夏 惠，梁 東，劉 繼

(1.四川農(nóng)業(yè)大學 果蔬研究所，成都 611130；2.成都市農(nóng)林科學院，成都 611130)

山梨醇是一種小分子物質(zhì)，不僅是大多數(shù)薔薇科果樹主要的光合產(chǎn)物[1]，也是碳水化合物的主要運輸形式[2]，而且山梨醇可以在植物遭遇脫水[3]、低溫[4]、缺素[5]和病害[6]等脅迫時在細胞內(nèi)大量積累，通過調(diào)節(jié)細胞滲透勢而改善植物抗逆性。多項研究表明，6-磷酸山梨醇脫氫酶(Sorbitol-6-phosphate dehydrogenase， S6PDH；EC 1.1.1.200)是山梨醇生物合成的關鍵酶[7-8]，催化葡萄糖-6-磷酸生成山梨醇-6-磷酸，隨后在非專一的磷酸酯酶作用下生成山梨醇[9]。目前已在多種薔薇科植物中獲得了 S6PDH基因序列[10-13]，研究發(fā)現(xiàn)它的表達在光合組織[14-16]或逆境條件下[17-19]較高。多個轉(zhuǎn)基因的研究也證明了 S6PDH基因在植物抵御逆境脅迫方面的功能[20-22]。

真核生物中基因的表達調(diào)控是一個復雜的問題，而轉(zhuǎn)錄作為基因表達的初始步驟，是基因表達調(diào)控機制中重要的一環(huán)，啟動子在其中的作用就顯得尤為重要，啟動子的特性往往決定著一個基因的表達特性[23]。因此，為更加深入地研究 S6PDH的表達特性與功能，對該基因啟動子的研究就顯得必不可少，但目前關于該基因啟動子的研究還很少，只有個別研究探索了該啟動子的特性[24-26]。為了更深入地分析 S6PDH基因啟動子的功能特性，本研究從目前栽培蘋果的主要砧木楸子中克隆到該啟動子，然后在構建啟動子——報告基因融合表達載體的基礎上瞬時轉(zhuǎn)化煙草葉片，最后通過轉(zhuǎn)基因煙草葉片中報告基因的表達量分析該啟動子的表達特性。研究結果為深入探索 S6PDH基因及其啟動子的表達模式和功能特性奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 植物材料

3 a生楸子(Malusprunifolia)葉片用于DNA提取及啟動子克隆。煙草(Nicotianatabacumcv. NC89)種子經(jīng)4 ℃低溫鍛煉7 d后，播種于已滅菌的基質(zhì)中，覆蓋保鮮膜保濕，于溫室中培養(yǎng)至出苗[約3～4周，光照16 h(25 ℃)和黑暗8 h(20 ℃)]，然后再培養(yǎng)至合適大小時用于農(nóng)桿菌介導的瞬時轉(zhuǎn)化分析。

1.2 啟動子克隆與序列分析

楸子葉片基因組DNA 的提取參考CTAB法[27]。根據(jù)以前研究獲得的蘋果 S6PDH基因啟動子序列[24]設計上游引物S1和下游引物A1(S1：5′ -GAAGGGGTGGCTCAAGTGTA-3 ′；A1：5′-CATCTCGTAGCCACTGCTCA-3′)，以提取的楸子葉片DNA為模板，利用Mighty TA-cloning Reagent Set for PrimeSTAR(TaKaRa)進行PCR 擴增(擴增體系與程序參照說明書)。擴增產(chǎn)物經(jīng)80 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收目的片段并與pMD18-T(TaKaRa)載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞Top10，菌液PCR篩選呈陽性的克隆送至測序公司進行測序。將測序正確的序列命名為Mp-S-P并提交到PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/ webtools/plantcare/html/)進行在線順式作用元件預測，在DNAMAN軟件中預測限制性酶切位點。

