陳彥云，李紫辰，曹君邁，徐勝明，莫 磊

(1. 寧夏大學(xué) 生命科學(xué)院，寧夏 銀川 750021；2.寧夏大學(xué)/西北退化生態(tài)系統(tǒng)恢復(fù)與重建教育部重點實驗室，寧夏 銀川 750021；3.北方民族大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院，寧夏 銀川 750021)

【研究意義】鹽漬化土壤分布很廣,約占陸地總面積的30 %[1],我國鹽漬土面積約3.47×107hm2[2]，居世界第4位。土壤鹽堿化是世界農(nóng)業(yè)生態(tài)退化的重大問題之一，它不僅造成資源破壞，而且還給生物圈和生態(tài)環(huán)境帶來了巨大壓力[3]，同時，已嚴重影響到我們賴以生存的作物發(fā)育及產(chǎn)量。因此，研究作物耐鹽性、選育耐鹽新品種已勢在必行[1]。對小麥[4]、水稻[5]、玉米[6]、馬鈴薯[7]、白榆[8]、甜菜[9]等耐(抗)鹽性生理生化及發(fā)育方面的研究均證實植物保護酶活性和發(fā)育與植物的抗鹽性有一定的關(guān)系。但用于評價植物耐鹽性的指標不完全一致[10]，因此，篩選適宜指標對植物耐鹽性進行有效評價并能應(yīng)用于生產(chǎn)尤為重要。【前人研究進展】馬鈴薯(SolanumtuberosumL.)是世界性的糧菜兼用作物，所面臨的一個重要難題便是鹽堿地的問題。鹽漬化土壤顯著影響馬鈴薯的生長發(fā)育，特別是對其苗有抑制作用[11]。馬鈴薯是耐鹽作物中對鹽中度敏感作物之一[12]，鹽脅迫影響馬鈴薯生長發(fā)育及生理特性[13]。鹽堿土壤和鹽水灌溉對馬鈴薯的產(chǎn)量具有一定影響[14]。一般認為，對作物危害最大的無機鹽是鈉鹽，即使是50 mM NaCl對于耐鹽性較強的水稻也是致死的[15]。龔家棟[16]認為馬鈴薯耐鹽極限值還無法定論。【本研究切入點】近年來，隨著馬鈴薯組織培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展，選用試管苗為試驗材料可克服外界環(huán)境條件難控性，且材料性狀能在相對一致的條件下得到表達?！緮M解決的關(guān)鍵問題】試管苗是研究發(fā)育中馬鈴薯塊莖生理的適宜模式系統(tǒng)[17]。利用該系統(tǒng)，前人報道的關(guān)于鹽脅迫下馬鈴薯脫毒苗試管苗生長發(fā)育特性及保護酶活性研究相對較多[2，17-22]，而將二者結(jié)合起來，利用兩因素隨機區(qū)組設(shè)計，研究馬鈴薯脫毒苗對NaCl 脅迫的響應(yīng)，并進一步通過主成份分析篩選馬鈴薯耐(抗)鹽指標，從而評價馬鈴薯品種的耐鹽性尚未見文獻報道。此實驗為開展早期抗鹽品種篩選提供技術(shù)支持，為后期篩選抗鹽品種和鹽堿地上推廣種植提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

克新1號(Kexin 1)，大西洋(Atlantic)，青薯168(Qingshu168)，脫毒基礎(chǔ)苗由北方民族大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院細胞生物學(xué)實驗室提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗設(shè)計 試驗采用兩因素隨機設(shè)計，因素1為品種，分3個品種：大西洋、克新1號、青薯168；因素2為NaCl鹽濃度，分5種濃度處理： 0 (CK)、17、34、102、136 mmol·L-1，試驗重復(fù)3次，共15個處理，每個處理接種10瓶，均于培養(yǎng)30 d時供生理指標和主要農(nóng)藝指標測定。

