王玉奎，白曉璟，廉小平，張賀翠，羅紹蘭，蒲敏，左同鴻，劉倩瑩，朱利泉

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甘藍(lán)的克隆與表達(dá)分析

王玉奎1，白曉璟1，廉小平2，張賀翠1，羅紹蘭1，蒲敏1，左同鴻1，劉倩瑩1，朱利泉1

（1西南大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物科技學(xué)院，重慶 400715；2西南大學(xué)園藝園林學(xué)院，重慶 400715）

【目的】自交不親和性（self-incompatibility，SI）是顯花植物在長(zhǎng)期進(jìn)化過程中形成的限制自交衰退、促進(jìn)雜交優(yōu)勢(shì)的一種復(fù)雜而完善的重要遺傳機(jī)制。通過對(duì)SI與鈣共響應(yīng)新基因的克隆、時(shí)空特異性表達(dá)分析和篩選與其互作的蛋白，并對(duì)在自花授粉后刺激柱頭的響應(yīng)機(jī)制進(jìn)行研究，以期為甘藍(lán)SI的深入研究提供依據(jù)?！痉椒ā坎捎棉D(zhuǎn)錄組測(cè)序、自花和異花授粉后差異篩選以及PCR克隆獲得。利用DNAMAN軟件和Smart軟件進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)和保守結(jié)構(gòu)域分析，通過Expasy在線軟件預(yù)測(cè)BoSPx蛋白分子量、等電點(diǎn)、二級(jí)結(jié)構(gòu)和跨膜結(jié)構(gòu)域；采用MEGA6.0軟件中的鄰接法構(gòu)建BoSPx蛋白的系統(tǒng)發(fā)育樹，并推測(cè)BoSPx蛋白在甘藍(lán)自花授粉后的功能。利用RT-PCR技術(shù)進(jìn)行組織特異性表達(dá)分析，通過qRT-PCR檢測(cè)自花和異花授粉后的相對(duì)表達(dá)量。構(gòu)建GFP表達(dá)載體，共聚焦顯微鏡觀察BoSPx的亞細(xì)胞定位；酵母雙雜交技術(shù)尋找其相互作用的蛋白?！窘Y(jié)果】克隆獲得一個(gè)新基因——，其含有1個(gè)外顯子，無內(nèi)含子，是單外顯子結(jié)構(gòu)。的開放閱讀框?yàn)?96 bp，編碼具有131個(gè)氨基酸殘基的蛋白質(zhì)。理論等電點(diǎn)為4.54，是一種親水性蛋白，沒有信號(hào)肽和跨膜域，含有3個(gè)保守的EF-hand模體（第48—60、64—80和81—96位）。起始密碼子上游啟動(dòng)子序列500 bp左右含有生長(zhǎng)素響應(yīng)應(yīng)答元件。在開花前1—2 d的柱頭、萼片、葉片、花藥、花瓣中均有表達(dá)，在柱頭中表達(dá)量最高，并且在自花和異花授粉的柱頭中表達(dá)量都是先升高后降低，在自花授粉15 min時(shí)表達(dá)量達(dá)到最高，而后急劇下降，下降的低值與開花前1—2 d的柱頭峰值相當(dāng)。亞細(xì)胞定位分析表明BoSPx蛋白定位于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中。酵母雙雜交結(jié)果表明BoSPx與SRKARC1之間無相互作用，但與生長(zhǎng)素家族蛋白BoSAUR71和BoPID均能互作?！窘Y(jié)論】受自花授粉顯著誘導(dǎo)表達(dá)，可能是受生長(zhǎng)素調(diào)節(jié)的鈣結(jié)合蛋白，對(duì)SI和鈣產(chǎn)生共響應(yīng)；該蛋白具有多組織表達(dá)和核質(zhì)同在的特性，表明BoSPx可能參與SRK-ARC1-ExO70A1途徑以外的未知信號(hào)通路。

