張 婷，蹇洪英，莫錫君，邱顯欽，楊 靜，唐開學，王其剛*

(1.云南省農(nóng)業(yè)科學院花卉研究所/云南省花卉育種重點實驗室/國家觀賞園藝工程技術(shù)研究中心，云南 昆明 650200；2.中國科學院昆明植物研究所，云南 昆明 650201)

【研究意義】長尖葉薔薇(RosalongicuspisBertol.)為薔薇科(Rosaceae)薔薇屬(RosaL.)合柱組(SectionSynstylaeCD.)攀援灌木，廣泛分布于西南三省，印度北部也有分布，植株高大、葉片光亮革質(zhì)[1]，具有較好的抗寒性[2-3]及對白粉病菌免疫[4]等優(yōu)良性狀。云南地區(qū)的長尖葉薔薇居群間存在中度遺傳分化，居群遺傳多樣性較高[5]，是現(xiàn)代月季遺傳育種的優(yōu)良種質(zhì)資源?！厩叭搜芯窟M展】核型分析是作物育種的基礎。Akasaka等[6-7]和張婷等[8]發(fā)現(xiàn)薔薇屬植物中存在異形同源染色體，而以往的常規(guī)核型分析中均未有報道[9-18]，因此，以前的常規(guī)核型分析可能對染色體有誤配。染色體熒光原位雜交(FISH)技術(shù)具有實驗周期短、靈敏度高、分辨率高、直觀可見等優(yōu)點，可通過rDNA在染色體上的定位，清楚地識別形態(tài)相近的染色體[19]。由于薔薇屬植物的染色體為小染色體[6-7]，平均長度僅有2.81 μm[20]，利用基于rDNA FISH對其進行核型分析更為準確可靠。【本研究切入點】利用45S和5S rDNA為探針，對長尖葉薔薇進行染色體熒光原位雜交研究，在對rDNA進行精確物理定位的同時獲得長尖葉薔薇更為準確的染色體核型數(shù)據(jù)?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究可為其在薔薇屬植物特別是現(xiàn)代月季的種質(zhì)創(chuàng)新和遺傳改良中提供分子細胞遺傳學背景資料。

1 材料與方法

1.1 材料

供試的長尖葉薔薇來自云南省彌勒市，以嫁接苗的方式保存于云南省農(nóng)業(yè)科學院花卉研究所月季種質(zhì)資源圃中。

1.2 方法

1.2.1 探針標記 5S rDNA以PCR方法獲得，上游引物：5’-GAGTAGTACTAGGATGGGTGACC-3’；下游引物:5’-CTCTCGCCCA ARCWCGCTTAACT -3’，由云南精賽頓生物科技有限公司合成，PCR擴增條件：94 ℃ 2 min，94 ℃ 20 S，55 ℃ 30 S，72 ℃ 40 S，35個循環(huán)，72 ℃ 7 min。45S rDNA和5S rDNA按張婷等[8]的方法標記。

1.2.2 染色體制片、原位雜交、圖像檢測及分析 染色體片子參考田敏等[21]的方法進行。原位雜交方法：a.雜交前的準備：選取染色體分散良好的制片；加100 μl 10～50 μg/mL的胃蛋白酶溶液于制片上，蓋上封口膜，37 ℃孵育20～60 min；用ddH2O沖洗干凈，用2×SSC洗2次每次5 min；將玻片于60 ℃烘箱中干燥2～3 h，放置至室溫。配置雜交液30 μl [100 %去離子甲酰氨(Formamide)20 μl，50 %硫酸葡聚糖(DS)5 μl，20×SSC 2 μl，10 % SDS 1 μl，2種探針各1 μl]。混勻后于97 ℃變性10 min，迅速轉(zhuǎn)入冰中0 ℃以下至雜交(10 min以上)。b.染色體變性：每個玻片加70 %去離子甲酰氨100 μl，蓋上封口膜后于75 ℃變性3 min；70 %、95 %、100 %乙醇于-20 ℃下脫水，每級5 min；迅速甩干后進行雜交。c.雜交：將雜交液滴于玻片上，加封口膜蓋片，轉(zhuǎn)入50 ℃水浴中孵育15～20 h。d.洗脫和信號檢測：雜交制片用2×SSC漂去蓋片；0.1 %SDS(2×SSC)37 ℃3次，每級5 min；0.1 %SDS(0.2×SSC)37 ℃ 3次，每級5 min；2×SSC室溫下沖洗2次，甩干制片；加50 μl/片現(xiàn)配的5 %BSA，蓋上封口膜，37 ℃封阻30 min。以下步驟避光：甩干封阻液，加60 μl抗體混合液 [Avidin-FITC(10 mg/mL)、Anti-digoxigenin-rhodamine(10 mg/mL)各30 μl]，蓋上封口膜，37 ℃孵育1 h；1×PBS漂去蓋片，1×PBS/Teween20中，37 ℃ 3次，每級5 min；加含有100 mg/mL DAPI的抗熒光衰減劑，蓋上干凈的蓋玻片。e.雜交圖像在Zeiss熒光顯微鏡(Axiophot 2)下觀察并獲取，用Zeiss及Photoshop軟件對圖像分析、處理。選取分散良好、形態(tài)清晰、雜交信號清晰的5個體細胞中期染色體進行核型分析，核型分析按照李懋學和陳瑞陽[22]的標準，核型類型根據(jù)Stebbin[23]的分類標準劃分，核型數(shù)據(jù)用Excel分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 長尖葉薔薇rDNA FISH核型分析