1.3 啟動子-GUS基因融合表達載體構建

根據(jù)Mp-S-P序列的酶切位點分析結果，并結合瞬時表達載體 pC0390-GUS(該載體中GUS前無啟動子)的多克隆位點設計上游引物S2和下游引物A2(S2：5′-CGCGTCGACGAAGGGGTGGCTCAAGTGTA-3′；A2：5′-TCCCCCGGGGT TTTCTCACTCTCCAAACT-3′)，以含有該啟動子序列的克隆載體為模板，通過PCR反應引入酶切位點SalⅠ和SamⅠ(序列見引物下劃線部分)，并將擴增產(chǎn)物克隆至pMD-T Simple(TaKaRa)載體中。同時用SalⅠ和SamⅠ酶切載體 pC0390-GUS和帶有酶切位點的克隆載體，37 ℃酶切3 h 后經(jīng)電泳分離，回收目的片段，并進行連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞Top10后進行測序驗證。提取序列正確的單菌落質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細胞，在含慶大霉素和卡那霉素的培養(yǎng)基中篩選陽性單菌落用于煙草葉片瞬時轉(zhuǎn)化。

1.4 農(nóng)桿菌介導的煙草葉片瞬時轉(zhuǎn)化

將經(jīng)檢測的含有pMp-S-P-GUS融合載體的農(nóng)桿菌菌株培養(yǎng)至OD600為0.6～0.8，然后用注射器人工注入煙草葉片，具體參照Sparkes等[28]的方法。以含有 pC0390-35S-GUS(CaMV35S驅(qū)動GUS基因表達)和 pC0390-GUS(沒有啟動子驅(qū)動GUS基因表達)載體的農(nóng)桿菌菌液采用相同的方法注射后分別作為陽性對照(P)和陰性對照(N)。

1.5 GUS蛋白活性檢測

檢測原理：GUS能以4-甲基傘形酮酰-β-D-葡萄糖酸苷(4-methylumbelliferyl-β-D-glucuronide，4-MUG)為底物，使之水解為4-甲基傘形酮(4-methylumbelliferone，4-MU)與β-D-葡萄糖醛酸。4-MU為熒光物質(zhì)，能被365 nm的光激發(fā)，產(chǎn)生455 nm的熒光，產(chǎn)生的熒光值由熒光分光光度計定量。酶活力單位定義：每分鐘水解 4-MUG 生成1 nmol/L或1 μmol/L 4-MU的酶量作為一個活力單位，以每毫克蛋白的酶活力來計算，結果表示成4-MU nmol/min/mg Protein。具體流程參考Jefferson[29]的方案。

1.6 脅迫和外源生長調(diào)節(jié)劑處理

對瞬時轉(zhuǎn)化的煙草幼苗進行100 μmol/L脫落酸(ABA)、200 μmol/L 赤霉素(GA3)、1 mmol/L水楊酸(SA)、100 μmol/L茉莉酸甲酯(MeJA)及避光和低溫(4 ℃)處理。ABA、GA3、SA和MeJA直接噴施于經(jīng)瞬時轉(zhuǎn)化的煙草葉片，以噴施等量水為對照，噴霧后放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h(條件同“1.1”)后檢測GUS蛋白活性。避光和低溫處理24 h，以正常條件(同“1.1”)下培養(yǎng)的瞬時轉(zhuǎn)化植株為對照，檢測GUS蛋白活性。

2 結果與分析

2.1 啟動子克隆與序列分析

根據(jù)以前獲得的蘋果 S6PDH基因啟動子序列設計特異引物，通過PCR擴增獲得了楸子 S6PDH基因啟動子序列，經(jīng)測序后發(fā)現(xiàn)該序列的長度為2 364 bp，并命名為Mp-S-P(圖1)。將Mp-S-P與以前研究獲得的 S6PSH基因啟動子序列進行比對后發(fā)現(xiàn)，二者在DNA序列結構上非常相似，序列之間的相似性達到97%，只有個別的地方存在堿基的差異或缺失/插入。