甘藍(lán)；BoSPx；酵母雙雜交；生長(zhǎng)素；自花授粉；自交不親和

0 引言

【研究意義】自交不親和性（self-incompatibility，SI）是植物在長(zhǎng)期的進(jìn)化過程中為了防止自交衰退、保持遺傳變異和促進(jìn)雜種優(yōu)勢(shì)，形成的一種復(fù)雜而完善的重要遺傳機(jī)制。蕓薹屬甘藍(lán)屬于典型的孢子體型自交不親和植物（sporophytic self-incompatibility，SSI），其分子機(jī)制主要集中于SI信號(hào)傳導(dǎo)元件協(xié)同作用抑制自花花粉萌發(fā)或花粉管生長(zhǎng)上[1]，是基于磷酸化激活SI信號(hào)元件與泛素化降解花粉親和因子的過程。Gu等[2]以SRK（S-locus receptor kinase）胞內(nèi)激酶域?yàn)檎T餌，通過酵母雙雜交技術(shù)從甘藍(lán)型油菜柱頭cDNA文庫(kù)鑒定出與SRK結(jié)合的靶蛋白—ARC1（arm repeating containing），ARC1在自交不親和反應(yīng)過程中起正調(diào)控作用。Stone等[3]和VANOOSTHUYSE等[4]利用反義抑制和RNAi技術(shù)分別抑制甘藍(lán)型油菜（）和琴葉擬南芥（）的表達(dá)，以及在甘藍(lán)型油菜中過表達(dá)均只能部分打破材料的不親和性。在擬南芥中，直系同源基因是假性遺傳因子，向自交親和的擬南芥中僅僅轉(zhuǎn)入琴葉擬南芥的也能表現(xiàn)出強(qiáng)自交不親和性[5-7]。由此表明ARC1可能并非SRK唯一下游信號(hào)元件。因此，尋找其他參與調(diào)控自交不親和反應(yīng)的蛋白質(zhì)元件的編碼基因，對(duì)進(jìn)行人工調(diào)控來改變蕓薹屬植物的自交育性和創(chuàng)造新的育種理論和方法具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】甘藍(lán)SI信號(hào)傳導(dǎo)過程還涉及很多其他功能分子[8]，如鈣和生長(zhǎng)素響應(yīng)蛋白等。鈣與生長(zhǎng)素在自交親和性異花花粉萌發(fā)并穿越柱頭的伸長(zhǎng)過程中起關(guān)鍵作用[9-10]。Iwano等[11]通過雙授粉試驗(yàn)和用單倍型SP11（SCR）處理共表達(dá)YC3.60和Sb-SRK的琴葉擬南芥和蕪菁的乳突細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)Ca2+濃度的增加是由于單倍型SCR與SRK相互特異性識(shí)別引起的，同時(shí)，乳突細(xì)胞中Ca2+濃度的增加最終導(dǎo)致花粉水化被抑制。迄今為止，胞質(zhì)中Ca2+濃度的增加如何抑制花粉水化的分子機(jī)制尚不清楚。當(dāng)雄蕊和雌蕊發(fā)育時(shí)，生長(zhǎng)素（IAA）主要累積于花藥和花萼中，在花藥中，IAA隨著花粉的發(fā)育不斷積累，但其對(duì)雄蕊發(fā)育的影響僅局限于花絲變短。在授粉后相應(yīng)器官的反應(yīng)方面，在擬南芥成花誘導(dǎo)和花的發(fā)育過程中出現(xiàn)水溶性的IAA，而且IAA可以促進(jìn)花粉在雌蕊上萌發(fā)和花粉管的生長(zhǎng)[12]。梨自花授粉后柱頭內(nèi)的IAA含量變化較顯著[13]，IAA在煙草自交不親和的花粉與柱頭的識(shí)別過程中出現(xiàn)了相似的顯著變化[14]，而且自交不親和性與柱頭生長(zhǎng)素含量之間存在負(fù)相關(guān)關(guān)系，表明柱頭表面細(xì)胞內(nèi)未知的生長(zhǎng)素信號(hào)響應(yīng)柱頭對(duì)自花花粉的抑制作用[15]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】除了ARC1，SRK（SI的關(guān)鍵元件）下游還可能存在其他未知信號(hào)元件。前期研究中，發(fā)現(xiàn)了一種花絲較短的SI型材料，其鈣調(diào)素和生長(zhǎng)素響應(yīng)相關(guān)基因表達(dá)量明顯較高，但其分子機(jī)理尚不清楚。【擬解決的關(guān)鍵問題】本研究擬通過克隆甘藍(lán)，并對(duì)其進(jìn)行序列、啟動(dòng)子活性以及組織特異性表達(dá)分析，同時(shí)利用qRT-PCR檢測(cè)自花授粉和異花授粉后的表達(dá)模式，探索該蛋白與信號(hào)傳導(dǎo)元件SRK、ARC1等之間的相互作用，以期為甘藍(lán)自交不親和性的深入研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及其處理

材料取于西南大學(xué)園藝園林學(xué)院十字花科蔬菜研究基地選育的甘藍(lán)高代自交不親和系A(chǔ)4和F1植株，2017年3月底對(duì)開花前1—2 d花蕾人工去雄，然后分別以F1和A4植株的花粉為父本，以A4柱頭為母本進(jìn)行授粉處理。用F1植株花粉給去雄的A4柱頭進(jìn)行0、15、30和60 min的異花授粉處理，簡(jiǎn)稱CP（cross- pollination）組。用A4植株花粉給去雄A4柱頭進(jìn)行0、15、30和60 min的自花授粉處理，簡(jiǎn)稱SP（self-pollination）組。授粉處理后用毛筆快速掃去柱頭上的花粉，液氮速凍，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及差異表達(dá)基因篩選

