張博宇，葛玉珍，韋宇靜，黎建楊，黃仕訓(xùn)*

(1. 廣西壯族自治區(qū)中國科學(xué)院廣西植物研究所，廣西 桂林 541006；2. 廣西大學(xué)林學(xué)院,廣西 南寧 530004)

【研究意義】降香黃檀(Dalbergiaodorifera)為蝶形花科黃檀屬常綠喬木，是重要的藥用觀賞植物，為國家二級保護(hù)植物，其木材為高級紅木，是很好的家具材料，被譽(yù)為“木中黃金”、“帝皇之木”。降香黃檀生長周期較長[1]，受氣候影響較大，又因其為熱帶陽性樹種，容易受到寒害凍害的威脅。如遭遇寒冬等極端惡劣氣候，將會(huì)影響其生長發(fā)育，降低其使用及利用價(jià)值。研究其不同產(chǎn)地抗寒性，對不同產(chǎn)地種子所培育苗木抗寒性進(jìn)行對比，擴(kuò)大不同產(chǎn)地種植區(qū)域，開展不同產(chǎn)地抗寒性研究將對降香黃檀的生產(chǎn)實(shí)踐具有指導(dǎo)意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】相關(guān)研究表明，適當(dāng)?shù)牡蜏孛{迫有助于植物抗寒性的提高[2-4]。張毅龍等[5]的研究結(jié)果表明降香黃檀在低溫脅迫下凈光合速率及葉綠素含量下降。郭文福等[6]進(jìn)行了降香黃檀北移試驗(yàn)，結(jié)果表明適當(dāng)北移對降香黃檀生長無過大影響。【本研究切入點(diǎn)】植物的抗寒性通常用電解質(zhì)來表達(dá)[7]，本研究則通過不同產(chǎn)地降香黃檀種子所培育苗木葉片中相對電導(dǎo)率及游離脯氨酸、可溶性糖和丙二醛(MDA)的含量來進(jìn)行表征。此外，目前對于降香黃檀的脅迫研究主要集中在干旱脅迫方面[8-11]，低溫脅迫研究相對較少，也鮮有抗寒性的相關(guān)報(bào)道。【擬解決的關(guān)鍵問題】收集8種不同產(chǎn)地的降香黃檀幼苗為試驗(yàn)材料，研究在人工模擬自然逐漸降溫條件下其離體葉片的電導(dǎo)率變化，配合Logistic方程計(jì)算出半致死溫度(LT50)，并通過測定與植物抗寒性相關(guān)的生理生化指標(biāo)，分析其耐寒性差異，以期為降香黃檀耐寒種質(zhì)的選育提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為熱帶起源的降香黃檀的引種選育及合理安排生產(chǎn)布局提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

在8個(gè)不同產(chǎn)地(海南尖峰嶺、海南儋州、福建仙游、福建福州、廣西桂林、廣西憑祥、廣東普寧和廣東肇慶)采集降香黃檀種子，于2016年3月播種于位于桂林的廣西植物研究所苗圃，采取常規(guī)措施培育苗木。2017年11月取生長勢基本一致的健康降香黃檀幼苗，選取其枝條中部葉片作為試驗(yàn)材料。各產(chǎn)地的基本情況見表1。

1.2 低溫脅迫處理

將葉片采摘裝入自封袋，帶回實(shí)驗(yàn)室后分別用自來水和蒸餾水沖洗后擦干，然后放入低溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行低溫處理。根據(jù)降香黃檀試驗(yàn)所在地廣西桂林雁山的年均溫度(約20 ℃)、絕對低溫(-6 ℃)及降香黃檀的耐受低溫溫度[12-13]，設(shè)置5個(gè)處理溫度(4、0、-3、-6及-9 ℃)，以室溫(約20 ℃)作為對照。參考王冠群等[14]的低溫處理方法并稍做適當(dāng)調(diào)整，當(dāng)?shù)蜏嘏囵B(yǎng)箱溫度為4 ℃時(shí)，將試驗(yàn)材料放入緩慢降溫，降溫速度為10 ℃·h-1，降至目標(biāo)溫度后維持3h。材料取出后分析測定電解質(zhì)滲出率，并進(jìn)行脯氨酸、可溶性糖和丙二醛等生理指標(biāo)的分析及鑒定，所有指標(biāo)重復(fù)測定3次。