1.2.2 組織培養(yǎng)方法 將繼代培養(yǎng)的脫毒苗按單節(jié)莖切段轉(zhuǎn)移到MS培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。培養(yǎng)基組成為MS+各鹽濃度。培養(yǎng)瓶直徑為6.5 cm，內(nèi)裝40 mL脅迫培養(yǎng)基，接種量25株/瓶。

1.2.3 培養(yǎng)條件 參照曹君邁的實驗方法進行[23]。

1.3 農(nóng)藝性狀測定

培養(yǎng)30 d時從各瓶中取出25株馬鈴薯幼苗洗凈，分別使用直尺以及游標卡尺分別測定馬鈴薯幼苗的株高、莖粗及葉片數(shù)，使用數(shù)據(jù)記錄表格記錄相關(guān)數(shù)據(jù)。

1.4 生化指標的測定

CAT活性采用紫外吸收法[24]。POD活性的采用愈創(chuàng)木酚[24]法。電導(dǎo)率 (Electrical Conductivity)的測定采用外滲電導(dǎo)法[19]。脯氨酸含量的測定采用茚三酮法[24]。

1.5 數(shù)據(jù)分析

用Microsoft ExceL2003進行數(shù)據(jù)處理并計算標準誤差(±SD)。SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行方差分析、Duncan’s新復(fù)極差差異顯著性檢驗，對調(diào)查的各性狀指標的均值輸入此軟件，進行主成分分析。繪圖采用SigmaPlot12.0進行。

2 結(jié)果與分析

2.1 NaCl脅迫對3個品種脫毒苗生理指標的影響

2.1.1 NaCl脅迫對3個品種脫毒苗中CAT活性的影響 由表1可知，鹽脅迫對3個馬鈴薯品種脫毒苗CAT活性的影響規(guī)律基本一致(P<0.05)。隨著鹽濃度的升高首先表現(xiàn)出34 mmol·L-1的鹽濃度處理的脫毒苗CAT活性升高，其他處理降低，其中大西洋和克新1號降低幅度較大，而青薯168中CAT活性降低幅度較小?？诵?號品種脫毒苗在34 mmol·L-1鹽濃度時，活性顯著高于對照處理(CK)，表現(xiàn)出較好的應(yīng)激反應(yīng)，但隨著鹽濃度的增高，其他3個處理的鹽濃度CAT活性均低于CK，其應(yīng)激能力下降，耐鹽程度為68 mmol·L-1。大西洋品種也表現(xiàn)出相同的規(guī)律，只是34 mmol·L-1鹽濃度處理的脫毒苗CAT活性與CK無顯著差異，而與其他處理達顯著水平，耐鹽程度為68 mmol·L-1。青薯168苗子生長弱在34 mmol·L-1鹽濃度處理時，表現(xiàn)臨界反應(yīng)，CK與34 mmol·L-1處理之間無顯著差異，但與其余各處理之間達顯著水平，耐鹽的程度為68 mmol·L-1。因此，無論哪個品種，34 mmol·L-1鹽濃度處理，CAT活性增高或保持未處理鹽濃度水平，隨后下降。68 mmol·L-1處理CAT急劇下降，清除自由氧基的能力下降，耐鹽能力下降。

表1 鹽濃度對馬鈴薯脫毒苗CAT 活性的影響

注：同列標不同字母者為差異顯著(P<0.05)，下同。

Note: Means with different small letters in same column means significance at 0.05 level. The same as below.

2.1.2 NaCl脅迫下3個品種中POD活性變化 從表2可知，鹽脅迫對3個馬鈴薯品種脫毒苗POD均有影響，在34 mmol·L-1鹽濃度處理時，克新1號和大西洋馬鈴薯中的POD活性升高，而青薯168 POD活性降低；隨后，另外幾個鹽濃度處理3個品種均隨著鹽濃度的升高，POD活性表現(xiàn)出降低的趨勢。從克新1號品種來看，17、68 mmol·L-1鹽濃度處理的脫毒苗POD活性無顯著差異，卻顯著高于0、136；102、136 mmol·L-1之間存在顯著差異，68、102 mmol·L-1鹽濃度處理之間無顯著差異，但它們與對照處理之間存在顯著差異，136 mmol·L-1時POD活性顯著低于0處理，耐受鹽程度為102 mmol·L-1。從大西洋品種來看，鹽濃度各處理之間均存在顯著差異，POD活性順序為34 mmol·L-1>68 mmol·L-1>0>102 mmol·L-1>136 mmol·L-1，102 mmol·L-1時POD活性顯著低于0處理，POD活性出下降，耐受鹽程度為68 mmol·L-1。青薯168對照處理POD活性顯著高于其他處理，34 mmol·L-1有高于其他3個處理，能耐受鹽的的程度為34 mmol·L-1。因此，克新1號耐鹽性強于大西洋，大西洋強于青薯168。

