劉長友 蘇秋竹 范保杰 曹志敏 張志肖 武 晶 程須珍 田 靜,*

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栽培綠豆V1128抗豆象基因定位

劉長友1蘇秋竹1范保杰1曹志敏1張志肖1武 晶2程須珍2田 靜1,*

1河北省農(nóng)林科學(xué)院糧油作物研究所/ 河北省作物遺傳育種實驗室, 河北石家莊 050031;2中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所, 北京 100081

對抗豆象資源中蘊藏的抗豆象基因進行定位, 是對其充分利用的前提和基礎(chǔ)。本研究通過對抗豆象栽培綠豆V1128和感豆象栽培綠豆冀綠7號雜交形成的F2分離群體進行抗豆象鑒定, 分析V1128抗豆象遺傳規(guī)律; 并利用混合群體分離分析法(BSA法)篩選抗感池間的多態(tài)性標(biāo)記, 進而利用QTL IciMapping 4.0對V1128抗豆象基因進行染色體定位分析。結(jié)果表明, V1128對綠豆象的抗性由具有主效作用的顯性單基因控制, 暫命名其為“”。在將抗豆象性狀作為質(zhì)量性狀的條件下, 按照顯性單基因的定位方法, 將抗豆象基因定位在綠豆染色體5上, 位于標(biāo)記DMB158和VRBR-SSR033 (標(biāo)記VRID5、VRBR-SSR032與VRBR-SSR033的連鎖群位置相同)之間, 兩側(cè)遺傳距離分別為4.4 cM和5.8 cM, 所在物理區(qū)間約288 kb。將抗豆象性狀作為數(shù)量性狀, 采用完備區(qū)間作圖法(ICIM)對種子被害率進行QTL定位, 同樣在標(biāo)記DMB158和VRBR-SSR033之間檢測到1個主效QTL, 其LOD值為38.04, 可以解釋表型變異(PVE)的71.64%, 來自父本V1128的等位基因具有明顯減少種子被害率的效應(yīng)。該研究結(jié)果可以為綠豆抗豆象分子標(biāo)記輔助育種及抗豆象基因的精細(xì)定位和克隆提供有用信息。

綠豆; 抗豆象; V1128;; QTL

綠豆()作為一種醫(yī)食同源的作物, 在健康飲食和膳食結(jié)構(gòu)調(diào)整中發(fā)揮著越來越重要的作用[1]。近年來, 我國綠豆品種的產(chǎn)量和品質(zhì)都有大幅提高[2]。然而, 綠豆儲藏過程中的豆象危害卻一直是困擾農(nóng)民和商家的主要難題。

豆象是危害綠豆等食用豆類作物的嚴(yán)重倉儲害蟲。危害綠豆的豆象種類主要有綠豆象()、四紋豆象()、鷹嘴豆象()、巴西豆象()和灰豆象()等, 其中在我國存在的主要是綠豆象和四紋豆象, 且綠豆象對生產(chǎn)的危害最嚴(yán)重[3-4], 若處置不及時, 可在3~6個月內(nèi)造成整倉綠豆全部受損[5-6]。生產(chǎn)上防治豆象危害一般采用磷化鋁熏蒸法, 這種處理方法存在農(nóng)藥殘留超標(biāo)和造成環(huán)境污染的隱患, 不符合安全生產(chǎn)的目標(biāo)。培育抗豆象綠豆品種, 利用作物本身的抗性是一種最經(jīng)濟有效的防治豆象危害的手段。然而, 以雜交選育為主要手段的常規(guī)育種途徑存在選擇周期長、抗豆象鑒定工作繁瑣等諸多問題。對抗豆象基因進行定位, 開拓抗豆象育種方法, 利用分子手段輔助抗豆象育種, 成為當(dāng)前十分緊迫的研究課題。

到目前為止, 篩選鑒定出的抗豆象綠豆種質(zhì)資源主要有TC1966、ACC41、V2802、V2709、V1128和V2817 6份[7-10]。其中TC1966和ACC41是2份野生綠豆資源。研究表明, TC1966的抗豆象基因和ACC41的抗豆象基因均為單顯性主基因遺傳[8,11-12], 但它們的豆象抗性還可能存在其他微效基因的修飾作用[13]。Talekar等[9]和Somta等[14]先后發(fā)現(xiàn)栽培綠豆V2802和V2709高抗綠豆象和四紋豆象。Somta等[10]發(fā)現(xiàn)另外2份栽培綠豆V1128和V2817對綠豆象和四紋豆象具有完全抗性。利用不同類型的分子標(biāo)記和作圖群體, TC1966的基因和ACC41的基因已經(jīng)被定位在不同的連鎖標(biāo)記之間[12,15-18]。孫蕾等[19]以V2709為研究材料, 將其抗豆象基因定位在1個RAPD和1個STS標(biāo)記之間。Chotechung等[20]和Kaewwongwal等[21]分別將V2802和V2709的抗豆象基因定位在綠豆第5染色體上, 并預(yù)測可能是V2802的抗豆象候選基因, 而和可能是V2709的抗豆象候選基因。