1.3 相對電導(dǎo)率的測定和半致死溫度(LT50)的計(jì)算

將對照和經(jīng)過處理的葉片拿出后，用濾紙吸干表面水分，避開主脈把葉片剪碎，快速稱取3份，每份1.0 g，放入試管中，加入20 mL去離子水，室溫下浸泡處理6 h。先用DDS-11A型電導(dǎo)儀測定葉片浸提液電導(dǎo)率，記為R1，然后將具塞刻度試管放入水浴鍋沸水浴30 min，冷卻至室溫后搖勻，再次測定浸提液電導(dǎo)率，記為R2，最后用去離子水的電導(dǎo)率Rck作為對照，計(jì)算相對電導(dǎo)率(REC)=[(R1-Rck)/(R2-Rck)]×100 %。

用SPSS統(tǒng)計(jì)分析軟件對不同處理溫度與葉片相對電導(dǎo)率之間的關(guān)系進(jìn)行回歸分析，參考莫惠棟[15]、許瑛和陳發(fā)棣[16]、鄭曉翠等[17]、趙國富和張成磊[18]和徐海鴻等[19]的方法進(jìn)行計(jì)算。用Logistic回歸方程y=K/(1+ae-bx)求得拐點(diǎn)溫度即半致死溫度(LT50)。式中y為相對電導(dǎo)率，x為對應(yīng)的處理溫度，a、b為方程參數(shù)，K為相對電導(dǎo)率飽和值。將方程y=K/(1+ae-bx)轉(zhuǎn)化為ln[(K-y)/y]=lna-bx線性方程，令y*=ln[(K-y)/y]，則得到相對電導(dǎo)率(y*)與對應(yīng)處理溫度(x)的直線方程，經(jīng)過線性回歸求出a、b，拐點(diǎn)溫度即半致死溫度(LT50)為-lna/b。

1.4 生理生化指標(biāo)測定

降香黃檀離體葉片可溶性糖、游離脯氨酸(Pro)及丙二醛含量(MDA)含量的測定參考李合生[20]的方法，每個(gè)指標(biāo)重復(fù)測定3次。

表1 不同產(chǎn)地環(huán)境概況

表2 低溫處理下不同產(chǎn)地降香黃檀葉片相對電導(dǎo)率比較

注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，同列不同小寫字母表示在0.05水平上差異顯著，不同大寫字母表示在0.01水平上差異顯著。

Note: Data are mean±standard deviation, different lowercase letters in the same column indicate significant difference at 0.05 level, different uppercase letters represent significant differences at 0.01 level.

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel 2003、SPSS 24.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，用LSD法檢驗(yàn)不同處理間是否具有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫處理對不同產(chǎn)地降香黃檀葉片相對電導(dǎo)率的影響

由表2可知，在經(jīng)過一系列的低溫脅迫后，8個(gè)產(chǎn)地的降香黃檀葉片相對電導(dǎo)率隨著溫度的降低總體呈現(xiàn)上升趨勢，在降溫初期(20～-3 ℃)，8個(gè)產(chǎn)地葉片的相對電導(dǎo)率總體表現(xiàn)出緩慢小幅上升趨勢；當(dāng)溫度降至-3～-6 ℃時(shí)，葉片相對電導(dǎo)率大幅增加；當(dāng)溫度降至-6～-9 ℃時(shí)，葉片相對電導(dǎo)率變化有趨于穩(wěn)定的跡象，4和-6 ℃時(shí)無顯著差異(P>0.05，下同)。

從表2的變化幅度也可以看出，產(chǎn)自福建福州的葉片電導(dǎo)率變化幅度最小，在-9 ℃低溫脅迫下，只有產(chǎn)自福建福州的葉片的相對電導(dǎo)率保持在0.700以下的較低水平(0.659)。產(chǎn)自廣東肇慶、海南儋州及廣西憑祥的葉片電導(dǎo)率變化幅度較大，產(chǎn)自海南儋州的葉片在-9 ℃低溫脅迫下電導(dǎo)率達(dá)到0.833。

2.2 不同產(chǎn)地降香黃檀低溫半致死溫度(LT50)比較

由表3可知，Logistic方程擬合度均在0.930以上，說明方程擬合度結(jié)果可靠。半致死溫度的高低與抗寒性呈負(fù)相關(guān)，不同產(chǎn)地降香黃檀抗寒性存在一定的差異。根據(jù)表3，降香黃檀抗寒性強(qiáng)弱順序按照產(chǎn)地的排序如下：福建福州>廣西桂林>福建仙游>海南尖峰嶺>廣東普寧>廣東肇慶>廣西憑祥>海南儋州。

表3 低溫處理下不同產(chǎn)地降香黃檀葉片相對電導(dǎo)率方程及半致死溫度(LT50)

