張 宇，唐志鵬，秦榮耀，焦丁華，王長江

(1. 廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院，廣西 南寧 530004；2. 廣西壯族自治區(qū)亞熱帶作物研究所，廣西 南寧 530001；3. 遂川縣農(nóng)業(yè)局，江西 吉安 343900；4. 鄒城市林業(yè)局，山東 濟(jì)寧 273500)

【研究意義】金柑(Kumquat)為蕓香科(Rutaceae)金柑屬(FortunellaSwingle)植物[1-3]，發(fā)源地為中國。金柑是藥食兩用型經(jīng)濟(jì)樹種[2]，其藥用合成機(jī)理是目前金柑分子生物學(xué)研究的潮流和趨勢，獲取高質(zhì)量的蛋白質(zhì)是藥用合成機(jī)理研究的前提。因此，進(jìn)行金柑葉片蛋白質(zhì)提取的相關(guān)研究，摸索出一套適合金柑葉片蛋白質(zhì)的提取方法，對金柑蛋白質(zhì)藥用價值的研究具有深遠(yuǎn)意義，也可為其他近緣植物高質(zhì)量蛋白質(zhì)的提取提供科學(xué)參考依據(jù)。【前人研究進(jìn)展】鄧貴明等[4]選取‘春甜橘’為供試材料，分別研究了果皮和葉片組織蛋白質(zhì)的提取方法，結(jié)果表明兩者皆以TCA提取法效果最佳，其單雙向電泳圖分辨率高、蛋白點(diǎn)既清晰又均勻。表明該法可同時獲得高質(zhì)量和高產(chǎn)率的蛋白質(zhì)。鐘鳳林等[5]采用Tris-HCl提取法提取琯溪蜜柚汁胞蛋白質(zhì)，其雙向電泳圖辨率高、蛋白點(diǎn)圓潤少縱橫紋，說明該法是提取琯溪蜜柚汁胞蛋白質(zhì)的理想方法。龐新華等[6]以金柑近緣植物黃皮作為供試材料，分別采用Tris-HCl提取法、三氯乙酸(TCA)/丙酮提取法、尿素(Thi)/硫脲(Urea)提取法和酚(Phe)-甲醇/醋酸銨沉淀提取法提取黃皮葉片組織蛋白，研究發(fā)現(xiàn)三氯乙酸(TCA)/丙酮提取法不僅可以較好地去除黃皮葉片存在的非蛋白質(zhì)物質(zhì)，而且可以獲得高質(zhì)量的蛋白質(zhì)。宋小寧等[7]以金柑近緣植物檸檬為原料，通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，研究了不同因素對檸檬總蛋白質(zhì)提取的影響。研究發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)在磷酸緩沖液中的溶解性較好，粗提取的最佳工藝為：硫酸銨飽和度80 %，溫度20 ℃，料液比1∶20(g∶mL)，浸提若干小時，蛋白質(zhì)提取率為83.00 %?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】有關(guān)金柑近緣植物柑橘蛋白質(zhì)的提取研究報道較多，然而以金柑為供試材料進(jìn)行蛋白質(zhì)提取的相關(guān)研究仍較為少見?！緮M解決的關(guān)鍵問題】采用Tris-HCl提取法、尿素提取法、DTT/丙酮提取法和TCA/丙酮提取法結(jié)合蛋白質(zhì)產(chǎn)率、單向電泳圖和雙向電泳圖等指標(biāo)綜合分析不同金柑葉片蛋白質(zhì)提取方法的差異，嘗試建立一種適合金柑葉片蛋白質(zhì)提取理想方法，為金柑蛋白質(zhì)藥用合成機(jī)理的研究奠定基礎(chǔ)。也為其它近緣植物蛋白質(zhì)的獲取提供參考依據(jù)和素材借鑒[8-9]。

