李全勝，張國麗，呂 寧，陳 云，武冬梅，謝宗銘

(1.新疆農(nóng)墾科學(xué)院 生物技術(shù)研究所，作物種質(zhì)創(chuàng)新與基因資源利用兵團(tuán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,新疆石河子 832000；2.新疆農(nóng)墾科學(xué)院，新疆石河子 832000；3.新疆農(nóng)墾科學(xué)院 農(nóng)田水利與土壤肥料研究所，新疆石河子 832000)

大麗輪枝菌(VerticilliumdahliaeKleb.)寄主范圍廣泛，可侵染600多種植物，其侵染棉花引發(fā)的棉花黃萎病是一種世界范圍的毀滅性土傳病害，給棉花生產(chǎn)造成了巨大的損失[1-3]。在新疆棉花主產(chǎn)區(qū)，長期連作和秸稈還田現(xiàn)象普遍，導(dǎo)致土壤中黃萎病菌菌源量逐年增加，病害發(fā)生也呈現(xiàn)逐年擴(kuò)大和加重趨勢(shì)，嚴(yán)重阻礙了新疆棉花產(chǎn)業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展[4-6]。隨著公眾環(huán)保意識(shí)和健康意識(shí)的增強(qiáng)，采用生物菌劑替代化學(xué)農(nóng)藥進(jìn)行作物土傳病害的防治，成為近年來國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。芽孢桿菌是目前生防菌劑中應(yīng)用最為廣泛的菌種之一，其適應(yīng)環(huán)境能力強(qiáng)，可產(chǎn)生耐逆芽孢，分泌多種拮抗物質(zhì)，對(duì)多種病原菌具有抑制作用，具有較高的開發(fā)應(yīng)用價(jià)值[7-10]。

發(fā)酵工藝是將生防芽孢桿菌推向工業(yè)化生產(chǎn)的關(guān)鍵步驟，通過優(yōu)化能夠充分發(fā)掘菌種的潛在能力，提高生產(chǎn)效率，降低生產(chǎn)成本。Mizumoto等[11]通過對(duì)枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)RB14-CS培養(yǎng)基優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)葡萄糖和豆餅粉是影響其產(chǎn)伊枯草菌素A的主要因子。張冬冬等[12]采用Plackett-Burman試驗(yàn)確定了巨大芽孢桿菌(Bacillusmalacitensis)Z-5生產(chǎn)芽孢最適碳源、氮源和無機(jī)鹽分別為玉米粉、MnSO4·H2O和豆餅粉，優(yōu)化后芽孢產(chǎn)量達(dá)到1.97×109mL-1；張文芝等[13]采用正交試驗(yàn)法對(duì)蠟質(zhì)芽孢桿菌(Bacilluscereus)AR156發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，得出麥芽糖和黃豆粉能顯著提高芽孢產(chǎn)量，芽孢生成率在97%以上。張麗霞等[14]采用響應(yīng)面分析法通過對(duì)枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)B908的培養(yǎng)基優(yōu)化，確定了玉米粉、碳酸鈣和豆餅粉是影響發(fā)酵液中菌體數(shù)量的主要因子。微生物的發(fā)酵過程十分復(fù)雜，以上研究均表明，發(fā)酵培養(yǎng)基中的碳源、氮源和無機(jī)鹽的組成及其濃度配比均對(duì)芽孢的形成、抑菌物質(zhì)合成以及生產(chǎn)成本控制有重要影響，是菌劑商品化生產(chǎn)應(yīng)用的基礎(chǔ)[15-17]。