2.1.3 NaCl脅迫下3品種EC的變化 如表3所示，3個品種不同鹽濃度處理對EC影響表現(xiàn)出相同的規(guī)律，隨著鹽濃度增加，EC不斷增加。3個品種不同鹽濃度各處理之間存在顯著差異，說明隨著鹽濃度處理增大，脫毒苗的細胞膜滲透率加大，隨著鹽濃度的增加對葉片質(zhì)膜造成了傷害，鹽濃度超過102 mmol·L-1時，已高達68 %以上，嚴重影響了馬鈴薯脫毒苗的生長，136 mmol·L-1時，影響到馬鈴薯脫毒苗的存活。馬鈴薯能耐受鹽的的程度為68 mmol·L-1。

2.1.4 NaCI脅迫下馬鈴薯脫毒苗葉片脯氨酸含量的變化 從表4可知，隨著鹽濃度的增加，脯氨酸含量逐漸升高?？诵?號和大西洋,在鹽濃度為136 mmol·L-1時,脯氨酸含量顯著高于對照處理，與其它鹽濃度處理之間無顯著差異。青薯168各濃度的鹽脅迫處理之間不顯著。

2.1.5 不同品種脫毒苗鹽處理后對CAT、POD、脯氨酸、和EC的影響 從3個品種來看，青薯168 CAT活性顯著高于克新1號和大西洋，但后二者之間無顯著差異(圖1-A)，然而，青薯168CAT活性在鹽0處理時就高與其它2個品種，隨著鹽濃度的升高，反而降低(表1)，說明青薯168清除自由氧基的能力弱于克新1號和大西洋；POD活性3個品種之間存在顯著差異，克新1號顯著高于大西洋，大西洋顯著高于青薯168(圖1-B)，說明3個品種的抗逆性強克新1號>大西洋>青薯168；脯氨酸含量3個品種之間存在顯著差異，克新1號與大西洋之間無顯著差異，但于青薯168之間有顯著差異(圖1-C)，說明青薯168抗逆性能力弱于克新1號和大西洋；EC 3個品種之間有顯著差異，EC青薯168>大西洋>克新1號,說明3個品種的細胞膜透性，青薯168>大西洋>克新1號(圖1-D)?？傊?，鹽脅迫下，由于品種不同保護酶系統(tǒng)的平衡能力不同，從綜合指標來看，克新1號反應(yīng)平衡能力>大西洋>青薯168。

表2 鹽濃度對馬鈴薯脫毒苗POD活性的影響

表3 鹽濃度對馬鈴薯脫毒苗EC的影響

表4 鹽脅迫對馬鈴薯脫毒苗葉片脯氨酸含量的影響

2.2 NaCl脅迫對不同馬鈴薯品種農(nóng)藝性狀的影響

由圖2-A可以看出，不同鹽濃度處理對株高有顯著的影響(P<0.05)，隨著鹽濃度的增加，株高顯著降低。無NaCl處理的3個品種株高最高,但由于品種的遺傳特性不同，株高出現(xiàn)差異，克新1號高于大西洋，大西洋高于青薯168。隨著鹽濃度的增加，株高降低?？诵?號和大西洋株高隨鹽濃度上升則迅速下降，青薯168下降緩慢，最后株高均達到3cm左右。鹽脅迫抑制了3個品種的增高。