1 材料與方法

1.1 供試材料

選取‘桂金柑一號’無病蟲害的新鮮葉片為供試材料，樣品采集自廣西大學(xué)果樹種質(zhì)資源圃。采集時間為2017年11月18日，采摘后立刻放入經(jīng)液氮預(yù)冷的塑料泡沫盒內(nèi)，回到實(shí)驗(yàn)室清潔葉片，并移至-70 ℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆肹10]。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 Tris-HCl提取法 稱取0.5～1.0 g金柑葉片樣品放入研缽，加入0.1 g PVP粉末，加入少許石英砂，加入液氮充分研磨成干粉末，將粉末轉(zhuǎn)移到10 mL離心管中，加入5 mL蛋白質(zhì)提取緩沖液包括68 mmol Tris-HCl(pH6.7)， 0.6 % SDS， 10 %甘油和3 %β-巰基乙醇， 振蕩器振蕩15 s，4 ℃放置1 h，充分溶解蛋白質(zhì)。4 ℃ 12 500 r/min 離心25 min，取上清液2.0 mL轉(zhuǎn)移至10 mL 離心管中，加入6 mL丙酮(經(jīng)-30 ℃預(yù)冷20 min)，上下顛倒充分混勻，放入-20 ℃冰箱，沉降蛋白質(zhì)2 h， 12 500 r/min離心15 min，留沉淀蛋白，抽真空揮發(fā)丙酮濃縮成干粉，于-70 ℃保存待用。

1.2.2 二硫蘇糖醇(DTT)/丙酮提取法 稱取0.5～1.0 g金柑葉片和少許石英砂同時放入研缽中，迅速往研缽中加液氮研磨成粉末狀，將粉末轉(zhuǎn)入7 mL離心管中，加入4 mL含2 % DTT的水溶液，4 ℃ 12 500 r/min 離心30 min，取上清液2 mL轉(zhuǎn)移到10 mL離心管中，加入6 mL丙酮(丙酮經(jīng)-30 ℃預(yù)冷20 min)，上下顛倒充分混勻，放入-20 ℃冰箱，沉降蛋白質(zhì)若干小時，然后，4 ℃ 12 500 r/min，離心30 min，留沉淀蛋白，抽真空揮發(fā)丙酮濃縮成干粉，于-70 ℃保存待用。

1.2.3 三氯乙酸(TCA)/丙酮提取法 按照1.2.2步驟將金柑葉片和少許石英砂研磨成干粉，將干粉轉(zhuǎn)移入10 mL離心管中，加入6 mL預(yù)冷的10 %三氯乙酸/丙酮，渦旋混勻，-30 ℃沉淀若干小時，12 500 r/min 離心25 min，取2 mL上清液轉(zhuǎn)移入10 mL離心管中，加入3倍體積的丙酮，充分混勻，12 500 r/min離心20 min，棄上清液，抽真空揮發(fā)丙酮濃縮成干粉，于-70 ℃保存待用。

1.2.4 尿素提取法 研缽經(jīng)液氮預(yù)冷后，放入預(yù)先稱取的0.5 g金柑葉片，再放入若干石英砂，倒入液氮迅速研磨成綠色粉面狀，將綠色干粉轉(zhuǎn)移入預(yù)冷過的10 mL離心管中，加入5 mL蛋白質(zhì)提取液(16.225 g尿素，60 μl乙二醇溶于500 mL雙蒸水)，常溫下浸提2 h，上下顛倒混勻，4 ℃12 500 r/min 離心20 min，取上清液2 mL轉(zhuǎn)移入10 mL離心管中，加入3～4倍體積的丙酮，12 500 r/min 離心15 min，留沉淀，抽真空出去殘留丙酮濃縮成干粉，置于-70 ℃冰箱保存。

1.2.5 蛋白質(zhì)含量檢測 采用Bradford法測定蛋白質(zhì)產(chǎn)率[11-13]。

1.3 電泳檢測與圖片生成

1.3.1 SDS-PAGE電泳檢測 以Sambrook等[14]作為檢驗(yàn)流程藍(lán)本。將樣品溶解在緩沖液(Tris-HCl 0.55 mmol/L且 pH 調(diào)節(jié)在7；SDS 3.2 %；甘油7.8 %；β-巰基乙醇0.055 %)中，緩沖液溶解適量樣品，分離膠產(chǎn)率12 %，濃縮膠產(chǎn)率6 %，上樣產(chǎn)率2.5 μg/μl，電泳用量10 μl，溴酚藍(lán) 2 μl，選擇電壓強(qiáng)度15 V/cm 電泳，等濃縮膠中蛋白質(zhì)泳出，再換電壓強(qiáng)度30 V/cm繼續(xù)電泳，待距離膠底1 cm處位置出現(xiàn)溴酚藍(lán)，電泳結(jié)束。蛋白銀染顯示[15]。