枯草芽孢桿菌S12是微生物資源發(fā)掘及利用團(tuán)隊(duì)分離自新疆棉田根際土壤的一株廣譜抑菌菌株，尤其對(duì)棉花黃萎病病菌的孢子萌發(fā)和菌絲生長具有較強(qiáng)的抑制作用[18]，具備生防菌劑產(chǎn)業(yè)化開發(fā)的潛力。芽孢含量是影響生防菌劑貯藏運(yùn)輸和應(yīng)用效果的關(guān)鍵因素[19-21]，因而產(chǎn)芽孢發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化對(duì)菌株工業(yè)化和商品化生產(chǎn)有著重要意義。為了使芽孢產(chǎn)量達(dá)到最大化，本研究采用Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)、最陡爬坡試驗(yàn)和BoxBehnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)芽孢桿菌S12產(chǎn)芽孢發(fā)酵培養(yǎng)基組分及其配比進(jìn)行優(yōu)化，以期為該菌株的工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)和開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試菌株 生防菌株S12由本實(shí)驗(yàn)室(作物種質(zhì)創(chuàng)新與基因資源利用兵團(tuán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室)從新疆石河子市棉田根際土壤中分離，通過對(duì)該菌株的形態(tài)特征觀察、生理生化鑒定和16S rDNA的序列分析，確定菌株S12為枯草芽孢桿菌，保存于本實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 供試培養(yǎng)基 NA(nutrient agar)培養(yǎng)基：每1 000 mL 蒸餾水中含蛋白胨10 g、牛肉浸膏3 g、NaCl 5 g、瓊脂15 g、pH 7.0～7.2，用于細(xì)菌菌株的活化。NB(nutrient broth)培養(yǎng)基：每1 000 mL蒸餾水中含蛋白胨10 g，牛肉浸膏3 g，NaCl 5 g，pH 7.0～7.2，用于細(xì)菌生長曲線的測(cè)定。初始培養(yǎng)基：每1 000 mL蒸餾水中含葡萄糖 20 g、蛋白胨 10 g、Na2HPO4·2H2O 4 g、NaH2PO4·2H2O 2 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、CaCl2·2H2O 0.2 g、pH 7.0～7.2，用于發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化。上述培養(yǎng)基滅菌條件均為1×105Pa滅菌20 min。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 種子液制備 將保存的菌株S12接種于NA培養(yǎng)基上，30 ℃恒溫培養(yǎng)24 h進(jìn)行活化。取100 mL三角瓶分裝NB培養(yǎng)基40 mL，接種NA培養(yǎng)基上活化的菌株S12后，于搖床30 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)14 h作為種子液。

1.2.2 生長曲線測(cè)定 將菌株S12種子液以1%的接種量，接入40 mL NB培養(yǎng)基中(100 mL 三角瓶)，200 r/min、30 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)，每隔2 h 取發(fā)酵液測(cè)吸光值(OD600)，繪制生長曲線。

1.2.3 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì) 選取6種碳源(葡萄糖、淀粉、麥芽糖、甘露醇、蔗糖、玉米粉)、6種氮源(酵母粉、豆餅粉、牛肉膏、大豆蛋白胨、胰蛋白胨、硫酸銨)及6種無機(jī)鹽(MgSO4·7H2O、CaCl2、CaCO3、ZnCl2、K2HPO4、MnSO4·H2O)，在初始培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，分別以單因素變化以上的碳源、氮源或無機(jī)鹽的種類及濃度，配制各種發(fā)酵培養(yǎng)基。將培養(yǎng)14 h的種子液接入配制的發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量為1%，100 mL的三角瓶裝液量為40 mL，200 r/min、30 ℃振蕩培養(yǎng)60 h。以發(fā)酵液菌株S12的芽孢產(chǎn)量為指標(biāo)，依次確定合適的碳源、氮源和無機(jī)鹽，每次確定后的結(jié)果進(jìn)入隨后的優(yōu)化條件試驗(yàn)。

1.2.4 芽孢產(chǎn)量檢測(cè) 采用系列稀釋平板菌落計(jì)數(shù)，菌株S12培養(yǎng)后的發(fā)酵液經(jīng)過80 ℃水浴15 min后，梯度稀釋到10-6～10-7，取0.1 mL發(fā)酵稀釋液均勻涂布到NA平板上，每處理重復(fù)3次，24 h后記錄菌落數(shù)。

1.2.5 培養(yǎng)基配方優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在初始培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，采用Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)單因素試驗(yàn)確定的9種營養(yǎng)成分進(jìn)行全面考察，并確定對(duì)菌株S12芽孢產(chǎn)量影響較大的因子，然后對(duì)這些因子進(jìn)行最陡爬坡路徑試驗(yàn)，采用適當(dāng)?shù)奶荻雀淖冚^大影響因子在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度，考察菌株S12芽孢產(chǎn)量變化趨勢(shì)，確定最適濃度范圍，最后利用響應(yīng)面分析法(Response surface methodology)中的Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，根據(jù)相應(yīng)的試驗(yàn)表進(jìn)行試驗(yàn)后，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次回歸擬合得到二階響應(yīng)面模型，預(yù)測(cè)發(fā)酵液中菌株S12芽孢產(chǎn)量最大值所對(duì)應(yīng)的關(guān)鍵因子的最優(yōu)組合，并進(jìn)行驗(yàn)證。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)分析 采用Design-Expert v8.0.6.1軟件進(jìn)行Plackett-Burman試驗(yàn)和Box-Behnken響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)，運(yùn)用該軟件的數(shù)據(jù)分析功能進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，得到擬合方程，進(jìn)行試驗(yàn)方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株S12生長曲線