在抗豆象育種中, 應(yīng)用抗豆象野生種容易引入一些不利性狀, 如蔓生、炸莢等。加強對栽培抗豆象綠豆資源的研究利用可以有效避免這些問題。V1128是對綠豆象和四紋豆象均具有完全抗性的栽培綠豆資源, 在人工種子試驗中表現(xiàn)出比V2817更強的抗性[10]。因此, V1128在綠豆抗豆象育種中具有更大的潛力。然而, 到目前為止, V1128抗豆象基因的遺傳定位研究尚無人開展。對其進行抗豆象基因定位有利于補充對目前尚不明晰的綠豆抗豆象基因的認(rèn)識, 并加強其在抗豆象育種中的應(yīng)用。因此, 本研究利用感豆象親本冀綠7號和抗豆象親本V1128雜交組配獲得的F2群體對V1128抗豆象基因進行遺傳定位分析, 為V1128及其他綠豆抗豆象資源抗性基因來源及基因克隆提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

抗豆象材料V1128由泰國農(nóng)業(yè)大學(xué)Peerasak Srinnives教授惠贈, 該材料籽粒無光澤; 感豆象材料為河北省農(nóng)林科學(xué)院糧油作物研究所育成品種冀綠7號, 該材料籽粒有光澤。以冀綠7號作母本, V1128作父本, 雜交獲得F1。籽粒無光澤相對于籽粒有光澤為顯性, 因此可以從F1植株所收獲籽粒判斷是否為真雜交種。選擇來源于同一F1植株的種子繁殖F2分離群體, 共獲得158個單株, 用于抗豆象遺傳分析和構(gòu)建遺傳連鎖圖譜。

1.2 DNA提取

從每個F2單株取幼嫩的三出復(fù)葉, 立即投入液氮, –80°C保存, 以備提取DNA。利用植物基因組提取試劑盒(TIANGEN, 北京)提取DNA。使用1%瓊脂糖凝膠檢測DNA質(zhì)量。利用超微量核酸蛋白檢測儀(Nanodrop ND-2000, 美國)測定DNA濃度, 并稀釋到10 ng μL–1。

1.3 抗豆象鑒定及遺傳分析

從每個鑒定單株隨機選取90粒健康種子, 分成3個重復(fù), 每個重復(fù)30粒, 分別放入直徑5 cm、高1.8 cm的圓形小塑料盒中。同時, 分別放入抗豆象親本V1128和感豆象親本冀綠7號作為對照。將小塑料盒并排放入大塑料箱內(nèi)(66 cm×40 cm×15 cm), 每個大塑料箱中放入剛羽化1~3 d的成蟲作為蟲源(平均每份被鑒定材料3~8對), 至每粒種子著卵量3~5粒時, 除去成蟲; 養(yǎng)蟲室溫度(29±2)℃, 濕度60%~70%。待感蟲親本完全被蛀食后(約40~60 d), 調(diào)查每份材料的受害粒數(shù)。3個重復(fù)取平均值用于后續(xù)數(shù)據(jù)分析。

參照Young等[15]和Kaewwongwal等[21]的豆象抗性分級方法, 種子被害率0~80%視為抗, 其中0~20%視為純合抗性, 21%~80%視為雜合抗性; 種子被害率81%~100%視為純合感豆象。利用Microsoft Excel 2010進行卡方測驗, 檢測F2群體的抗感分離比是否符合3 (抗)∶1 (感)的遺傳分離規(guī)律, 利用SPSS 16.0統(tǒng)計分析軟件計算F2群體種子被害率的頻率分布。

1.4 DNA標(biāo)記分析

分別選擇10個完全抗豆象和10個完全感豆象F2單株的DNA混合組成抗感池。利用兩親本和抗感池進行多態(tài)性分子標(biāo)記篩選, 選擇在兩親本間表現(xiàn)多態(tài)且抗池帶型與V1128相同, 感池帶型與冀綠7號相同的標(biāo)記用于后續(xù)F2群體的基因型分析。

PCR擴增及電泳分析參照Liu等[22]的方法。在親本和抗感池間共計篩選了3767個不同類型的分子標(biāo)記, 包括SSR、EST-SSR、STS和Indel標(biāo)記。最終獲得在兩親本間表現(xiàn)多態(tài)且抗池帶型與V1128相同, 感池帶型與冀綠7號相同的分子標(biāo)記31個, 其中VRID1和VRID5為InDel標(biāo)記, 其余均為SSR標(biāo)記, 多態(tài)性標(biāo)記信息見表1。