分別提取上述處理材料的RNA，送百邁克公司進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，利用TopHat2軟件將所得轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)與參考基因組序列比對(duì)[16]，采用Trinity軟件對(duì)樣品數(shù)據(jù)進(jìn)行Unigenes組裝，通過Fold Change≥2且錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率FDR≤0.05來篩選候選差異基因。根據(jù)表達(dá)量的差異倍數(shù)、GO（Gene Ontology）富集分析以及KEGG（kyoto encyclopedia of gene and genomes）富集分析篩選表達(dá)差異顯著的基因。

1.3 目的基因的克隆

利用Primer Premer 5.0軟件對(duì)上述篩選出的目的基因設(shè)計(jì)引物1300-GFP-F/1300-GFP-R（電子附表1），以結(jié)球甘藍(lán)A4柱頭cDNA和gDNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系為20 μL ddH2O、25 μL 2×PCR Mixster Mix混合酶、上/下游引物各1 μL和cDNA模板1 μL；反應(yīng)程序?yàn)?4℃ 3 min；94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 40 s，40個(gè)循環(huán)；72℃5 min。將目的片段與PCAMBIA1300載體連接，并轉(zhuǎn)化。菌液PCR和雙酶切鑒定陽(yáng)性克隆，送至上海生物工程股份有限公司測(cè)序。

1.4 生物信息學(xué)分析

通過NCBI網(wǎng)站在線查找目的基因的開放閱讀框（ORF）、5′端非翻譯區(qū)（5′UTR）和3′端非翻譯區(qū)（3′UTR）。通過Bio-soft和DNAMAN8.0軟件推導(dǎo)編碼區(qū)的氨基酸序列；利用ExPASy-ProtParam tool（http://www.expasy.org/）分析蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)；利用NCBI結(jié)構(gòu)域數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.ncbi.nlm.nih. gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的保守結(jié)構(gòu)域；利用TMPRE（http//www.ch.embnet.org/software/ TMPRED_form.html）及SignalP（http://www.cbs.dtu.dk/ services/SignalP/）預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的跨膜結(jié)構(gòu)及信號(hào)肽；利用Smart（http://smart.embl-heidelberg.de/）和PROSITE（htttp://prosite.expasy.org/）預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的高級(jí)結(jié)構(gòu)域和功能位點(diǎn)。利用TargetP（https://omictools. com/targetp-tool）預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位。通過PlantCARE（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/ plantcare/html/）分析該基因起始密碼子上游序列啟動(dòng)子的順式作用元件。

1.5 組織特異性表達(dá)分析

按照RNA提取試劑盒RNAprep pure Plant Kit說明書（天根）提取甘藍(lán)柱頭、葉片、花藥等不同組織的RNA，并反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA。以為內(nèi)參基因，用Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase 25 μL反應(yīng)體系檢測(cè)不同組織中目的基因的表達(dá)情況。反應(yīng)程序?yàn)?5℃ 3 min；95℃ 15 s，60℃ 15 s，72℃ 10 s，35個(gè)循環(huán)；72℃5 min。

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析

提取不同授粉處理的柱頭RNA，并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，合成單鏈cDNA，參考LIAO等[17]方法利用熒光定量PCR儀檢測(cè)目的基因的表達(dá)模式。以甘藍(lán)為內(nèi)參基因，3次重復(fù)。利用2-ΔΔCT法分析的相對(duì)表達(dá)量。

1.7 亞細(xì)胞定位

將目的基因序列與綠色熒光基因連接，構(gòu)建PCAMBIA1300-BoSPx融合表達(dá)載體，以生長(zhǎng)4周齡的擬南芥蓮座葉為材料制備原生質(zhì)體，利用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染法將PCAMBIA1300空載體和重組載體PCAMBIA1300-BoSPx分別轉(zhuǎn)入原生質(zhì)體，23℃黑暗培養(yǎng)16 h，利用激光共聚焦顯微鏡觀察BoSPx蛋白的定位[18]。

1.8 共轉(zhuǎn)化酵母感受態(tài)細(xì)胞及酵母雙雜互作的鑒定

參照MatchmakerTMGold Yeast Two-Hybrid System操作說明，利用聚乙二醇/醋酸鋰法（PEG/ LiAC）將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒pGBKT7-BoSPx分別與pGADT7-SRK、pGADT7-ARC1、pGADT7- BoSAUR71和pGADT7-BoPID相應(yīng)地轉(zhuǎn)化到酵母感受態(tài)細(xì)胞Y2HGold。并設(shè)立陰性對(duì)照（pGADT7-T×pGBKT7- Lam）和陽(yáng)性對(duì)照（pGADT7-T和pGBKT7- 53），將共轉(zhuǎn)化后的酵母感受態(tài)細(xì)胞涂布于營(yíng)養(yǎng)缺陷型SD/-Leu -Trp固體培養(yǎng)基中，30℃倒置培養(yǎng)4 d。挑取白斑用無菌水稀釋涂布于營(yíng)養(yǎng)缺陷型SD/-Trp/- Leu/-His/-Ade固體培養(yǎng)基中。30℃倒置培養(yǎng)3—5 d，觀察其生長(zhǎng)情況。