菌株S12的生長曲線顯示(圖1)，0～4 h為生長延滯期，4～16 h為對(duì)數(shù)生長期，16 h后進(jìn)入穩(wěn)定期，因此，通過該結(jié)果可以確定種齡14 h的培養(yǎng)液可作為種子液，此時(shí)菌體生長速率最快，又達(dá)到較高的菌體濃度，且細(xì)胞大小比較一致，生長活力強(qiáng)。

2.2 碳源對(duì)芽孢產(chǎn)量的影響

以蛋白胨1.0%、Na2HPO40.4%、NaH2PO40.2%、MgSO4·7H2O 0.05%、CaCl20.02%為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別加入1.0%、2.0%的6種不同碳源，進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)，比較不同碳源種類和濃度對(duì)菌株S12發(fā)酵液中芽孢產(chǎn)量的影響。圖2表明，以2.0%玉米粉為碳源時(shí)，芽孢產(chǎn)量最高，達(dá)到4.1×108mL-1；其次為麥芽糖和葡萄糖，因此選擇玉米粉、麥芽糖和葡萄糖作為Plackett-Burman試驗(yàn)碳源的考察因子。

圖1 菌株S12生長曲線Fig.1 Growth cure of strain S12

1.葡萄糖 Glucose；2.淀粉 Starch；3.麥芽糖 Maltose；4.蔗糖 Sucrose；5.甘露醇 Mannitol；6.玉米粉 Corn meal

2.3 氮源對(duì)芽孢產(chǎn)量的影響

以玉米粉2.0%、Na2HPO40.4%、NaH2PO40.2%、MgSO4·7H2O 0.05%、CaCl20.02%為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別加入1.0%、2.0%的6種不同氮源，進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)，圖3表明，6種氮源對(duì)菌株S12芽孢產(chǎn)量的影響依次為：牛肉膏>大豆蛋白胨>豆餅粉>酵母粉>胰蛋白胨>硫酸銨；1.0%牛肉膏為氮源時(shí)芽孢產(chǎn)量最高，達(dá)到5.3×108mL-1，因此選擇牛肉膏、大豆蛋白胨、豆餅粉為Plackett-Burman試驗(yàn)氮源的考察因子。

1.酵母粉 Yeast extract；2.豆餅粉 Bean cake powder；3.牛肉膏 Beef extract；4.大豆蛋白胨 Soybean tryptone；5.胰蛋白胨 Tryptone；6.硫酸銨 Ammonium sulfate

2.4 無機(jī)鹽對(duì)芽孢產(chǎn)量的影響

以玉米粉2.0%、牛肉膏1.0%、Na2HPO40.4%、NaH2PO40.2%作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別加入0.05%、0.1%的6種不同無機(jī)鹽，比較不同無機(jī)鹽種類和濃度對(duì)菌株S12發(fā)酵液中芽孢產(chǎn)量的影響，結(jié)果(圖4)表明：0.1% CaCO3對(duì)菌株S12發(fā)酵的促進(jìn)作用最強(qiáng)，芽孢產(chǎn)量達(dá)到6.2×108mL-1；其次為K2HPO4、MnSO4·H2O。因此，以CaCO3、K2HPO4、MnSO4·H2O為Plackett-Burman試驗(yàn)無機(jī)鹽成分的考察因子。

1.MgSO·7H2O; 2.CaCl2; 3.CaCO3; 4.ZnCl2; 5.K2HPO4; 6.MnSO4·H2O

2.5 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

根據(jù)單因素試驗(yàn)確定的9種營養(yǎng)成分作為影響因子進(jìn)行考察，分別為玉米粉、麥芽糖、葡萄糖、豆餅粉、大豆蛋白胨、牛肉膏、CaCO3、K2HPO4、MnSO4·H2O，選用9因子2水平試驗(yàn)次數(shù)N=12的設(shè)計(jì)，表1和表2中A、B、C、D、E、F、G、J和K分別代表玉米粉、麥芽糖、葡萄糖、豆餅粉、大豆蛋白胨、牛肉膏、K2HPO4、MnSO4·H2O、CaCO3，用H和L代表虛擬因子以考察試驗(yàn)誤差，每個(gè)因子取低水平(-1)和高水平(+1)，2個(gè)水平見表1，通過不同的組合，檢測(cè)發(fā)酵液中芽孢產(chǎn)量，試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果見表2。通過Design Expert v8.0.6.1軟件對(duì)芽孢產(chǎn)量測(cè)定結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，獲得多元一次回歸方程：Y1=331.00+103.67A-29.67B-16.33C-13.00D+161.00E-13.00F-19.67G-25.00J+47.00K，式中Y1為芽孢產(chǎn)量的預(yù)測(cè)值，A、B、C、D、E、F、G、J、K分別為玉米粉、麥芽糖、葡萄糖、豆餅粉、大豆蛋白胨、牛肉膏、K2HPO4、MnSO4·H2O、CaCO3質(zhì)量分?jǐn)?shù)的編碼水平。