2.3 低溫處理對不同產(chǎn)地降香黃檀葉片生理指標(biāo)的影響

由表4可知，8個(gè)產(chǎn)地的降香黃檀葉片中脯氨酸含量隨著溫度的降低總體呈先上升后下降的趨勢。溫度為0 ℃時(shí)，海南儋州所產(chǎn)葉片脯氨酸含量達(dá)到峰值，其他7個(gè)產(chǎn)地葉片脯氨酸含量則在-3 ℃時(shí)達(dá)到峰值。LT50最低的福建福州產(chǎn)地降香黃檀脯氨酸含量為89.37 ng·g-1FW。當(dāng)溫度為20～0 ℃時(shí)，8個(gè)產(chǎn)地降香黃檀葉片中的脯氨酸含量變化幅度不大，從0 ℃降至-3 ℃時(shí)，其含量陡增，而后出現(xiàn)下降趨勢。

隨著溫度的下降，8個(gè)產(chǎn)地的降香黃檀葉片可溶性糖含量變化均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。當(dāng)溫度降至-3 ℃時(shí)，除了產(chǎn)自廣西憑祥的葉片外，其余7個(gè)產(chǎn)地的降香黃檀葉片可溶性糖含量均達(dá)到最高值。當(dāng)溫度為20 ℃時(shí)，不同產(chǎn)地葉片可溶性糖含量無顯著差異。溫度降至4 ℃以下時(shí)，相同處理溫度下不同產(chǎn)地降香黃檀可溶性糖含量存在顯著差異(P<0.05)。

在20 ℃時(shí)，8個(gè)產(chǎn)地降香黃檀葉片的MDA含量變化不大，但隨著溫度的降低，其含量隨著溫度的降低呈上升趨勢。

表4 低溫處理下不同產(chǎn)地降香黃檀葉片脯氨酸、可溶性糖及丙二醛含量的變化

續(xù)表4 Continued table 4

溫度(℃)Temperature產(chǎn)地Places脯氨酸含量(ng·g-1 FW)Proline content可溶性糖含量(mg·g-1 FW)Soluble sugar content丙二醛含量(nmol·g-1 FW)MDA concent福建福州89.37±3.78a125.89±3.17a21.08±0.98e廣西桂林86.33±8.21a119.39±1.78ab25.15±1.20d廣西憑祥68.55±3.90cd86.53±16.10c34.73±1.12a廣東普寧75.51±3.05bc119.03±13.95ab29.38±2.75bc廣東肇慶76.96±4.19bc105.73±1.21abc31.55±0.24abc-6海南尖峰嶺46.38±4.75bc107.81±4.71a25.94±0.37a海南儋州30.65±2.93d92.63±1.68bc24.67±1.28ab福建仙游41.49±3.70c96.99±5.05bc22.08±0.60bc福建福州54.20±2.34a100.85±5.73ab20.56±1.97c廣西桂林52.54±2.15ab87.98±6.32c22.61±2.42abc廣西憑祥45.40±2.48bc93.69±2.20bc23.04±1.17abc廣東普寧46.12±3.70bc90.34±4.17bc25.30±1.48ab廣東肇慶50.29±2.62ab88.41±0.72c23.66±0.58abc-9海南尖峰嶺40.87±1.45bc83.59±6.44a28.61±0.78ab海南儋州26.52±2.82e77.90±5.31ab26.46±1.18b福建仙游43.77±0.14ab78.00±8.18ab23.18±1.62c福建福州47.78±3.59a89.33±4.12a20.36±1.47c廣西桂林45.56±2.69ab85.62±4.60a22.70±1.18c廣西憑祥31.84±2.47d60.58±3.17b29.89±0.96a廣東普寧36.43±3.12c85.31±13.33a27.40±1.65ab廣東肇慶40.29±3.05bc68.56±15.56ab26.27±1.63b

注：同一溫度下的同列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示在0.05水平上差異顯著。

Note: The same column of data at the same temperature followed by different lowercase letters indicate a significant difference at 0.05 level.

3 討 論

降香黃檀原產(chǎn)于海南，主要分布于中國兩廣地區(qū)及福建等地。降香黃檀有較強(qiáng)的適應(yīng)性和速生性，但低溫是限制其正常生長的主要非生物脅迫因子之一[13, 21]。降香黃檀在國內(nèi)不同地域種植時(shí)，其抗寒性會(huì)因地理環(huán)境產(chǎn)生差異。武彥霞等[22]通過對核桃葉片抗寒性進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)植物在受到低溫脅迫時(shí)，植物細(xì)胞膜的通透性會(huì)增大，細(xì)胞膜損傷嚴(yán)重，相對電導(dǎo)率增加。令凡等[23]對油橄欖的研究結(jié)果表明植物在受到低溫脅迫時(shí)體內(nèi)的脯氨酸、可溶性糖和MDA含量均發(fā)生變化。

