為7.69 %。

期間課題組從廣西南寧、桂林、賀州、北海、百色等市采集西瓜、甜瓜樣品共計405份(表2)，其中西瓜樣品187份，檢出率為10.69 %；厚皮甜瓜樣品186份，檢出率為6.99 %；薄皮甜瓜樣品32份，檢出率為18.75 %。從南寧、北海、賀州市采集的樣品中BFB檢出率較高，從百色市采集的樣品中未檢出BFB，部分樣品的PCR檢測結果見圖1。

2.2 13種殺菌劑對3個菌株抑菌率比較

在13種殺菌劑中，其中7種殺菌劑對菌株WM0922-3、XD0611-7 和XD0819-2具有不同的抑制效果(表3)，且每種有效殺菌劑的抑制效果均與藥劑濃度呈正比，其中以1號殺菌劑的抑制效果最好，最高濃度藥劑對3個菌株的抑菌率均超過83.00 %；其次為40 %甲醛、72 %農(nóng)用硫酸鏈霉素可溶粉劑、80 %乙蒜素乳油和64 %殺毒礬可濕性粉劑。其中，硫酸鏈霉素和12 %中生菌素母藥對WM0922-3和XD0611-7具有抑制效果，對XD0819-2卻沒有抑制作用；72 %農(nóng)用硫酸鏈霉素可溶粉劑對XD0819-2的抑制效果明顯低于WM0922-3和XD0611-7，且在最低濃度時對XD0819-2沒有抑制作用；64 %殺毒礬可濕性粉劑對XD0819-2的抑制效果優(yōu)于WM0922-3和XD0611-7。

表1 2014-2017年送檢種子和種苗檢測結果

表2 2014-2017年田間采集疑似病樣檢測結果

M：MarkerDL2000；CK：清水對照；-：陰性對照；+：陽性對照；1～4：待測樣品M;MarkerDL2000;CK:Water control; -:Negative control; +:Positive control; 1-4:Samples圖1 細菌性果斑病菌PCR檢測結果Fig.1 PCR test result of A. citrulli

余下6種殺菌劑：47 %加瑞農(nóng)可濕性粉劑(藥劑濃度1000～2000 mg·L-1)、30 %琥膠肥酸銅可濕性粉劑(藥劑濃度2400～4000 mg·L-1)、20 %嗎胍·乙酸銅可濕性粉劑(藥劑濃度2500～4500 mg·L-1)、46 %氫氧化銅水分散粒劑(藥劑濃度400～800 mg·L-1)、20 %噻菌銅懸浮劑(藥劑濃度1000～2000 mg·L-1)和2 %春雷霉素水劑(藥劑濃度1500～3100 mg·L-1)均未對菌株表現(xiàn)出抑制作用。

2.3 殺菌劑對3個菌株的毒力回歸方程

根據(jù)EC50結果發(fā)現(xiàn)，在對3個菌株WM0922-3、XD0611-7 和XD0819-2具有抑制作用的殺菌劑中，以1號殺菌劑的EC50最低，分別為0. 2×10-3、0. 1×10-3和0. 4×10-3mg·L-1；其次為40 %甲醛，EC50均小于0.06 mg·L-1；72 %農(nóng)用硫酸鏈霉素可溶粉劑對WM0922-3和XD0611-7的抑制作用優(yōu)于XD0819-2，而80 %乙蒜素乳油和64 %殺毒礬可濕性粉劑對XD0819-2的抑制作用均優(yōu)于WM0922-3和XD0611-7(表4～6)。

表3 7種殺菌劑對3個果斑病菌株的抑菌率比較

續(xù)表3 Continued table 3

藥劑名稱Name of bactericide藥劑濃度Concentration of bactericideWM0922-3XD0611-7XD0819-2平均抑菌圈直徑(mm)Diameter of inhibition zone 抑菌率(%)Bacteriostasis平均抑菌圈直徑(mm)Diameter of inhibition zone抑菌率(%)Bacteriostasis平均抑菌圈直徑(mm)Diameter of inhibition zone抑菌率(%)Bacteriostasis100 mg·L-110.1750.8210.3351.615.000.00150 mg·L-113.3362.5011.8357.755.000.00200 mg·L-114.6765.9113.0061.545.000.00250 mg·L-115.0066.6715.0066.675.000.0072 %農(nóng)用硫酸鏈霉素可溶粉劑Streptomycin 72 % SP100 mg·L-111.0054.5510.0050.005.000.00200 mg·L-113.6763.4114.0064.297.5033.33300 mg·L-116.3369.3616.0068.758.3340.00400 mg·L-118.6773.2118.3372.738.8343.40500 mg·L-120.3375.4119.6774.588.8343.4080 %乙蒜素乳油Ethylicin 80 % EC280 mg·L-110.0850.4111.1755.2211.0054.55310 mg·L-110.3351.6111.5056.5211.3355.88340 mg·L-110.3351.6111.8357.7511.0054.55370 mg·L-110.8353.8512.3359.4611.3355.88400 mg·L-111.6757.1412.8361.0411.6757.1412 %中生菌素母藥Zhongshengmycin 12 %200 mg·L-15.509.096.3321.055.000250 mg·L-15.8314.296.5323.475.000300 mg·L-16.0016.677.6734.785.000350 mg·L-17.0028.578.0037.505.000400 mg·L-17.1730.238.3340.005.00064 %殺毒礬可濕性粉劑Oxadixyl 64 % WP2500 mg·L-19.5047.375.6711.7615.5067.743000 mg·L-19.8349.1510.6753.1315.1767.033500 mg·L-111.1755.2211.3355.8816.4069.514000 mg·L-111.5056.5211.8357.7516.6770.004500 mg·L-111.6757.1412.6760.5319.0073.68