將Mp-S-P序列提交到PlantCARE網(wǎng)站進行啟動子序列分析，結果發(fā)現(xiàn)許多重要的順式作用元件(表1和圖1)。除了典型的與轉(zhuǎn)錄起始相關的TATA-box元件和CAAT-box元件外，Mp-S-P上還存在許多與光響應相關的元件，如ACE、CATT-motif、G-box、GA-motif、GAG-motif、GATA-motif、I-box、MRE、Spl、chs-CMA2a和circadian等。還發(fā)現(xiàn)幾個與逆境脅迫相關的元件，如LTR、MBS和TC-rich repeats等。另外，還發(fā)現(xiàn)一些響應植物激素的元件，如響應茉莉酸甲酯的CGTCA-motif和TGACG-motif、響應乙烯的ERE、響應赤霉素的GARE-motif和P-box和響應水楊酸的TCA-element等。

根據(jù)這些預測分析結果，可以發(fā)現(xiàn)Mp-S-P序列中存在著大量的與生物和非生物逆境脅迫相關的元件，表明楸子 S6PDH基因及其啟動子能參與多種脅迫響應，并在抗逆防御反應過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。

起始密碼子以實線框標出。與已鑒定的順式作用元件同源的基序用陰影標識，其對應的元件名稱在陰影下標出。向左的箭頭表示與啟動子方向相反的順式作用元件。

2.2 不同處理下GUS蛋白活性分析

為進一步分析和驗證Mp-S-P的功能，本研究將該啟動子與GUS融合并瞬時轉(zhuǎn)化煙草葉片，然后對這些轉(zhuǎn)基因煙草進行ABA、GA3、SA、MeJA、避光和低溫處理，處理之后收集葉片，分析其中GUS蛋白活性，用來反映Mp-S-P的活性。

結果如圖2所示，在持續(xù)低溫處理下(圖2-A)，GUS蛋白的活性被極顯著地誘導，達到對照(常溫處理)的6.79倍，明顯高于對照活性，表明低溫處理顯著提高了Mp-S-P的活性。在避光處理24 h后(圖2-B)，處理組中GUS活性顯著降低，只有對照組的30%左右，表明避光處理可以降低Mp-S-P的活性。研究還使用外源SA(圖2-C)、ABA(圖2-D)、GA3(圖2-E)和MeJA(圖2-F)噴施轉(zhuǎn)基因煙草，結果發(fā)現(xiàn)SA(圖2-C)和GA3(圖2-E)處理均可以顯著提高煙草葉片中GUS蛋白的活性，分別比它們各自的對照提高10.54和1.34倍，表明以上這些外源生長調(diào)節(jié)劑可以誘導Mp-S-P的表達。但與對照相比，ABA(圖2-D)處理和MeJA(圖2-F)處理卻降低了Mp-S-P的活性，因為其對應的GUS蛋白活性只有對照的0.77和0.91倍。各種處理在陽性對照和陰性對照中差異均不顯著。

表1 楸子 S6PDH基因啟動子順式作用元件Table 1 cis-elements in S6PDH promoter sequence of Malus prunifolia

3 討 論

通過同源克隆法，本研究獲得了楸子 S6PDH基因上游2 364 bp的啟動子序列。經(jīng)序列相似性比對發(fā)現(xiàn)，本研究獲得的啟動子序列與課題組以前獲得的蘋果主栽品種‘嘎啦’(Malusdomesticcv. Gala)的 S6PDH基因啟動子序列一致性達到97%以上[24]，它們的差異類型只是一些堿基的變異和缺失。另外，楸子(數(shù)據(jù)未發(fā)表)和栽培蘋果中 S6PDH基因序列[30]也完全一致。這些結果表明，山梨醇作為薔薇科植物特有的一種主要初生代謝產(chǎn)物，其合成關鍵基因及其上游序列是非常保守的。