2 結(jié)果

2.1 根據(jù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)篩選差異表達(dá)基因

根據(jù)轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)中自花授粉與異花授粉不同時(shí)段表達(dá)量的差異，以＜0.05和|log2（fold change）|≥2作為顯著差異表達(dá)閾值，篩選自花授粉不同時(shí)段差異顯著的基因。對(duì)篩選出的自花授粉表達(dá)差異顯著的基因進(jìn)行GO和KEGG富集分析，發(fā)現(xiàn)1個(gè)與Ca2+和生長(zhǎng)素信號(hào)途徑相關(guān)的調(diào)控基因。該基因在未授粉時(shí)相對(duì)表達(dá)量為13，自花授粉15 min后達(dá)到最高，為221.98，而后急劇下調(diào)，其異花授粉表達(dá)量變化不明顯（圖1），兩者的表達(dá)量水平差異達(dá)4.5倍，此時(shí)正是SI相關(guān)基因表達(dá)時(shí)期。表明該基因可能是自交不親和相關(guān)基因，命名為。

SP：自花授粉；CP：異花授粉。下同

2.2 結(jié)球甘藍(lán)BoSPx是不含內(nèi)含子的單外顯子基因

根據(jù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)獲得的部分編碼區(qū)CDS序列，結(jié)合NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)和蕓薹屬數(shù)據(jù)庫(kù)BLAST比對(duì)獲得全長(zhǎng)cCDA序列。以甘藍(lán)柱頭cDNA和gDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。獲得的cDNA和gDNA全長(zhǎng)均為400 bp左右（圖2），經(jīng)克隆測(cè)序與數(shù)據(jù)庫(kù)獲得的序列完全一致，該基因CDS序列為396 bp，說明該基因是不含內(nèi)含子的單外顯子基因。編碼一個(gè)具有131個(gè)氨基酸殘基的蛋白質(zhì)。

圖2 甘藍(lán)BoSPx的cDNA和gDNA序列的擴(kuò)增

2.3 BoSPx蛋白的結(jié)構(gòu)分析

利用DNAMAN軟件和ExPASy ProParam在線軟件分析BoSPx蛋白的結(jié)構(gòu)特征（圖3-A），在氨基酸殘基組成上，Glu和Leu出現(xiàn)頻率較高，分別占氨基酸總數(shù)的10.7%和9.9%，該蛋白相對(duì)分子質(zhì)量為14.78 kD，理論等電點(diǎn)為4.54，帶正電荷的氨基酸殘基總數(shù)為25，帶負(fù)電荷的氨基酸殘基總數(shù)為16；不穩(wěn)定指數(shù)為51.83，為短半衰期蛋白；總平均疏水指數(shù)（grand average of hyropathicity，GRAVY）為-0.378，推測(cè)BoSPx蛋白可能為親水蛋白；BoSPx蛋白定位于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)，該蛋白含有3個(gè)EF-Hand模體（第48—60、64—80和81—96位），其兩側(cè)是由12個(gè)殘基構(gòu)成的α-螺旋結(jié)構(gòu)域。通常組成EF-hand模體環(huán)的12個(gè)氨基酸殘基以X、Y、Z、-X、-Y、-Z模式構(gòu)成（圖3-B）。分別位于第1、3、5、7、9、12位的氨基酸殘基上，X、Y、Z、-X、-Y、-Z配體空間排列形成五邊雙錐結(jié)構(gòu)參與金屬配體配位，EF-Hand模體環(huán)中的第6個(gè)氨基酸殘基在大多數(shù)情況下是Gly，位置1（X）、3(Y)和12（-Z）是最保守的[19-21]。1位上的氨基酸殘基似乎總是疏水的，12位上的Glu或Asp提供了2個(gè)氧原子配位鈣，EF-hand模體環(huán)以明顯的幾何圖形容納鈣形成一個(gè)穩(wěn)定的四螺旋束結(jié)構(gòu)域。鈣離子結(jié)合鈣結(jié)合蛋白時(shí)可以誘導(dǎo)EF-hand模體環(huán)構(gòu)象發(fā)生變化，導(dǎo)致靶蛋白激活或失活。

A：BoSPx序列及其推導(dǎo)的氨基酸序列；B：同Marsden等[22]共有序列比對(duì)分析BoSPx的EF-Hand結(jié)構(gòu)域特征，下劃線部分為3個(gè)EF-hand結(jié)構(gòu)域；C：BoSPx蛋白三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，黑色標(biāo)記的為Ca2+結(jié)合的核心區(qū)域