表4 不同殺菌劑對菌株WM0922-3的毒力回歸方程

表5 不同殺菌劑對菌株XD0611-7的毒力回歸方程

表6 不同殺菌劑對菌株XD0819-2的毒力回歸方程

3 討 論

本研究結果表明來自西瓜和甜瓜的3個果斑病菌株，各菌株對不同殺菌劑的敏感性有所不同，對同一殺菌劑的敏感性也不同。來自厚皮甜瓜和薄皮甜瓜的菌株WM0922-3和XD0611-7對藥劑的敏感性相似，但與來自西瓜品種(籽瓜)的菌株XD0819-2差異相對較大，這與王雪等[10]報道的結果相似。1號殺菌劑和40 %甲醛對3個菌株的防效均較好，這2種藥劑生產(chǎn)上主要用于種子處理，在最低濃度為0.1 %時防效分別達到75 %和55 %，這與董春玲等[19]報道的結果相似。72 %農(nóng)用硫酸鏈霉素可溶粉劑對3個菌株的抑制效果均較好，對菌株WM0922-3和XD0611-7的抑制效果優(yōu)于菌株XD0819-2，與王雪等[10]的實驗結果相反。酸鏈霉素對WM0922-3和XD0611-7具有較好的抑制效果，但對XD0819-2卻沒有抑制作用，這與牛慶偉等[20]報道的結果有所差異，可能與生產(chǎn)廠商、商品純度，以及實驗菌株不同有關。80 %乙蒜素乳油和64 %殺毒礬可濕性粉劑對XD0819-2的抑制效果較好，且優(yōu)于WM0922-3和XD0611-7，殺毒礬是防治卵菌類真菌病害的常用藥劑，本試驗發(fā)現(xiàn)其對細菌性果斑病菌也有較好效果，這與田英等[21]的研究結果一致。47 %加瑞農(nóng)可濕性粉劑、30 %琥膠肥酸銅可濕性粉劑、20 %嗎胍·乙酸銅可濕性粉劑、46 %氫氧化銅水分散粒劑、20 %噻菌銅懸浮劑、2 %春雷霉素水劑等細菌性病害常用藥劑在本實驗中均未發(fā)現(xiàn)有抑菌作用，這可能與生產(chǎn)上長期大量使用這幾種藥劑，細菌已產(chǎn)生較強抗藥性有關，這與王雪等[10]和萬秀琴等[22]報道的結果相似。

Walcott等[23]將64株瓜類細菌性果斑病菌分成兩個亞群，亞群1的菌株主要分離自甜瓜、南瓜等，亞群2的菌株主要分離自西瓜，且亞群1的菌株對硫酸銅不敏感。趙文龍等[24]對143株瓜類細菌性果斑病菌進行硫酸銅敏感性檢測，結果表明果斑病菌具有穩(wěn)定的抗銅性，且寄主為甜瓜的菌株比寄主為西瓜的菌株的抗銅性更高。本研究結果也說明了果斑病菌對銅制劑不敏感，因此在生產(chǎn)上需謹慎使用銅制劑防治瓜類細菌性果斑病。

PCR檢測發(fā)現(xiàn)，廣西生產(chǎn)上使用的甜瓜、西瓜種子以及嫁接砧木葫蘆種子和南瓜種子均發(fā)現(xiàn)攜帶有細菌性果斑病菌。因此，必須加強對育種、制種基地的檢疫監(jiān)管，加大對有關技術人員和西瓜育苗戶的西瓜甜瓜細菌性果斑病防控技術培訓力度，并做好種子消毒等處理措施，從源頭上切斷病害的傳播，確保廣西葫蘆科作物產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)健康發(fā)展。本試驗選用的銅制劑為生產(chǎn)中使用較為普遍的殺菌劑，結果顯示這些銅制劑對該病害均無防治效果，生產(chǎn)上要注意防止菌株產(chǎn)生抗藥性，應輪換使用藥劑。試驗獲得的結果僅是室內(nèi)毒力測定的初步結果，實際田間防治試驗正在進一步研究中。

4 結 論

細菌性果斑病菌在廣西地區(qū)已普遍發(fā)生，為了預防病害通過帶病種子種苗傳播擴散，必須加強對育種、制種的檢疫管理。結合本試驗結果，在防治廣西西瓜、甜瓜細菌性果斑病時建議使用1號殺菌劑和40 %甲醛進行種子消毒處理，在發(fā)病初期可以考慮使用殺毒礬等藥劑進行防治。