表1 Plackett-Burman試驗(yàn)因素及水平設(shè)置Table 1 Factors and level design of Plackett-Burma test

表2 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Experimental design and results of Plackett-Burma test

由芽孢產(chǎn)量影響因素主效應(yīng)分析結(jié)果可知(表3)，回歸模型的值為0.007 8<0.05，說明該模型顯著，即該模型在被研究的整個(gè)回歸區(qū)域擬合很好。培養(yǎng)基中各因素對(duì)菌株S12芽孢產(chǎn)量的影響效應(yīng)大小順序依次為：大豆蛋白胨>玉米粉>CaCO3>麥芽糖>MnSO4·H2O>K2HPO4>葡萄糖>豆餅粉、牛肉膏。其中大豆蛋白胨(P=0.001 4)、玉米粉(P=0.003 3)、CaCO3(P=0.016 0)是主要的影響因子。因此，本試驗(yàn)結(jié)果確定大豆蛋白胨、玉米粉、CaCO3為影響S12菌株芽孢產(chǎn)量的主要因子。

2.6 最陡爬坡路徑試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

根據(jù)Plackett-burman試驗(yàn)結(jié)果，對(duì)玉米粉、大豆蛋白胨和CaCO33個(gè)主要影響因子進(jìn)行最陡爬坡路徑試驗(yàn)，確定此3因子的最適質(zhì)量分?jǐn)?shù)范圍。隨玉米粉、大豆蛋白胨和CaCO3質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，發(fā)酵液中芽孢產(chǎn)量的變化趨勢(shì)先上升后下降(表4)，玉米粉1.5%，大豆蛋白胨1.5%，CaCO30.08%時(shí)對(duì)應(yīng)的芽孢產(chǎn)量達(dá)到最大值，為3因子的最大響應(yīng)值區(qū)域。

表3 Plackett-burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)的方差分析Table 3 Variance analysis of Plackett-Burma test

表4 最陡爬坡路徑試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 4 Design and results of steepest climbing test

2.7 響應(yīng)面分析的試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

3個(gè)重要因子的最適質(zhì)量分?jǐn)?shù)范圍確定后，以玉米粉為1.5%、大豆蛋白胨為1.5%、CaCO3為0.08%為中心點(diǎn)，進(jìn)行3因素(玉米粉、大豆蛋白胨、CaCO3)3水平(-1、0、1)的響應(yīng)面分析試驗(yàn)。芽孢產(chǎn)量的測(cè)定結(jié)果見表5。通過Design Expert軟件對(duì)優(yōu)化試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項(xiàng)式回歸擬合，獲得芽孢產(chǎn)量對(duì)玉米粉、大豆蛋白胨、CaCO3質(zhì)量分?jǐn)?shù)的二次多項(xiàng)式回歸方程為：Y2=724.00+21.50A+46.50E+33.00K+80.00AE+35.00AK-17.00EK+43.00A2-187.00E2-32.00K2(Y2芽孢產(chǎn)量的預(yù)測(cè)值，A、E、K分別為玉米粉、大豆蛋白胨、CaCO3質(zhì)量分?jǐn)?shù))。

該二次多項(xiàng)模型及其各項(xiàng)的方差分析結(jié)果表明(表6)，該模型回歸P值<0.000 1，失擬項(xiàng)P值為0.554 2>0.05，說明回歸方程的顯著性和可靠性很高，因此該模型可以用于菌株S12芽孢產(chǎn)量發(fā)酵優(yōu)化的理論分析和預(yù)測(cè)。另外，二次響應(yīng)面回歸模型的決定系數(shù)R2值為0.980 6，說明回歸方程的擬合程度較好，預(yù)測(cè)值和實(shí)測(cè)值之間具有高度的相關(guān)性，可以用于該菌株芽孢產(chǎn)量的理論預(yù)測(cè)。