通過對(duì)BoSPx蛋白進(jìn)行預(yù)測(cè)和分析，發(fā)現(xiàn)該蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)主要由α螺旋（alpha helix，Hh）和loop（L）組成。其中Hh占58.02%，L占41.2%，為全α蛋白。BoSPx沒有核定位信號(hào)（nuclear localization signals，NLS），不存在跨膜螺旋區(qū)。BoSPx沒有N-糖基化位點(diǎn)，其含有16個(gè)磷酸化位點(diǎn)，其磷酸化位點(diǎn)主要集中在第0—30、50—80、100—125位氨基酸殘基處。BoSPx第101位甲硫氨酸疏水性最強(qiáng)，系數(shù)為1.8；第13位谷氨酰胺親水性最強(qiáng)，系數(shù)為-2.667。疏水性分析顯示該蛋白平均負(fù)峰值個(gè)數(shù)顯著多于正峰數(shù)，說明它們親水性較好，屬于可溶性蛋白。利用Swiss-modle在線軟件對(duì)BoSPx的三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，得到該蛋白的三維結(jié)構(gòu)（圖3-C）。

2.4 BoSPx蛋白系統(tǒng)進(jìn)化分析

通過對(duì)BoSPx與其他物種氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖4）。BoSPx與甘藍(lán)型油菜BnSPx蛋白的同源性最近，其相似度達(dá)96%；與亞麻芥親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，為79%。按照親緣關(guān)系遠(yuǎn)近的原則，選取同源性最近的4種植物進(jìn)行多序列比對(duì)，并利用Smart預(yù)測(cè)可獲得每個(gè)蛋白的EF-Hand模體，通過E-value值分析可知BoSPx蛋白的EF-hand模體具有相對(duì)較高的同源性。為了進(jìn)一步比較各個(gè)蛋白之間的同源性，通過DNAMAN軟件中的Multiple Sequence Alignment程序比較，并通過Graphic File輸出結(jié)果，發(fā)現(xiàn)EF-Hand模體存在幾個(gè)相對(duì)保守的氨基酸片段（圖5），不同功能的蛋白在此區(qū)域存在較高的同源性。

圖4 BoSPx與其他物種BoSPx氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹

BnSPx：XP_013685948；RsSPx：XP_018468047；BrSPx：XP_009127085；下劃線代表EF-Hand結(jié)構(gòu)域，同時(shí)也代表該蛋白在此區(qū)域保守性高

2.5 BoSPx蛋白功能分析

為了進(jìn)一步解析該基因是否受自花授粉顯著誘導(dǎo)，通過蕓薹屬數(shù)據(jù)庫(kù)（http://brassicadb.org/brad/ index.php）及NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)選取起始密碼子上游2 000 bp的序列，利用PlantCARE在線軟件分析該基因啟動(dòng)子的順式作用元件，結(jié)果顯示，的啟動(dòng)子區(qū)含有多個(gè)元件，包括啟動(dòng)子基本元件TATA-box和CAAT-box等；還含有光、ABA、IAA和脅迫響應(yīng)相關(guān)等10多種應(yīng)答順式元件（表1），其中，IAA元件是一個(gè)TGACGTAA序列片段，位于起始密碼子上游500 bp左右，推測(cè)BoSPx蛋白結(jié)合鈣后，引起IAA濃度變化后，反饋調(diào)節(jié)BoSPx表達(dá)，形成一個(gè)正反饋過程，從而導(dǎo)致花器異常[23-25]。

2.6 BoSPx的表達(dá)分析

通過對(duì)萼片、花瓣、柱頭、葉片和花藥中的表達(dá)進(jìn)行RT-PCR分析（圖6）。結(jié)果表明，在開花前1—2 d的柱頭、萼片、葉片、花藥、花瓣中均有表達(dá)，且在柱頭中表達(dá)量最高。通過對(duì)不同授粉處理后柱頭中的qRT-PCR分析（圖7），結(jié)果表明，在自花授粉后表達(dá)趨勢(shì)為先上調(diào)后下調(diào)，在異花授粉后下調(diào)。自花授粉15 min后相對(duì)表達(dá)量約為7.804，而異花授粉15 min后相對(duì)表達(dá)量約為0.223，兩者相對(duì)表達(dá)量相差約35倍。此時(shí)正是SI相關(guān)基因表達(dá)時(shí)期，在自花授粉15 min時(shí)能夠強(qiáng)烈誘導(dǎo)柱頭表達(dá)，說明的表達(dá)對(duì)自交不親和性產(chǎn)生反應(yīng)。

表1 BoSPx上游調(diào)控區(qū)順式作用元件

圖6 甘藍(lán)BoSPx在不同組織中的RT-PCR分析

圖7 BoSPx在不同授粉處理的表達(dá)分析

Fig 7 Expression analysis ofin response to self and cross pollination

2.7 BoSPx的亞細(xì)胞定位

通過構(gòu)建融合表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)化擬南芥原生質(zhì)體細(xì)胞。發(fā)現(xiàn)GFP蛋白分布在整個(gè)細(xì)胞中；而含GFP-BoSPx的蛋白主要分布在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中，表明BoSPx蛋白定位在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核內(nèi)（圖8）。

