宋艷艷，謝士昌，高小寧，馮 浩，黃麗麗，韓青梅

(西北農林科技大學 植物保護學院，旱區(qū)作物逆境生物學國家重點實驗室，陜西楊凌 712100)

蘋果褐斑病是由子囊菌門蘋果殼二孢Diplocarponmali，(無性態(tài)為Marssoninacoronariae)引起的蘋果早期落葉病害之一，在世界上各蘋果主產區(qū)都有分布[1]，常引起生長季節(jié)果樹葉片黃化和大量脫落，導致樹體衰弱，影響蘋果的產量和品質，造成嚴重的經濟損失。蘋果褐斑病在中國最早發(fā)生于湖北省[2]，該病害在中國蘋果產區(qū)屬于連年流行病害，并有逐漸加重的趨勢[3]。目前生產上對該病害的防治以噴施化學藥劑為主，但是使用化學藥劑存在生產成本高、農藥殘留和病菌抗藥性等問題[4]，因此選育抗病品種，挖掘抗病種質資源對于蘋果褐斑病的可持續(xù)控制具有重要意義。

近年來分子技術成為遺傳多樣性檢測的有效手段，簡單序列間重復(ISSR)是由Zietkiewicz等[5]提出的一種多態(tài)性分子標記，該技術使用16～25 bp的微衛(wèi)星引物，利用多種基因組位點的單引物PCR反應擴增不同大小的ISSR序列[6]。ISSR是一種顯性遺傳標記，可以生成大量信息和可復制的等位基因，具有成本低、使用方便、操作簡單、重復性好等特點[7]，該技術不需要特殊的DNA序列，并且能夠克服RAPD和AFLP等技術的限制[8-9]，同時微衛(wèi)星中的進化速率比大多數其他類型的DNA高，所以這些序列的多態(tài)性可能更大[6]。目前，ISSR分子標記的應用領域已經從植物擴展到真菌方面[10-12]，在對植物病原真菌的研究中，該技術常被用來研究病原真菌的群體遺傳和生理小種鑒定、病原菌致病性、遺傳多樣性等。

本研究利用ISSR分子標記技術，通過ISSR-PCR擴增，對分離自陜西省關中地區(qū)7個縣(區(qū))蘋果褐斑病菌的遺傳多樣性和群體遺傳結構進行分析，以期了解不同地區(qū)蘋果褐斑病菌的群體遺傳多樣性及其與地理來源之間的關系，為病害的防治和抗病育種工作提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

蘋果褐斑病菌(D.mali)由西北農林科技大學植物保護學院果樹病害病原生物學及綜合防治研究室提供，分離自陜西關中7個(縣)區(qū)，共64株，樣品采集地點：關中東部，白水縣10株；關中中部，乾縣4株、楊凌區(qū)15株；關中西部，陳倉區(qū)6株、扶風縣15株、鳳翔縣7株、眉縣7株。

1.2 菌株活化

將保存于-80 ℃的蘋果褐斑病菌轉移至馬鈴薯胡蘿卜葡萄糖瓊脂(PCDA)培養(yǎng)基上[13]，在25 ℃培養(yǎng)箱黑暗培養(yǎng)3周，將活化的菌體再轉接擴繁，相同條件下培養(yǎng)7 d，用接種針刮取培養(yǎng)基上的菌體，液氮速凍后置于-80 ℃冰箱，備用。

1.3 模板DNA制備

將在-80 ℃下保存的蘋果褐斑病菌體在液氮中充分研磨，使用Biospin真菌基因組DNA提取試劑盒(杭州博日科技有限公司)提取DNA，用10 g/L的瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性，并用核酸蛋白檢測儀檢測品質和濃度。當DNA無降解，OD260/280和OD260/230的值均為1.8～2.0時，說明DNA符合使用要求，4 ℃保存，備用。

1.4 ISSR-PCR反應體系優(yōu)化

1.4.1 ISSR-PCR反應體系 供試ISSR引物由西安擎科澤西生物科技有限公司合成。ISSR-PCR反應體系和擴增程序如下：

反應體系：2×TaqMaster Mix 5 μL，ISSR引物(10 μmol/L)0.5 μL，模板DNA(200 ng/μL)0.6 μL，ddH2O補至10 μL。

擴增程序：94 ℃預變性4 min；隨后94 ℃變性30 s，退火30 s，72 ℃延伸1 min，34個循環(huán)；72 ℃ 再延伸10 min；最后于16 ℃保存。