長尖葉薔薇基于rDNA FISH的核型公式為2n=2x=14=10m+4sm，核型為2A型，染色體組由中長染色體(M1)和中短染色體(M2)組成(表1)。除4號和5號染色體為亞中部著絲點染色體(sm)外，其余均為中部著絲點染色體(m)，其中5號染色體是1對相對長度差異很大的異形同源染色體，二者的相對長度相差(2.03±0.14)%，其中較長染色體為中長染色體(M2)，相對長度為(7.96±0.33)%，臂比值為2.22±0.12，較短染色體為中短染色體(M1)，相對長度為(5.93±0.20)%，臂比值為1.85±0.10；4號的2條染色體的相對長度也有較大差異，它們的相對長度相差(0.64±0.01)%，2條染色體都為中短染色體(M1)，其中較長染色體的相對長度為(7.11±0.14)%，臂比值為1.81±0.10，較短染色體的相對長度為(6.47±0.13)%，臂比值為1.90±0.11(表2)。

表1 長尖葉薔薇體細胞中期染色體基于rDNA FISH的核型參數(shù)及rDNA位置

表2長尖葉薔薇4號、5號染色體基于rDNAFISH的核型參數(shù)及rDNA信號強弱

Table 2 Karyotype parameters of the 4th and 5th pair of chromosomes ofR.longicuspisbased on FISH with 45S and 5S rDNA as probes and the strength of rDNA signals

染色體名稱Chromosome name45S rDNA信號強度 45S rDNA signal strength5S rDNA信號強度 5S rDNA signal strength相對長度(%)Relative length臂比值Arm ratio著絲點類型Centromere type染色體相對長度組成 Constitution of relative length兩條同源染色體相對長度差值The relative length difference between the heteromorphic homologous chromosomes4號較長同源染色體2+7.11±0.141.81±0.10smM10.64±0.014號較短同源染色體10+6.47±0.131.90±0.11smM15號較長同源染色體3+2+7.96±0.332.22±0.12smM22.03±0.145號較短同源染色體2++5.93±0.201.85±0.10smM1

2.2 45S rDNA和5S rDNA在長尖葉薔薇染色體中的精確定位

45S和5S rDNA在長尖葉薔薇上分別檢出1對和2對位點(圖1)。45S rDNA有1對雜交位點，位于5號染色體整條短臂上(5S)，信號明顯且2個信號強弱差異不大。5S rDNA有4個雜交位點，其中一對位點位于4號染色體長臂(4L)的近著絲粒處，2個位點的信號強度差異很大，位于較短染色體上的信號極強、另一個很弱；另一對位點位于5號染色體長臂(5L)上部，信號明顯，2個位點的雜交信號均較弱，差異不大。

2.3 合柱組4個野生種的rDNA FISH差異

已有的研究表明，薔薇屬二倍體野生種中5S rDNA位點按是否與45S rDNA有共線性分為2種：只有1對位點的5S rDNA與45S rDNA沒有共線性，即：與45S rDNA不在同1對染色體上；有1對以上5S rDNA位點的，其中1對與45S rDNA位于同一染色體上，其余位點位于其它染色體上[6-8,11]，長尖葉薔薇屬于后者。已有的研究顯示，與長尖葉薔薇同屬于合柱組(SectionSynstylae)的野薔薇(R.multifloraThunb.，2n=2x=14)、光葉薔薇(R.wichurianaCrép.，2n=2x=14)及川滇薔薇(R.soulieanaCrép.，2n=2x=14)的45S rDNA位點數(shù)均與長尖葉薔薇相同，為1對(2個)，5S rDNA除野薔薇為3個外，其余為2對(4個)，分布模式為后者(表3)[6,8]。