由圖2-B可知，不同鹽濃度處理對莖粗有顯著的影響(P<0.05)，隨著鹽濃度的增加，莖粗顯著增加。無NaCl處理的3個品種莖粗最低。鹽濃度136 mmol·L-1處理時，各品種莖粗達到最大。由于品種的遺傳特性不同，其莖粗產(chǎn)生差異，大西洋莖粗最粗，其次為克新1號，最差為青薯168。鹽脅迫在本試驗濃度范圍內(nèi)有利于莖粗的增加。

由圖2-C可知，不同鹽濃度處理對葉片數(shù)有顯著的影響(P<0.05)，隨著鹽濃度的增加，葉片數(shù)顯著減少。無NaCl處理的3個品種葉片數(shù)最多，葉片數(shù)最高達到大西洋10片，最低大西洋5片，但由于品種的遺傳特性不同，其葉片數(shù)有一定差異，大西洋高于克新1號，克新1號高于青薯168。隨著鹽濃度的增加，葉片數(shù)降低。克新1號和大西洋株高隨鹽濃度上升則下降幅度較快，青薯168(3片)下降緩慢，葉片數(shù)最后均達3片左右。鹽脅迫抑制了3個品種葉片數(shù)的增加。

圖1 品種對馬鈴薯脫毒苗CAT、POD、MDA 和 EC的影響Fig.1 Effects of different varieties of potato virus-free seedlings under salt stress on CAT, POD, proline and EC

圖2 鹽濃度對馬鈴薯品種農(nóng)藝性狀的影響Fig.2 Effects of salt concentration on agronomic propertiesties of virus-free shoots of potato

由圖2-D可知，不同鹽濃度處理對根條數(shù)有顯著的影響(P<0.05)，隨著鹽濃度的增加，根條數(shù)顯著減少。無NaCl處理的3個品種根條數(shù)最多，根條數(shù)最高的克新1號,最低是青薯168,由于品種不同，根條數(shù)有一定差異。3個品種無NaCl處理的根條數(shù)均顯著高于102和136 mmol·L-1鹽濃度處理的,68 mmol·L-1鹽濃度處理的與以上濃度處理均無顯著差異，除青薯168外，其余2個品種34 mmol·L-1鹽濃度處理與無NaCl處理結(jié)果相同。鹽脅迫抑制了3個品種的根條數(shù)的增加。

由圖2-E可知，不同鹽濃度處理對鮮重有顯著的影響(P<0.05)，隨著鹽濃度的增加，鮮重顯著減少。無NaCl處理的3個品種鮮重最高，鮮重最高的克新1號,最低是青薯168,由于品種不同，鮮重有一定差異。3個品種無NaCl處理的鮮重均顯著高于68、102和136 mmol·L-1鹽濃度處理的,后三者之間無顯著差異，34 mmol·L-1鹽濃度處理的與以上濃度處理均無顯著差異，鹽脅迫抑制了3個品種鮮重的增加。

表5 特征值和累積貢獻率

表6 初始因子載荷矩陣

因此，隨著鹽濃度的增加，馬鈴薯株高降低、莖粗增加、根條數(shù)、葉片數(shù)、鮮重減少，馬鈴薯脫毒苗生長受到顯著抑制；且克新1號、大西洋較青薯168耐鹽。

2.3 不同濃度鹽脅迫和不同品種的生化及農(nóng)藝性狀指標的主成分分析

由表5可知， 本實驗有9個成份，按方差貢獻率的大小把各特征值提取了第1主成份、第2主成份、第3主成份，3個主成份的累積貢獻率為93.93 %>85 %，因而本實驗有3個主成份，其余特征值的意義不明確，不能使用。那么9個指標成份變成了3個新的指標成份，第1個是根條數(shù)主成份，第2個是莖粗主成份，第3個是葉片數(shù)主成份，這3個主成份互不相干，但又反應(yīng)了原來多指標的信息。

表6是將輸入的各指標原始數(shù)據(jù)經(jīng)統(tǒng)計軟件進行了無量綱化處理，并對提取的成份進行了矩陣，所得的結(jié)果，即初始因子載荷矩陣。