PCR反應結束后，吸取7 μL擴增產物，使用15 g/L瓊脂糖凝膠電泳，在120 V電壓下電泳30 min，電泳完成后使用凝膠成像系統(tǒng)觀察照相。

1.4.2 ISSR引物及引物退火溫度篩選 根據每一條引物的Tm值，設置退火溫度梯度，溫度范圍為43～50 ℃和50～58 ℃，使用上述反應體系進行擴增。篩選條帶清晰、無彌散、多態(tài)性穩(wěn)定的引物，隨后將篩選出的引物再進行擴增確定最佳退火溫度，最后將篩選出的引物以64個菌株的基因組DNA為模板，進行ISSR-PCR擴增，每條引物重復擴增3次。

1.5 ISSR-PCR擴增數據的統(tǒng)計與分析

由于ISSR標記是顯性遺傳標記，每個條帶都可以作為一個等位基因位點[14]，依次對每一條引物擴增的帶型進行統(tǒng)計，選擇清晰、穩(wěn)定的條帶，模糊不清的條帶忽略不計。首先確定條帶的大小，根據同一大小處條帶的有無，分別記為“1”和“0”，構建0-1矩陣表。

利用Popgene 1.32 軟件計算以下參數：(1)反映基因多少和狀況的遺傳參數：多態(tài)性條帶數(Number of polymorphic loci，NP)、多態(tài)條帶百分率(Percentage of polymorphic loci，P)、等位基因觀測數(Observed number of alleles，Na)、有效等位基因數(Effective number of alleles，Ne)；(2)反映基因多樣性信息的遺傳參數：Nei’s基因多樣性指數(Gene diversity，H)、Shannon信息指數(Shannon’s information index，I)；(3)反應遺傳分化程度的參數：種群遺傳分化系數(Coefficient of genetic differentiation among population within species，Gst)，Gst=Dst/Ht，其中Dst=Ht-Hs，Ht為總遺傳多樣性，Hs為群體內的遺傳多樣性，Dst為群體間遺傳多樣性。根據Wright的Fst算法[15]，得到反映基因流強度的居群每代遷移數(Number of migrants per generation，Nm)其關系為：Fst=1/(1 + 4Nm)，Nm(W)=(1 -Fst)/4Fst，在此，Fst可認為等同于Gst。當Nm>1(N為有效居群大小，m為基因流比率)時，證明種群間存在一定的基因流動，能發(fā)揮勻質化作用；當Nm<1時，則表示基因流傳受到部分阻礙，亞群體間隨即蘊藏遺傳分化的潛能；如果Nm>4，它們就是一個隨機單位。利用Popgene 1.32軟件計算不同類群的遺傳距離和遺傳一致度，并用NTsys-2.0軟件使用非加權算術平均聚類(UPGMA)方法進行群體聚類分析。

2 結果與分析

2.1 ISSR-PCR擴增篩選引物及引物退火溫度

經過多次的ISSR-PCR擴增反應，結果表明，引物的退火溫度是影響ISSR-PCR特異性的重要因素之一，通過設置退火溫度梯度，選擇多態(tài)性條帶穩(wěn)定且清晰的引物進行重復擴增，確定最適退火溫度。圖1為引物BIS07和BIS15在不同溫度下的擴增結果，二者的最佳退火溫度確定為50.0 ℃，其他引物的退火溫度如表1所示。最終從40條ISSR引物中篩選出11條擴增效果好的引物，引物序列見表1，部分引物擴增電泳圖如圖2(引物P 5)和圖3(引物BIS15)所示，條帶清晰無雜帶，并且具有多態(tài)性。

2.2 ISSR-PCR擴增檢測蘋果褐斑病菌遺傳多樣性

對篩選出的11條引物進行ISSR-PCR擴增，結果顯示，二核苷酸重復的引物多態(tài)性較高，平均值為92.3%，同時二核苷酸重復引物有9條，占到總引物的81.8%，三核苷酸重復的引物僅有2條，且引物的多態(tài)性百分率低，分別為33.3%(824)和50.0%(P5)，說明在蘋果褐斑病菌的基因組中富含較多的二核苷酸串聯(lián)重復序列；從引物序列中可知，當引物的重復序列為(AG)、(GA)、(CT)、(TC)、(AC)時，引物表現出更高的多態(tài)性。從11條ISSR引物共擴增得到82個位點，其中多態(tài)性位點71個，引物擴增得到的總位點數為4～12個，多態(tài)性位點數為2～11個，平均每條引物擴增7.5個位點，6.5個多態(tài)性位點，多態(tài)性位點的百分率為33.3%～100.0%，平均多態(tài)性位點率為86.6%，說明蘋果褐斑病菌具有遺傳多樣性。