1.3.2 雙向電泳檢測 以張宇等[16]的方法作為參考依據(jù)。

1.3.3 制作圖像 選用捷易拍A4-500儀器進(jìn)行凝膠圖譜掃描。

2 結(jié)果與分析

2.1 4種方法提取結(jié)果的分析

Tris-HCl提取法、DTT/丙酮提取法、TCA/丙酮提取法和尿素提取法提取的金柑葉片蛋白質(zhì)質(zhì)量和產(chǎn)率結(jié)果見表1。上述方法提取的蛋白質(zhì)產(chǎn)率依次為：5.33、5.97、5.09和3.12 mg/g。DTT/丙酮提取法產(chǎn)率極顯著高于TCA/丙酮提取法和尿素提取法，與Tris-HCl提取法差異不顯著；尿素提取法產(chǎn)率極顯著低于其余3種方法。

表1 4種方法提取的金柑葉片蛋白質(zhì)

注：差異極顯著(P<0.01)和顯著(P<0.05) 用同一字母的不同大小寫表示。

Note: Significant difference (P<0.01) and significant difference (P<0.05) are expressed in different case of the same letter.

DTT/丙酮提取法具有簡潔快速的優(yōu)勢，但提取的蛋白質(zhì)有泛黃現(xiàn)象，說明蛋白質(zhì)含有雜質(zhì)，聚焦效果差，對雙向電泳不利；尿素提取法提取的蛋白質(zhì)質(zhì)量符合后續(xù)實(shí)驗(yàn)純度要求，但產(chǎn)率低，不利于大規(guī)模操作；Tris-HCl提取法和TCA/丙酮提取法提取的蛋白質(zhì)各項(xiàng)指標(biāo)較為相近，但從產(chǎn)率角度來看，Tris-HCl提取法相對較好。

2.2 單向電泳結(jié)果比較

通過一維SDS-PAGE電泳分離4種不同方法提取的金柑葉片蛋白質(zhì)(圖1)，經(jīng)肉眼觀察，電泳普帶數(shù)量和普帶顏色深淺層次具有明顯區(qū)別。Tris-HCl提取法和DTT/丙酮提取法提取的金柑葉片蛋白質(zhì)的SDS-PAGE電泳圖譜背景較深，普帶間存在粘連現(xiàn)象，蛋白質(zhì)普帶數(shù)量區(qū)別不大；尿素提取法提取的蛋白的SDS-PAGE圖譜底色較淺，可是普帶數(shù)量太少且普帶間層次感不夠豐富；TCA/丙酮提取法提取的金柑葉片蛋白質(zhì)的電泳圖譜背景色恰到好處，普帶清晰可見、層次分明且數(shù)量豐富，便于后續(xù)分析，普帶多集中在29～97 kD區(qū)間。Tris-HCl提取法和DTT/丙酮提取法提取蛋白質(zhì)的SDS-PAGE圖譜底色較為濃重，由此推斷兩者提取的蛋白質(zhì)中存在大量雜質(zhì)干擾(鹽離子產(chǎn)率越大背景色越深)。從帶型和底色判斷，Tris-HCl提取法比DTT/丙酮提取法提取的蛋白質(zhì)純度更高；尿素提取法提取蛋白質(zhì)的SDS-PAGE圖背景較淺且譜帶少，可能是由于該法操作流程以及所用提取試劑成分比例組合可以更強(qiáng)有力的除去核酸、糖類等雜質(zhì)，同時也連帶除去了部分與雜質(zhì)緊密結(jié)合的蛋白質(zhì)，降低了蛋白質(zhì)的提取效率。4種方法中TCA/丙酮法可以獲得背景適中，數(shù)量大且層次感分明的條帶，表明此法的提取效果優(yōu)于其它3種方法。

2.3 2-DE電泳圖譜比較分析

使用不同方法提取金柑葉片蛋白質(zhì)，其2-DE圖譜結(jié)果差異明顯(圖2)。肉眼觀察，4種蛋白質(zhì)提取法都可以獲得蛋白點(diǎn)豐富的2-DE圖譜，尿素提取法提取蛋白質(zhì)獲得的蛋白點(diǎn)數(shù)較其他3種方法少。DTT/丙酮提取法和TCA/丙酮提取法提取蛋白點(diǎn)存在許多橫縱紋現(xiàn)象，說明樣品中蛋白質(zhì)含有較多的雜質(zhì)，在縱橫方向存在干擾。Tris-HCl提取法提取的蛋白點(diǎn)形狀為圓點(diǎn)狀、數(shù)量豐富、布局分明、背景理想、極少數(shù)蛋白點(diǎn)表現(xiàn)拖尾、縱橫走向。按提取的蛋白點(diǎn)數(shù)量的多少從高到低依次排序?yàn)椋篋TT/丙酮提取法、Tris-HCl提取法、TCA/丙酮提取法和尿素提取法，最高提取點(diǎn)數(shù)是最低提取點(diǎn)數(shù)的1.66倍(表2)。結(jié)合蛋白質(zhì)提取產(chǎn)率、單向和雙向電泳結(jié)果以及提取蛋白點(diǎn)數(shù)量等數(shù)據(jù)分析，Tris-HCl提取法不但可以有效去除金柑葉片中所含雜質(zhì)，而且還能得到產(chǎn)率較高的蛋白質(zhì)，單雙向電泳后蛋白質(zhì)分離效果也較理想。因此，Tris-HCl提取法相較其他3種方法更適用于金柑葉片蛋白質(zhì)的提取。