本研究根據(jù)二次多項(xiàng)模型并利用Design Expert v8.0.6.1軟件繪制出響應(yīng)面分析圖(圖5至圖7)，每個(gè)響應(yīng)面分別代表2個(gè)獨(dú)立變量之間的相互作用，此時(shí)第3個(gè)變量保持在0水平。其中，圖5是CaCO3質(zhì)量分?jǐn)?shù)編碼值為0時(shí)，玉米粉和大豆蛋白胨質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)芽孢產(chǎn)量的交互影響；圖6是大豆蛋白胨質(zhì)量分?jǐn)?shù)編碼值為0時(shí)，玉米粉和CaCO3質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)芽孢產(chǎn)量的交互影響；圖7是玉米粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)編碼值為0時(shí)，大豆蛋白胨和CaCO3質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)芽孢產(chǎn)量的交互影響。從圖5可以看出，在本試驗(yàn)條件下，大豆蛋白胨質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化對(duì)芽孢產(chǎn)量變化的影響較大，其中在中質(zhì)量分?jǐn)?shù)時(shí)能獲得較高的芽孢產(chǎn)量。從圖6可以看出，玉米粉和CaCO3質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化對(duì)芽胞產(chǎn)量變化的影響較小。從圖7可以看出，大豆蛋白胨質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化對(duì)芽孢產(chǎn)量變化的影響較大，其中在中質(zhì)量分?jǐn)?shù)時(shí)能獲得較高的芽孢產(chǎn)量。因此，可以確定該菌株產(chǎn)芽孢培養(yǎng)基中大豆蛋白胨質(zhì)量分?jǐn)?shù)處于中間水平時(shí)能獲得較高的芽孢產(chǎn)量。

表5 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 5 Design and results of Box-Behnken test

表6 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)方差分析Table 6 Variance analysis of Box-Behnken experiment

圖5 玉米粉和大豆蛋白胨質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)芽孢產(chǎn)量交互影響的三維曲面圖(A)和相應(yīng)等高線圖(B)Fig.5 Stereo images and contour of response surface of spore yield under interaction of maize flour and soybean tryptone

圖6 玉米粉和CaCO3質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)芽孢產(chǎn)量交互影響的三維曲面圖(A)和相應(yīng)等高線圖(B)Fig.6 Stereo images and contour of response surface of spore yield under interaction of maize flour and CaCO3

圖7 大豆蛋白胨和CaCO3質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)芽孢產(chǎn)量交互影響的三維曲面圖(A)和相應(yīng)等高線圖(B)Fig.7 Stereo images and contour of response surface of spore yield under interaction of soybean tryptone and CaCO3

2.8 最佳芽孢產(chǎn)量與驗(yàn)證

為了得到菌株S12芽孢產(chǎn)量的最佳培養(yǎng)基組成，將所得回歸方程分別對(duì)各自變量取一階偏導(dǎo)等于零。得到如下方程式：

21.5+80E+35K+86A=0

46.5+80A-17K-374E=0

33+35A-17E-64K=0

求解方程組，可得模型極值坐標(biāo)為：A=-0.394 1，E=0.026 7，K=0.293，相當(dāng)于玉米粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.30%，大豆蛋白粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.51%，CaCO3質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.08%。按照優(yōu)化后的培養(yǎng)基組分即玉米粉1.30%，大豆蛋白胨1.51%，CaCO3質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.08%，NaH2PO4·2H2O 0.2%、Na2HPO4·2H2O 0.4%，優(yōu)化后芽孢產(chǎn)量達(dá)到7.46×108mL-1，同初始培養(yǎng)基(1.53×108mL-1)相比提高了387.58%，并且與預(yù)測(cè)芽孢產(chǎn)量7.29×108mL-1接近，可見該模型能較好地預(yù)測(cè)芽孢的實(shí)際產(chǎn)量。

3 討 論

隨著綠色生態(tài)農(nóng)業(yè)發(fā)展的需求以及“減肥減藥”的需要，生物制劑越來越受到人們青睞。其中生物農(nóng)藥主要通過微生物發(fā)酵產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)獲得。微生物的發(fā)酵機(jī)理相對(duì)復(fù)雜，易受多種因素的影響，如菌種生物學(xué)特性、培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)條件等。因此，發(fā)酵工藝優(yōu)化對(duì)芽孢桿菌發(fā)酵水平的提高起著重要的促進(jìn)作用，通過對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化可以提高發(fā)酵液中菌體和芽孢的產(chǎn)量，并降低生產(chǎn)成本[22-23]。