泳道1～8的溫度依次為：50.0 ℃、50.8 ℃、51.8 ℃、53.2 ℃、55.0 ℃、56.5 ℃、57.4 ℃、58.0 ℃ Annealing temperature of lane 1 to 8 is 50.0 ℃,50.8 ℃,51.8 ℃,53.2 ℃,55.0 ℃, 56.5 ℃,57.4 ℃,58.0 ℃,respectively；左圖為引物BIS07的溫度梯度，右圖為引物BIS15的溫度梯度 The left plate shows the temperature gradient for the primer BIS07,and the right for BIS15；DNA模板為Hbj-0435 The DNA template is Hbj-0435；M.DS2000

表1 供試ISSR引物擴增特征Table 1 The amplification characteristics of selected ISSR primers

2.3 不同縣(區(qū))蘋果褐斑病菌群體遺傳多樣性分析

陜西省關中平原不同縣(區(qū))蘋果褐斑病菌群體遺傳多樣性參數如表2所示，結果表明，蘋果褐斑病菌具有較豐富的遺傳多樣性。在物種水平上，病菌的等位基因觀測數(Na)為1.87，有效等位基因數(Ne)為1.48，Nei’s基因多樣性指數(H)為0.29，Shannon 信息指數(I)為0.44，多態(tài)性位點數(NP)為71個，多態(tài)性位點率(P)為86.59%。在群體水平上，病菌的等位基因觀測數為1.50～1.77，平均為1.67；有效等位基因數為1.30～1.45，平均為1.41；Nei’s基因多樣性指數為0.20～0.26，平均為0.24；Shannon 信息指數為0.20～0.40，平均為0.35；多態(tài)性位點數為 41～62個，平均為55個；多態(tài)性位點率為50.00%～76.83%，平均為66.72%。其中渭南市白水縣(Na=1.76，Ne=1.45，H=0.26，I=0.40)種群的遺傳多樣性水平最高，咸陽市乾縣(Na= 1.50，Ne=1.36，H=0.20，I=0.29)種群的遺傳多樣性水平相對較低。

1～17.Hbj-0364,Hbj-0369,Hbj-0371,Hbj-0375,Hbj-0347,Hbj-0336,Hbj-0341,Hbj-0343,Hbj-0311,Hbj-0439,Hbj-0416,Hbj-0400,Hbj-0414,Hph-0027,Hph-0070,Hph-0101,Hph-0105; M. DS2000;下同 The same below

圖3 引物BIS15對17株蘋果褐斑病菌株的ISSR-PCR擴增電泳圖Fig.3 The ISSR-PCR amplification of 17 isolates of D.mali with primer BIS15

表2 不同縣(區(qū))蘋果褐斑病菌遺傳多樣性分析Table 2 Genetic diversity analysis of D.mali of different counties

2.4 關中地區(qū)蘋果褐斑病菌群體遺傳多樣性和遺傳分化分析

陜西省關中地區(qū)蘋果褐斑病菌群體遺傳多樣性的參數如表3所示，結果顯示，關中西部地區(qū)群體的等位基因觀測數為1.84，有效等位基因數為1.47，Nei’s基因多樣性指數為0.28，Shannon 信息指數為0.43，高于中部地區(qū)和東部地區(qū)，說明關中西部地區(qū)的群體遺傳多樣性高于關中中部和東部。

陜西省關中地區(qū)蘋果褐斑病菌群體遺傳分化程度的參數如表4所示，結果顯示，關中平原不同地區(qū)的遺傳分化程度不同。其中東部、西部、中部地區(qū)遺傳分化系數(Gst)分別為0.17、0.14、0.13，東部的遺傳分化系數高于中部和西部。在群體水平上，遺傳分化系數為0.03，即群體內的遺傳多樣性占總群體遺傳多樣性的97%，群體間的遺傳多樣性占總群體多樣性的3%，說明遺傳分化主要發(fā)生在群體內。關中中部的基因流(Nm=1.62)高于西部(Nm=1.51)和東部(Nm=1.24)，表明不同地區(qū)的種群間存在不同程度的基因交流，其中中部地區(qū)種群間的基因交流更廣泛。由表中數據可以看出，不同區(qū)域之間的群體基因交流也存在差異，其中關中東部和西部地區(qū)之間的基因流最大(Nm=7.79)，其次為關中東部和中部之間(Nm=3.97)，關東中部和西部之間的基因交流相對較少(Nm=3.85)，說明關中東部和西部地區(qū)之間存在更頻繁的基因交流。

表3 陜西關中地區(qū)蘋果褐斑病菌群體遺傳多樣性分析Table 3 Genetic diversity analysis of D.mali populations in Guanzhong Shaanxi

表4 陜西關中地區(qū)蘋果褐斑病菌群體遺傳結構和遺傳分化分析Table 4 Genetic structure and genetic differentiation analysis of D.mali populations in Guanzhong Shaanxi