對主成份的特征值開方，得特征根。用初始因子載荷矩陣值除以相對應(yīng)的主成份特征根，便得到特征根的特征向量，見表6。

由表7特征根的特征向量，構(gòu)成了原來多指標的線性組合。

設(shè)第1主成份根條數(shù)為y1、第2主成份為莖粗y2、第3主成份為葉片數(shù)y3,則y1=0.16x1-0.29x2+......+0.38x9；在y1的線性組合中，x1根條數(shù)的系數(shù)較小外，其次是除EC幾個生理指標，但莖粗和EC的符號為負。鹽脅迫首先直接作用的植物器官就是根，它即影響植物根形態(tài)的建成，又影響其他器官的形成，要想增加根條數(shù)，就得提高作物產(chǎn)量、葉片數(shù)和株高，降低EC，所以選用抗耐鹽品種，農(nóng)藝性狀指標是關(guān)鍵。y2=0.27x1+0.15x2+......+0.30x9，y2，莖粗除脯氨酸影響最大外，其余3個生化指標符號均為負。要想增加莖粗，就得提高莖粗、株高、葉片數(shù)、脯氨酸，降低POD、EC、CAT。y3=0.07x1+0.58x2+......+0.03x9，葉片數(shù)主成份以POD、EC、鮮重、株高、葉片數(shù)影響最大，要想增加葉片數(shù)，就得增加株高和POD，降低EC。通過表7可以看出，EC值對3個主成份影響穩(wěn)定，均表現(xiàn)為負值，也就是說電導(dǎo)率越大，品種的抗逆性下降。從3個主成份包涵的信息分析，抗鹽性的強弱，取決于葉片數(shù)、株高的長勢優(yōu)劣及EC值的降低。

表7 特征向量及指標權(quán)重

表8 NaCl處理和不同品種綜合得分

指標權(quán)重=[(特征根的特征向量×對應(yīng)提取方差貢獻率)÷累積貢獻率]÷∑[(特征根的特征向量×對應(yīng)提取方差貢獻率)÷累積貢獻率]。在鹽脅迫下，電導(dǎo)率、葉片數(shù)、株高和POD指標權(quán)重最大，分別為：0.28、0.24、0.23和0.22。POD測定較為繁瑣，在實際應(yīng)用中不宜操作可淘汰。電導(dǎo)率、葉片數(shù)、株高可作為篩選鑒定馬鈴薯耐鹽性品種的有效指標。

將各指標值乘相應(yīng)的指標權(quán)重系數(shù)，得不同品種不同鹽濃度綜合得分，同時將不相同品種的不同鹽濃度綜合相加得品種的綜合得分。由表8可知，綜合得分順序克新1號>大西洋>青薯168。克新1號、大西洋品種在34 mmol·L-1脅迫時得分超過0處理，說明機體活力加強，該品種有一定的耐鹽性，青薯168得分略低于0處理，隨著鹽濃度的增加得分持續(xù)下降，抗鹽能力下降，耐鹽能力較差。由此說明馬鈴薯脫毒苗克新1號的、大西洋耐鹽值為68 mmol·L-1，青薯168耐鹽值為34 mmol·L-1。

3 討 論

馬鈴薯的耐鹽基因是受多效基因控制的數(shù)量性狀遺傳，通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)創(chuàng)造耐鹽品種困難大，離實際應(yīng)用相差甚遠[25]，耐鹽品種篩選就成為解決此問題的有效方法。但用于評價植物耐鹽性的指標不完全一致。龔家棟[16]認為可用直線回歸方程的截距大小來確定各品種耐鹽性；王新偉[26]、張景云[30]認為馬鈴薯試管苗的生長和生物學(xué)產(chǎn)量指標可以用來評價其耐鹽性。張俊蓮[10]認為植株生長高度是較存活率靈敏的馬鈴薯鹽逆境反應(yīng)指標。本實驗隨著鹽濃度的增加，馬鈴薯株高降低、莖粗增加、根條數(shù)、葉片數(shù)、鮮重減少，馬鈴薯脫毒苗生長受到顯著抑制，與眾多學(xué)者的結(jié)果相一致[10，17，20]。鹽脅迫改變了植株的形態(tài)，抑制了其生長發(fā)育，是判斷耐鹽性的重要指標。