芽孢是產(chǎn)芽孢類細(xì)菌在生長繁殖過程中產(chǎn)生的一種抗逆休眠體，并非細(xì)菌生活史中不可缺少的部分，它的形成受營養(yǎng)物質(zhì)和環(huán)境因素的影響[22]。張冬冬等[12]對(duì)菌株BacillusmalacitensisZ-5進(jìn)行了產(chǎn)芽孢培養(yǎng)基優(yōu)化，結(jié)果表明碳源對(duì)菌株的芽孢產(chǎn)量影響最大，其次是無機(jī)鹽，氮源影響最小，發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化后配方(質(zhì)量分?jǐn)?shù))為：玉米粉1.66%，豆餅粉1.30%，MnSO4·H2O 0.07%，優(yōu)化后芽孢產(chǎn)量達(dá)到1.97×109mL-1；王倩等[24]在搖瓶發(fā)酵基礎(chǔ)上對(duì)Bacillusmegaterium1-12芽孢形成的主要影響因素進(jìn)行了考察，并采用單因素和正交試驗(yàn)確定了最佳產(chǎn)孢的培養(yǎng)基組成：玉米粉1%，大豆蛋白胨1%，CaCl2·2H2O 0.1%，MnSO4·H2O 0.05%。以上研究均表明，培養(yǎng)基成分及其配比是影響芽孢形成和產(chǎn)量的重要因素。

自然情況下，菌體遇到不利因素時(shí)才產(chǎn)生芽孢。當(dāng)營養(yǎng)匱乏時(shí)，雖然芽孢形成率高，但芽孢總數(shù)過低；當(dāng)營養(yǎng)豐富時(shí)，菌體生長繁殖快但芽孢形成率低，所以進(jìn)行產(chǎn)芽孢培養(yǎng)基組成研究非常必要。因此，本研究通過搖瓶發(fā)酵試驗(yàn)采用Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)和響應(yīng)面法中的Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)枯草芽孢桿菌S12的產(chǎn)芽孢培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化，通過優(yōu)化確定玉米粉、大豆蛋白胨和CaCO3為主效應(yīng)因子并得出三者的組成配比分別為：1.30%、1.51%和0.08%。通過模型預(yù)測(cè)的芽孢產(chǎn)量為7.29×108mL-1，經(jīng)驗(yàn)證結(jié)果為7.46×108mL-1，表明模型預(yù)測(cè)與試驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果基本一致，用該模型可以合理、有效地預(yù)測(cè)菌株S12的芽孢產(chǎn)量。碳源、氮源和無機(jī)鹽均是芽孢桿菌生長和芽孢形成所必須的營養(yǎng)物質(zhì)。本研究結(jié)果表明，當(dāng)玉米粉作為碳源時(shí)，能促進(jìn)菌株S12芽孢的形成，而且廉價(jià)易得，這與王倩等[24]的研究結(jié)果一致；而當(dāng)大豆蛋白胨作為氮源時(shí)，菌株S12發(fā)酵液中芽孢產(chǎn)量最大，這不同于張冬冬等[12]的豆餅粉作為氮源時(shí)芽孢產(chǎn)量最大的結(jié)果，可能是由于芽孢桿菌菌株的不同，或是菌株的生長環(huán)境不同等原因造成的。姚露燕等[25]、張冬冬等[12]和段玲玲等[26]的研究表明，Mn2+既可以促進(jìn)芽孢桿菌菌體生長，也可以促進(jìn)芽孢形成，而K+和Ca2+在提高芽孢形成率方面發(fā)揮著重要作用。本研究結(jié)果也表明，金屬離子Ca2+、K+和Mn2+均能促進(jìn)芽孢的產(chǎn)生并提高了芽孢產(chǎn)量，可能是這3種金屬離子參與了碳水化合物的代謝以及芽孢形成相關(guān)酶作用的發(fā)揮[27]。

本試驗(yàn)僅對(duì)菌株S12產(chǎn)芽孢發(fā)酵所需要的培養(yǎng)基成分及其配比進(jìn)行了室內(nèi)搖瓶發(fā)酵的初步研究，在提高芽孢產(chǎn)率的同時(shí)，降低了生防菌劑原藥的生產(chǎn)成本。后期還需進(jìn)一步對(duì)其發(fā)酵條件包括培養(yǎng)基pH、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時(shí)間等因素進(jìn)行優(yōu)化，并通過罐上發(fā)酵確定相應(yīng)的發(fā)酵參數(shù)。