A.低溫 Cold；B.避光 Dark；C.水楊酸 SA；D.脫落酸 ABA；E.赤霉素 GA3；F.茉莉酸甲酯 MeJA

蘋果[15]、梨[16]、桃[31]和枇杷[32]中的研究發(fā)現(xiàn)， S6PDH表達量和酶活性隨著葉片的生長發(fā)育過程而不斷增加，當葉片的光合能力最大時達到最高值。這表明 S6PDH的表達與光照密切相關，其表達可能受到光的調(diào)控。在現(xiàn)在的研究結果中，筆者通過生物信息學分析發(fā)現(xiàn)Mp-S-P中存在大量的光響應元件(表1和圖1)，如ACE、G-box、CATT-motif、GA-motif、GAG-motif、GATA-motif、I-box、MRE、Spl、chs-CMA2a和circadian等，這與栽培蘋果中的研究是一致的[24]。為了驗證Mp-S-P是否受到光的調(diào)控，筆者對轉(zhuǎn)入pMp-S-P-GUS融合載體的轉(zhuǎn)基因煙草進行了避光處理，結果發(fā)現(xiàn)GUS活性顯著降低，表明Mp-S-P的活性受到光的誘導表達。在以前的研究中發(fā)現(xiàn)，栽培蘋果中的 S6PDH基因啟動子也有相類似的表達特性[24]。但對比栽培蘋果和楸子的 S6PDH基因啟動子卻可以發(fā)現(xiàn)它們二者在光響應元件的種類和數(shù)量上存在一定的差異。這些結果從一定程度上表明蘋果屬植物 S6PDH基因啟動子中都有很多的光響應元件，而且這些元件之間的功能很可能可以互補。

山梨醇作為一種小分子物質(zhì)，可以在植物抵御生物和非生物逆境時大量積累， S6PDH的表達也是如此[3,17,19]。本研究也在Mp-S-P序列中發(fā)現(xiàn)了一些直接與抗逆有關的元件，如LTR、MBS和TC-rich repeats等，而且還發(fā)現(xiàn)了與生物逆境應激反應相關的CGTCA-motif、TGACG-motif和TCA-element等元件。為了證明這些元件是否能夠產(chǎn)生逆境響應的功能，筆者對轉(zhuǎn)入pMp-S-P-GUS融合載體的轉(zhuǎn)基因煙草進行了不同的逆境處理和外源生長調(diào)節(jié)劑處理，結果發(fā)現(xiàn)低溫、SA和GA3處理組中的GUS活性顯著高于對照組，黑暗處理中的GUS活性顯著低于其對照，這些可能和Mp-S-P序列中存在相應的響應元件有關(相關功能見表1)。以前在栽培蘋果中也發(fā)現(xiàn) S6PDH基因啟動子活性在低溫條件下上調(diào)表達，而在黑暗條件下下調(diào)表達[24，26]。誘導研究還發(fā)現(xiàn)，ABA和MeJA處理降低了GUS活性。根據(jù)生物信息學的分析結果，在整個Mp-S-P序列中有多個響應MeJA的元件，如CGTCA-motif和TGACG-motif，但為什么該啟動子活性在MeJA誘導下沒有上調(diào)，其原因還需進一步研究。在栽培蘋果 S6PDH基因啟動子序列中還存在1個響應ABA的元件——ABRE，因此可以響應ABA的誘導[24]。但由于堿基發(fā)生了變異，本研究獲得的Mp-S-P序列中沒有發(fā)現(xiàn)這個順式作用元件，這也可能是楸子 S6PDH基因啟動子在ABA誘導下下調(diào)的原因，但這些還需更多的研究來驗證。

綜上所述，以上的結果初步證明該啟動子具有光和逆境響應特性，也從一定角度解釋了 S6PDH的表達、酶活性及山梨醇含量在不同條件下增加的機制。但本研究只是進行了整個全長啟動子的表達特性分析，下一步還可以通過構建5′系列缺失體來深入研究不同元件在啟動子表達過程中的作用機制，并分析不同長度啟動子對各種外界條件的響應。

4 結 論

研究獲得了2 364 bp的楸子 S6PDH基因上游啟動子序列并命名為Mp-S-P。序列分析發(fā)現(xiàn)Mp-S-P中存在多個元件，除基本的轉(zhuǎn)錄起始元件外，還有光響應元件、脅迫響應元件和激素響應元件。研究還應用農(nóng)桿菌介導的模式植物煙草瞬時表達系統(tǒng)分析了獲得的啟動子序列的表達特性，發(fā)現(xiàn)該序列可以被避光、低溫、SA、ABA、GA3和MeJA等外界條件誘導。