本試驗(yàn)中，隨著溫度的降低，8個(gè)產(chǎn)地的降香黃檀葉片相對電導(dǎo)率都呈現(xiàn)了上升趨勢，可能是由于在降溫初期，降香黃檀在一定范圍內(nèi)對低溫脅迫產(chǎn)生了自我保護(hù)反應(yīng)，細(xì)胞膜變化不明顯；持續(xù)降溫后，膜的通透性變化幅度增大，此時(shí)細(xì)胞膜正在遭受嚴(yán)重破壞，細(xì)胞膜將要基本喪失其功能，電解質(zhì)因此發(fā)生大量滲透。LT50是植物達(dá)到該溫度后呈半致死狀態(tài)，當(dāng)溫度繼續(xù)降低時(shí)，植物所受傷害不可逆轉(zhuǎn)，甚至死亡，是植物抗寒性重要指標(biāo)[24]。本試驗(yàn)中，產(chǎn)地為福建福州的降香黃檀抗寒性最強(qiáng)，其次為廣西桂林，可能是由于兩地緯度較高，年均溫低；海南儋州所產(chǎn)的降香黃檀抗寒性最差，可能是由于該地緯度較低，平均溫度較高。

脯氨酸是植物中必備的滲透調(diào)節(jié)劑，降香黃檀在遇低溫脅迫時(shí)脯氨酸含量顯著增加，起著保護(hù)植物免受滲透脅迫傷害的作用[25-26]。本試驗(yàn)中，8個(gè)產(chǎn)地的降香黃檀經(jīng)過低溫脅迫后，葉片中脯氨酸含量總體呈先上升后下降的趨勢，與羅丹等[27]報(bào)道的低溫脅迫對番茄幼苗脯氨酸積累變化趨勢相同，可能原因是植物在降溫初期體內(nèi)積累大量脯氨酸來提高自身的抗寒性，從而保持細(xì)胞膜的活性；后經(jīng)過不斷降溫，植物體內(nèi)的脯氨酸失活，在植物體內(nèi)的含量逐漸減少。總體而言，在相同低溫脅迫下，產(chǎn)地緯度高、LT50低的降香黃檀脯氨酸累積能力高于產(chǎn)地緯度低、LT50高的降香黃檀，前者能更好減輕低溫脅迫對自身造成的損傷。

可溶性糖同為降香黃檀葉片中滲透調(diào)節(jié)劑，對植物起著保護(hù)作用。本試驗(yàn)中，8個(gè)的產(chǎn)地降香黃檀經(jīng)低溫脅迫后，葉片中可溶性糖均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，可溶性糖含量最高的葉片產(chǎn)自福建福州，在-3 ℃時(shí)含量高達(dá)125.89 mg/g，說明產(chǎn)自福建福州的降香黃檀抗寒性最佳，與何云等[28]對3種植物葉片中可溶性糖含量變化趨勢的研究結(jié)果一致，表明溫度降低可以提高植物體內(nèi)的可溶性糖含量，調(diào)節(jié)植物組織的滲透壓，提高植物的抗逆性，保護(hù)細(xì)胞膜的完整性。后期可溶性糖降低可能是過度降溫后植物細(xì)胞膜遭到破壞而產(chǎn)生不可逆的影響、細(xì)胞膜的通透性變大所導(dǎo)致。

MDA的含量是細(xì)胞膜質(zhì)過氧化反應(yīng)的重要體現(xiàn)，植物體內(nèi)中MDA的含量決定著植物細(xì)胞膜受到的傷害的嚴(yán)重程度。當(dāng)植物體內(nèi)MDA含量大量增加時(shí)，說明植物細(xì)胞膜受到嚴(yán)重的破壞。本試驗(yàn)中，不同產(chǎn)地降香黃檀葉片中MDA含量總體呈上升趨勢，與李吉濤等[29]對不同低溫處理下金花茶MDA含量變化趨勢研究結(jié)果相符，表明隨著溫度的降低，植物中MDA含量變高，植物細(xì)胞膜質(zhì)已遭受到了破壞。

然而，不同產(chǎn)地降香黃檀的抗逆境能力評價(jià)指標(biāo)不能僅僅采用上述指標(biāo)進(jìn)行定論，還應(yīng)進(jìn)一步結(jié)合當(dāng)?shù)氐牡乩韰^(qū)位及氣候條件(如海拔、坡向、光照、水分、土壤、水源條件)等影響因素，同時(shí)還要結(jié)合植物自身的生長狀況來進(jìn)行深入的綜合分析評定。

4 結(jié) 論

產(chǎn)地為福建福州的降香黃檀抗寒性最佳，廣西桂林、福建仙游、海南尖峰嶺、廣東普寧、廣東肇慶及廣西憑祥所產(chǎn)降香黃檀抗寒性依次減弱，海南儋州所產(chǎn)降香黃檀抗寒性最弱。