圖1 4種方法提取的金柑葉片蛋白質(zhì)的SDS-PAGE圖Fig.1 The SDS-PAGE maps of proteins in Fortunella Swingle leaves extracted by four methods

圖2 金柑葉片蛋自質(zhì)的2-DE圖譜Fig.2 The 2-DE maps of proteins in Fortunella Swingle leaves

方法編號Motheds No.Tris-HCl提取法Tris-HCl extraction methodDTT/丙酮提取法DTT/acetone extraction methodTCA/丙酮提取法TCA/acetone extraction method尿素提取法Urea extraction method金柑蛋白點(diǎn)數(shù)Protein number131314911208789

3 討 論

糖類、醌類等大量次生代謝物質(zhì)存在于金柑葉片內(nèi)，嚴(yán)重影響蛋白質(zhì)的獲取。4種提取方法中，尿素提取法剔除金柑葉片中的干擾物質(zhì)能力較強(qiáng)，但從蛋白質(zhì)點(diǎn)數(shù)量判斷，蛋白質(zhì)產(chǎn)率偏低，這可能是尿素提取液中的試劑成分和比例可以較大限度地去除蛋白質(zhì)中的雜質(zhì)，但除去雜質(zhì)的同時也連帶將與雜質(zhì)緊密絡(luò)合的部分蛋白質(zhì)除去，損失了大量的蛋白質(zhì)，因而提取的蛋白質(zhì)點(diǎn)數(shù)明顯少于其它3種方法；選用TCA/丙酮法提取蛋白質(zhì)時間消耗相對較長，該法通過降低蛋白降解酶活力進(jìn)而延緩了蛋白質(zhì)的降解過程，三氯乙酸大大減少了蛋白質(zhì)被小分子物質(zhì)干擾聚焦的過程，同時選取TCA和丙酮有機(jī)試劑又會將提取過程中與雜質(zhì)緊密結(jié)合的蛋白質(zhì)最大可能的保留，因此蛋白點(diǎn)數(shù)量較高；由DTT/丙酮提取法所得到的SDS-PAGE圖和2-DE圖背景底色深沉，可以推斷該法提取的蛋白質(zhì)存在大量雜質(zhì)離子的干擾，蛋白點(diǎn)呈現(xiàn)縱橫發(fā)散狀，盡管蛋白質(zhì)點(diǎn)數(shù)分布密集，可由于提取的蛋白質(zhì)含有較多雜質(zhì)，不是進(jìn)行下一步科學(xué)研究的理想選擇；金柑葉片組織中存在大量酚類、醌類大分子代謝物質(zhì)，嚴(yán)重影響了蛋白質(zhì)的提取質(zhì)量和產(chǎn)率。Tris-HCl提取法中的提取液可以較好地去除酚類、醌類等大分子量的雜質(zhì)，對于小分子鹽離子的去除能力也較好，遠(yuǎn)優(yōu)于其它3種方法，且成像的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)也極少有縱橫紋現(xiàn)象，說明該法適于進(jìn)行后續(xù)蛋白質(zhì)分析和研究[19-23]。

4 結(jié) 論

4種方法提取蛋白質(zhì)的效果各有不同。從蛋白質(zhì)產(chǎn)率角度看，DTT/丙酮提取法提取蛋白質(zhì)產(chǎn)率最高；從蛋白質(zhì)質(zhì)量角度看，尿素提取法提取的蛋白質(zhì)質(zhì)量最優(yōu)。綜合蛋白質(zhì)產(chǎn)率、蛋白點(diǎn)數(shù)和電泳監(jiān)測結(jié)果作為評判標(biāo)準(zhǔn)，Tris-HCl提取法兼顧產(chǎn)率和質(zhì)量，是適用于金柑葉片蛋白質(zhì)提取的最優(yōu)方法。