2.8 BoSPx與SRK、ARC1、BoSAUR71和BoPID之間的相互作用

將陰陽(yáng)對(duì)照載體和重組載體組合（pGBKT7- BoSPx×(pGADT7-SRK、pGADT7-ARC1、pGADT7- SAUR71、pGADT7-PID)）共轉(zhuǎn)化酵母感受態(tài)Y2HGold菌種中，分別涂布在SD/-Leu/-Trp（DDO）固體培養(yǎng)基上，30℃倒置培養(yǎng)3 d后，固體平板有菌落生成（圖9）。通過PCR檢測(cè)，均能擴(kuò)增出目的條帶，說明重組質(zhì)粒同時(shí)轉(zhuǎn)化進(jìn)入酵母細(xì)胞中。

從DDO固體培養(yǎng)基上挑取陽(yáng)性克隆懸浮于5 μL無菌水中，混勻后滴在營(yíng)養(yǎng)缺陷型（SD/-Ade/-His/- Leu/-Trp）固體培養(yǎng)基上，30℃倒置培養(yǎng)3 d后，發(fā)現(xiàn)陰性對(duì)照不能生長(zhǎng)，顯紅色（圖10）；共轉(zhuǎn)化質(zhì)粒BoSPx/SRK、BoSPx/ARC1不能生長(zhǎng)，無色；BoSPx/BoSAUR71、BoSPx/BoPID和陽(yáng)性對(duì)照能夠生長(zhǎng)，顯白色（表2）。說明BoSPx在酵母中與SRK（XP_013591187）和ARC1（XP_013636377）無相互作用，與BoPID（XP_013631900.1）和BoSAUR71（XP_013632246）之間存在相互作用[26]。

3 討論

3.1 BoSPx受自花授粉誘導(dǎo)顯著表達(dá)

本研究基于以自交不親和甘藍(lán)柱頭經(jīng)不同授粉處理后的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，篩選出1個(gè)受自花授粉誘導(dǎo)顯著上調(diào)表達(dá)的新基因,熒光定量分析表明在自花授粉15 min后的相對(duì)表達(dá)量約為7.804，約為未授粉表達(dá)量的7.8倍，而異花授粉15 min后的相對(duì)表達(dá)量約為0.223，在自花授粉15 min時(shí)，兩者的表達(dá)量水平差異約達(dá)35倍，此時(shí)正是SI相關(guān)基因表達(dá)時(shí)期。如此表達(dá)量差異和表達(dá)時(shí)期，說明是響應(yīng)甘藍(lán)自交不親和反應(yīng)的基因。啟動(dòng)子中含有ABA、IAA和脅迫響應(yīng)相關(guān)等10多種應(yīng)答順式元件，并且在甘藍(lán)柱頭的表達(dá)量明顯高于其他部位，表明其可能通過某些未知信號(hào)傳導(dǎo)途徑參與調(diào)控自交不親和反應(yīng)。

圖8 BoSPx蛋白在擬南芥原生質(zhì)體中的亞細(xì)胞定位分析

A：陽(yáng)性對(duì)照 Positive control(pGADT7-T+pGBKT7-53)；B：陰性對(duì)照Negative control(pGADT7-T+ pGBKT7-Lam)；C：pGADT7-SRK + pGBKT7-BoSPx；D：pGADT7-ARC1+pGBKT7-BoSPx；E：pGADT7-SAUR71+ pGBKT7-BoSPx；F：pGADT7-BoPID + pGBKT7-BoSPx

表2 質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化酵母的相互作用分析

1：陽(yáng)性對(duì)照Positive control(pGADT7-T+pGBKT7-53)；2：陰性對(duì)照Negative control(pGADT7-T+pGBKT7-Lam)；3：pGADT7-SRK+pGBKT7- BoSPx；4：pGADT7-ARC1+pGBKT7-BoSPx；5：pGADT7-SAUR71+ pGBKT7-BoSPx；6：pGADT7-BoPID+pGBKT7-BoSPx