2.5 不同縣(區(qū))蘋果褐斑病菌種群的聚類分析

遺傳距離和遺傳一致度是衡量群體之間的遺傳分化程度的重要指標之一，通過分析蘋果褐斑病菌群體的遺傳距離和遺傳一致度，結果(表5)顯示，不同縣(區(qū))群體之間的遺傳距離范圍為0.036 1～0.144 9；其中白水縣和眉縣的遺傳距離最近，為0.036 1，同時兩者之間的遺傳一致度最高；楊凌區(qū)和陳倉區(qū)之間的遺傳距離最遠，為0.144 9，遺傳一致度最低。根據群體的遺傳一致度，使用NTsys-2.0軟件進行不同地區(qū)蘋果褐斑病菌群體聚類分析，結果(圖4)顯示，在遺傳相似系數為0.92時，7個縣(區(qū))的病菌被分為3個類群，類群1包括陳倉區(qū)；類群2包括鳳翔縣、乾縣、白水縣、眉縣、扶風縣，為優(yōu)勢類群；類群3包括楊凌區(qū)。以上結果表明，不同地理種群之間的遺傳距離存在差異，種群之間的遺傳親緣關系與分離株的地理來源之間沒有明顯的相關性。

表5 不同縣(區(qū))蘋果褐斑病菌株的遺傳距離Table 5 Nei’s genetic distance of D.mali in different counties

圖4 陜西關中地區(qū)蘋果褐斑病菌不同自然種群的 UPGMA 聚類圖Fig.4 The UPGMA dendrogram of D.mali populations in Guanzhong Shaanxi

3 討 論

ISSR標記被廣泛應用是由于其重復性良好，且比RAPD更穩(wěn)定，通過檢測多個遺傳位點之間的差異，表現出更高的多態(tài)性，是一種高效、可靠的分子標記技術。研究表明，通常在3′或5′端錨定的二核苷酸重復的ISSR引物具有高度的多態(tài)性[16-18]。本研究的ISSR引物篩選結果也表明，二核苷酸重復的引物多態(tài)性較高，平均值為92.3%。通常來說，相比較于其他的三核苷酸和四核苷酸序列，ISSR引物的重復序列為(AG)、(GA)、(CT)、(TC)、(AC)、(CA)時，引物表現出更高的多態(tài)性[6]，這與本研究篩選到的多態(tài)性引物序列特征相符合。由此可見，本研究使用ISSR分子標記技術分析病原菌的遺傳多樣性是可靠的。

種群遺傳多樣性分析結果表明，渭南市白水縣群體遺傳多樣性水平最高。李旻等[19]利用ISSR標記研究球孢白僵菌遺傳多樣性，認為其遺傳多態(tài)性差異與地理環(huán)境以及氣候有關。蘋果褐斑病在陜西省各蘋果產區(qū)均有發(fā)生，但是各地的發(fā)病程度卻不相同，相比較于其他6個縣(區(qū))，白水縣晝夜溫差大，夜間在葉片上易形成潮濕的環(huán)境，利于病害發(fā)生，因此該地區(qū)褐斑病發(fā)生嚴重[20]。據此推測各地種群遺傳多樣性差異與病害發(fā)生的嚴重程度有關。

遺傳分化系數是衡量群體間和群體內相對遺傳變異大小的重要指標，能夠很好的解釋群體遺傳變異。種群之間的基因分化水平與很多因素有關，如長期進化歷史和物種的性質、基因流動、種群隔離等[21]。本研究中從群體水平分析發(fā)現，蘋果褐斑病菌種群間的遺傳分化程度較低，病菌的遺傳分化主要發(fā)生在群體內；同時群體之間存在基因流動，存在均質化作用，不易出現遺傳分化，不同地區(qū)之間也存在菌源流動?；蛄鞯拇嬖谀軌蛴绊懭后w的遺傳結構，基因流傳播越順暢則遺傳分化程度越低[22]。王建鋒等[23]利用TP-M13-SSR 自動熒光檢測技術，分析陜西省小麥條銹菌群體遺傳結構，認為基因流是陜西省小麥條繡菌群體遺傳分化程度低的影響因素之一。因此推測導致蘋果褐斑病菌群體間遺傳分化程度低的原因是群體間基因流動頻繁。

本研究中對于蘋果褐斑病菌種群遺傳變異的分析，將有助于研究遺傳變異與其他表型性狀如致病性的相關性。另一方面，種群的遺傳多樣性與物種的進化發(fā)展相關聯(lián)[21]，可進一步為抗病育種工作提供理論依據。但是由于本研究的供試菌株分離樣品僅局限于陜西省關中地區(qū)，因此對于更多地區(qū)病原菌之間的遺傳多樣性，尚待深入研究論證。