a, a’：45S rDNA(綠)和5S rDNA(紅)與DAPI 復染的染色體(藍)的合成圖；b：長尖葉薔薇有絲分裂中期染色體；c：45S rDNA 雜交信號(綠)；d：5S rDNA 雜交信號(紅)a, a’: A merged image of the metaphase chromosomes and the FISH signals. 45S rDNA (green), 5S rDNA (red), DAPI (blue); b: Metaphase chromosomes; c: FISH signals of 45S rDNA (green); d: FISH signals of 5S rDNA (red)圖1 長尖葉薔薇中期染色體rDNA FISH及核型Fig.1 FISH localization of 45S rDNA and 5S rDNA on metaphase chromosomes of R. longicuspis and homologous pairing of chromosomes

45S rDNA位點總數(shù)/位置45S rDNA loci number/site5S rDNA位點總數(shù)/位置(個數(shù))5S rDNA loci number/site45S rDNA 強弱差異45S rDNA signal intensity5S rDNA 強弱差異5S rDNA signal intensity野薔薇 (R. multiflora)[6]2/7S3/3L (1), 7S (2)--光葉薔薇 (R. wichurana)[6]2/7S4/5 L (2), 7S (2)--川滇薔薇 (R. soulieana)[8]2/7S4/4L (2), 7L (2)2個信號略有差異4個信號較強,略有差異長尖葉薔薇 (R. longicuspis)2/5S4/4L (2), 5L (2)2個信號略有差異位于4L的信號極強,其他3個信號較弱。

光葉薔薇與45S rDNA有共線性的5S rDNA位于此對染色體的短臂上[6]，川滇薔薇[8]及長尖葉薔薇的這對5S rDNA則位于此對染色體的長臂上。川滇薔薇與45S rDNA無共線性的1對5S rDNA位于4號染色體，這對5S rDNA的信號強度雖有差異但不顯著；長尖葉薔薇的這對5S rDNA位于5號染色體，二者的信號強度差異極其顯著。由rDNA的分布和雜交位點的特征可將這4種親緣關(guān)系很近的物種在染色體水平上區(qū)分開(表3)。這4個種的5S rDNA有類似的分布模式，但又有各自不同于其它種的特征，可見rDNA FISH是進行細胞分子遺傳學研究的有力工具。

3 討 論

Jian等經(jīng)常規(guī)核型分析獲得的長尖葉薔薇的核型與本研究的結(jié)果不同：核型公式為2n=2x=14=12m+2sm，染色體組成中多了長染色體(L)，其中，僅第4對為亞中部著絲粒染色體(sm)，屬于中短染色體(M1)，臂比值為2.77，此對染色體的相對長度之和為13.65，平均每條染色體為6.825，其余均為中部著絲粒染色體(m)[9-10]。經(jīng)rDNA FISH核型分析的第4對和第5對染色體的兩條相對較長染色體的相對長度較接近，另外兩條較短染色體的相對長度也較接近，經(jīng)常規(guī)核型分析時易被各配為1對，Jian等分析的第4對sm染色體很可能是由前者組成；另外，少了一對sm染色體可能跟材料預處理等有關(guān)。

已有的研究表明，薔薇屬植物的45S rDNA幾乎都定位在1對異形同源sm染色體的短臂上[6-8,11]，5S rDNA所定位的染色體表現(xiàn)了更豐富的多樣性，在種類和種間均有差異，有的是異形同源sm染色體，有的不是異形同源染色體，這在以往的常規(guī)核型分析研究中未見報道[9-18]。由于異形同源染色體存在顯著的長度差異，常規(guī)核型分析時不會將它們配為一對。因此，基于rDNA FISH的核型分析結(jié)果更準確，對薔薇屬植物的遺傳育種更具指導意義。

4 結(jié) 論

通過熒光原位雜交技術(shù)對長尖葉薔薇的45S rDNA與5S rDNA在體細胞中期染色體上進行FISH定位，可準確識別其染色體組中的同源染色體，并由rDNA位點體現(xiàn)它在染色體水平上的特征，為染色體識別提供明確的標記，也為長尖葉薔薇用于現(xiàn)代月季的遺傳改良提供初步的分子細胞遺傳學依據(jù)。