3.2 BoSPx可能是響應(yīng)生長(zhǎng)素的鈣結(jié)合蛋白

BoSPx含有3個(gè)EF-hand模體，其能結(jié)合Ca2+后發(fā)生蛋白構(gòu)象的改變傳遞鈣信號(hào)。Thomas等[27]通過研究罌粟SI過程中發(fā)現(xiàn)Ca2+濃度增加使肌動(dòng)蛋白解聚最終導(dǎo)致下游細(xì)胞程序性死亡（programmed cell death，PCD）。Geitmann等[28]也證實(shí)了在虞美人（）自交不親和反應(yīng)過程中，花粉管中細(xì)胞骨架發(fā)生改變和依賴第二信使Ca2+啟動(dòng)細(xì)胞程序性死亡，最終抑制花粉管生長(zhǎng)。Iwano等[11]通過雙授粉試驗(yàn)和制備原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化試驗(yàn)證實(shí)了在蕓薹屬自交不親和反應(yīng)過程Ca2+濃度增加是必須的，并且足以導(dǎo)致花粉水化被抑制。同時(shí)也證明了乳突細(xì)胞中鈣離子濃度的增加是由同種單倍型SCR和SRK特異性識(shí)別相互作用引起的。且在自花授粉6 min后Ca2+濃度達(dá)到最高。這與自花授粉后表達(dá)量水平基本一致。推測(cè)BoSPx可能作為Ca2+結(jié)合蛋白元件參與了甘藍(lán)自花授粉后花粉與柱頭的相互作用[29-30]。另外，Nasrallah等[25]通過過量表達(dá)ARF3（Auxin Response Factor 3）下調(diào)生長(zhǎng)素反應(yīng)促進(jìn)十字花科植物SI反應(yīng)中“自我”花粉的抑制。BoSPx蛋白定位于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)，這種定位與ARC1相同，研究表明ARC1在SUMO前后分別定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核內(nèi)[31-32]，在SI反應(yīng)中作為S受體激酶底物時(shí)，其定位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。BoSPx相同于ARC1在參與SI反應(yīng)中的定位變化進(jìn)一步說明BoSPx蛋白的表達(dá)很可能是對(duì)自交不親和反應(yīng)的響應(yīng)。以上結(jié)果表明，我們克隆到的基因的表達(dá)產(chǎn)物是Ca2+響應(yīng)的蛋白元件，BoSPx可能通過調(diào)節(jié)生長(zhǎng)素的合成或分布來參與SI反應(yīng)。

3.3 BoSPx可能參與未知的SI過程

本研究中通過酵母雙雜試驗(yàn)證明BoSPx不能與SRK、ARC1互作，但能與BoPID（PINOID）和BoSAUR71相互作用，說明BoSPx沒有直接參與SRK- ARC1-Exo70A1途徑，而很可能參與了另外一條導(dǎo)致SI的未知途徑[33-34]。在擬南芥中，PID（PINOID）蛋白絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶是生長(zhǎng)素信號(hào)傳導(dǎo)的關(guān)鍵組分，可作為細(xì)胞生長(zhǎng)素流出的正調(diào)控因子，也可作為生長(zhǎng)素信號(hào)傳導(dǎo)的負(fù)調(diào)控因子；Benjamins等[35]通過過量表達(dá)和噴灑鈣離子抑制劑證實(shí)了鈣內(nèi)流和鈣離子抑制劑能夠在體內(nèi)增強(qiáng)PID激酶活性。Christensen等[36]發(fā)現(xiàn)PID（PINOID）能夠促進(jìn)PINs（auxin efflux carrier component）蛋白家族磷酸化從而調(diào)節(jié)PINs蛋白的極性定位。這些結(jié)果進(jìn)一步明確，BoSPx可能通過調(diào)節(jié)生長(zhǎng)素的分布來參與SI反應(yīng)，從而可能導(dǎo)致花器異常發(fā)育。轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中在自花授粉后有差異表達(dá)，未授粉表達(dá)量為39，自花授粉15 min為13，在授粉60 min上調(diào)表達(dá)為59，與的表達(dá)模式正好相反，說明BoSPx與BoPID蛋白互作可能會(huì)改變BoPID蛋白的激酶活性，從而促進(jìn)PIN蛋白磷酸化進(jìn)一步改變PIN的極性定位。BoSPx可能通過結(jié)合Ca2+激活BoPID激酶活性，BoPID磷酸化BoPINs蛋白改變BoPINs蛋白的極性定位[37-39]。BoPINs蛋白定位的改變可能會(huì)使植物體內(nèi)生長(zhǎng)素濃度梯度分布紊亂，已有研究表明自交不親和性與生長(zhǎng)素含量之間存在負(fù)相關(guān)關(guān)系[15]。進(jìn)一步表明BoSPx蛋白可能通過調(diào)控BoPID磷酸化BoPINs家族蛋白使柱頭乳突細(xì)胞內(nèi)生長(zhǎng)素濃度分布紊亂，導(dǎo)致花器異常甚至胚胎發(fā)育異常，不能正常授粉受精，最終導(dǎo)致不親和反應(yīng)[12,25]。（small auxin-up RNA71）是一種生長(zhǎng)素早期應(yīng)答基因。SAUR蛋白能夠體外與鈣調(diào)蛋白結(jié)合，這表明它可能是鈣調(diào)蛋白和生長(zhǎng)素信號(hào)之間的橋梁和聯(lián)系分子[40]，生長(zhǎng)素在對(duì)花器發(fā)育發(fā)揮生理作用的同時(shí)，又可能在分子水平上通過IAA響應(yīng)元件，調(diào)節(jié)的表達(dá)，如此形成反饋?zhàn)饔?。Kant等[41]研究證明了在水稻中在生長(zhǎng)素的合成和運(yùn)輸中起著負(fù)調(diào)節(jié)作用。BoSPx通過與生長(zhǎng)素家族蛋白SAUR71形成復(fù)合物可能負(fù)調(diào)控生長(zhǎng)素的濃度和分布，既可能影響花柱或花粉管生長(zhǎng)，造成花器異常，不能正常受精，又可能通過IAA響應(yīng)元件，調(diào)節(jié)的表達(dá)，形成反饋?zhàn)饔谩＿@可能是參與的甘藍(lán)對(duì)鈣和SI的共響應(yīng)模式。