鹽脅迫使植物體內(nèi)的活性氧增加，代謝產(chǎn)物增加，細胞膜功能發(fā)生改變甚至破壞。自1975年Fridovich[27]提出生物自由基傷害學(xué)說以來,多數(shù)學(xué)者從能清除植株體內(nèi)積累的活性氧及自由基的POD、SOD和CAT保護酶及代謝產(chǎn)物MDA，脯氨酸等入手，研究在逆境條件下的變化規(guī)律和防御機制。 通過大量的實驗表明，生理生化指標可以評價植物耐鹽性[10]，但有些學(xué)者認為利用生理生化指標鑒定馬鈴薯的耐鹽性的過程操作復(fù)雜，鑒定結(jié)果波動性大，利用效果不佳[28]。本實驗表明馬鈴薯在能耐受鹽脅迫的條件下，POD和CAT活性迅速提高，以清除植物體內(nèi)大量的自由氧基，維持細胞膜的穩(wěn)定性?？诵?號和大西洋在34 mmol·L-1鹽脅迫時，POD、CAT和脯氨酸呈上升趨勢，與前人的研究結(jié)果一致。而青薯168的POD、CAT活性開始下降，因品種的抗鹽能力不同而表現(xiàn)不同，與前人的研究結(jié)果不同[2，17，21]。孫曉光[19]認為在馬鈴薯研究中，SOD波動性大，規(guī)律性不強，本實驗未涉及此指標。3個品種的脯氨酸含量隨著鹽濃度的增加而增加，隨鹽濃度的升高而升高與張景云[30]，張俊蓮[10]的結(jié)果一致。但作為植物細胞滲透調(diào)節(jié)劑的脯氨酸含量增加，并不能說明該品種的抗鹽能力，它受測定時間等因素的影響[10]。而張俊蓮當鹽度超過馬鈴薯的耐受力時，脯氨酸含量的高低就無意義了[22]。

過量的鹽濃度鹽脅迫對馬鈴薯造成了鹽害，使馬鈴薯脫毒苗自由基代謝失衡，活性氧下降，電導(dǎo)率增加，細胞膜的通透性增加，與孫曉光[19]、張瑞久[18]、崔焱森[22]表現(xiàn)出相同的變化規(guī)律。電解質(zhì)外滲率的高低可以反映出細胞膜受損的狀態(tài)，相對電導(dǎo)度可作為鑒定馬鈴薯耐鹽性強弱的指標[17]。

Chauhan[29]等認為馬鈴薯的耐鹽極限為4.0 ds/m，龔家棟[16]認為馬鈴薯耐鹽極限值還無法定論。馬鈴薯商品薯的生產(chǎn)要經(jīng)歷不同種級的種薯繁育階段，才能進入大田生產(chǎn)。因此不同生長發(fā)育階段其耐鹽能力不同，最脆弱的階段就是幼苗階段，對幼苗有顯著抑制作用[13]。而以脫毒幼苗為實驗體系時，其耐鹽能力更低，多數(shù)學(xué)者認為，NaCl 的臨界脅迫濃度為 70 mmol/L左右[17,19-22]，本實驗通過主成份分析馬鈴薯脫毒苗克新1號、大西洋耐鹽值為68 mmol·L-1，與前人結(jié)果基本一致，但青薯168耐鹽值為34 mmol·L-1，與前人不同，因此，其值還受品種的影響。

縱觀前人實驗，雖然都測定了農(nóng)藝性狀指標和生化指標，也表現(xiàn)出一定的規(guī)律，但指標繁多，無法科學(xué)取舍，因此，本實驗把眾多的指標利用主成份分析法，使各指標失去量綱，能在同一尺度下進行綜合評價，篩選出電導(dǎo)率、葉片數(shù)、株高可作為耐鹽品種篩選的評價指標。