4 結(jié)論

受SI的自花授粉誘導(dǎo)顯著表達(dá)，可能是響應(yīng)生長(zhǎng)素的鈣結(jié)合蛋白，對(duì)SI和鈣產(chǎn)生共響應(yīng)；BoSPx不能與SRK、ARC1互作，但能與BoPID和BoSAUR71相互作用，BoSPx可能參與到SRK-ARC1-ExO70A1途徑以外的未知信號(hào)通路中。

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（責(zé)任編輯 李莉）

Cloning and expression Analysis ofin

Wang YuKui1, Bai XiaoJing1, Lian XiaoPing2, Zhang HeCui1, Luo ShaoLan1, Pu Min1, Zuo TongHong1, Liu QianYing1, Zhu LiQuan1

(1College of Agronomy and Biotechnology, Southwest University, Chongqing 400715;2College of Horticulture and Landscape Architecture, Southwest University, Chongqing 400715)

【Objective】Self-incompatibility (SI) is a genetic barrier to inhibit self-pollination and promote hybridization in flowering plants. Here, cloning of a novel gene co-responsive to SI and calcium production during pollination, and spatio-temporal specific expression analysis of the novel gene BoSPx under self-pollination conditions, screening its interaction proteins were conducted to explore. the responding mechanism of BoSPx to self-pollination stimulated stigma in order to provide some further insights into SI process invar.【Method】BoSPx was cloned by using transcriptome sequencing, self-pollination and cross-pollination differential screening, and PCR cloning. Amino acid sequence alignment and conserved domain analysis were performed by DNAMAN and Smart software. Expasy online software was used to predict BoSPx protein molecular weight, isoelectric point, secondary structure and transmembrane domain. Phylogenetic tree that constructed by the neighboring method in MEGA6.0 software was used to speculate on the function of BoSPx protein after self-pollination.RT-PCR and qRT-PCR were used to detecttissue-specific expression and the relative expression of BoSPx after self-pollination and cross-pollination. The BoSPx-GFP expression vector was constructed and the subcellular localization of BoSPx was observed under confocal microscopy; The interaction proteins were searched by using yeast two-hybrid system. 【Result】A novel gene, which contains a single exon without any introns, namedwas cloned. The open reading frame ofis 396 bp, encodes a protein with 131 amino acid residues. BoSPx is a hydrophilic protein, no signal peptide and transmembrane, and the theoretical isoelectric point is 4.54. Conserved domains analysis found BoSPx contains three conserved EF-hand motifs (48-60, 64-80, and 81-96). About 500 bp up-stream oftranslation start code contains an auxin response element. RT-PCR analysis found that BoSPx was expressed highest in stigma,was also expressed in sepals, leaves, anthers and petals in flowering stage. Theexpression levels in both self-pollinated and cross-pollinated stigma showed “up-down-up” expression pattern. Moreover, The expression ofin the stigma of self-pollination and cross-pollination increased at first and then decreased down to the highest expression level in stigma in flowering stage. The expression ofincreased rapidly after self-pollination at 15 min and then decreased sharply so that result in SI progress. The decreased value ofwas 1-2 days before flowering. Subcellular location analysis found that BoSPx expression in both the nucleus and cytoplasm. Yeast two-hybrid system did not detect interaction between BoSPx and SRK and ARC1, but BoSPx interacted with auxin family proteins BoSAUR71 and BoPID.【Conclusion】BoSPx is highly expressed by self-pollination, which may be an auxin-regulated calcium-binding protein, which has a common response to SI and calcium.The protein has multi-tissue expression and nuclear and cytoplasmic properties, indicating that BoSPx may be involved in unknown signaling pathways other than the SRK-ARC1-ExO70A1 pathway.

; BoSPx; yeast two-hybrid; auxin; self-pollination; self-incompatibility

2018-04-21；

2018-07-21

國(guó)家自然科學(xué)基金（31572127）

王玉奎，Tel：13251395081；E-mail：wangyuk0808@163.com。

朱利泉，Tel：023-68250794；E-mail：zhuliquan@swu.edu.cn