表1 多態(tài)性標(biāo)記信息

1.5 抗豆象基因定位

利用QTL IciMapping 4.0構(gòu)建連鎖圖譜[27]。在LOD=5.0時進行標(biāo)記分組, 利用Kosambi作圖方法計算相鄰標(biāo)記間的遺傳距離[28]。采用兩種方法定位抗豆象基因, 第一種, 將抗豆象性狀作為質(zhì)量性狀, 根據(jù)上述分級方法分類, 純合抗豆象記作“A”, 純合感豆象記作“B”, 雜合抗豆象記作“H”, 由此, 將抗豆象基因“”作為一個表型標(biāo)記構(gòu)建到連鎖圖中, 對其進行連鎖定位; 第二種, 將抗豆象性狀作為數(shù)量性狀, 以F2群體的種子被害率定位QTL。QTL作圖方法為完備區(qū)間作圖法(ICIM)[29], QTL的顯著性LOD閾值在=0.01時作10 000次置換試驗(Permutation test)確定, 其他參數(shù)設(shè)置采用QTL IciMapping 4.0軟件的默認(rèn)參數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 親本及F2群體的豆象抗性鑒定與遺傳分析

經(jīng)抗豆象鑒定, 親本V1128表現(xiàn)為完全抗豆象(種子被害率=0), 而親本冀綠7號表現(xiàn)為完全感豆象(種子被害率=100%)。F2群體的抗性頻率分布趨向于二項分布(圖1), 抗感分離比為117 (抗)∶41 (感), 卡方測驗符合3 (抗)∶1 (感)的分離規(guī)律, χ2=0.034 (χ20.05,=1= 3.84)。將37份種子被害率0~20%的材料視為純合抗性個體, 80份種子被害率21%~80%的材料視為雜合抗性個體, 41份種子被害率81%~100%視為純合感豆象個體, 卡方測驗符合1∶2∶1的分離規(guī)律, χ2= 0.228 (χ20.05,=2= 5.99)。說明抗豆象親本V1128對綠豆象的抗性由具有主效作用的顯性單基因控制。延續(xù)前人的命名規(guī)則, 將該基因暫命名為“”。

圖1 F2群體種子被害率分布圖

2.2 基因定位

利用31個多態(tài)性分子標(biāo)記對158個F2單株進行基因型分析, 獲得每個個體的基因型數(shù)據(jù)。在將抗豆象性狀作為質(zhì)量性狀的條件下, 按照顯性單基因的定位方法, 抗豆象基因作為一個表型標(biāo)記與31個多態(tài)性分子標(biāo)記共同進行標(biāo)記間連鎖分析。在LOD=5.0時, 所有31個分子標(biāo)記和表型標(biāo)記均位于同一分組內(nèi), 形成長度為73.9 cM的連鎖群。在該連鎖群中, 抗豆象基因被定位于標(biāo)記DMB158和VRBR-SSR033 (標(biāo)記VRID5、VRBR-SSR032與VRBR-SSR033的連鎖群位置相同)之間, 兩側(cè)遺傳距離分別為4.4 cM和5.8 cM (圖2)。

利用F2群體的分子標(biāo)記基因分型數(shù)據(jù)單獨進行連鎖圖譜構(gòu)建, 在LOD=5.0時, 形成1個長度為65.7 cM的連鎖群。將抗豆象性狀作為數(shù)量性狀, 采用完備區(qū)間作圖法(ICIM)對種子被害率進行QTL定位, 在該連鎖群上檢測到1個主效QTL, 位于標(biāo)記DMB158和VRID5 (標(biāo)記VRBR-SSR032、VRBR-SSR033與VRID5的連鎖群位置相同)之間, LOD值為38.04, 可以解釋表型變異(PVE)的71.64%, 其加性效應(yīng)和顯性效應(yīng)值分別為57.78和22.92 (圖3)。來自父本V1128的等位基因具有明顯減少種子被害率的效應(yīng)。

為了將與其他研究的抗豆象QTL定位結(jié)果進行比較, 利用7個共有標(biāo)記將V1128抗豆象基因的QTL分析結(jié)果與V2709的QTL進行共線性分析, 所有7個共有標(biāo)記均表現(xiàn)出極好的共線性。本研究中定位的V1128的抗豆象QTL與V2709的抗豆象位點QTL位于臨近的標(biāo)記區(qū)間內(nèi)(圖4), 2個QTL間存在部分重疊。

圖2 抗豆象基因Br3連鎖定位分析

利用QTL IciMapping 4.0軟件進行標(biāo)記連鎖分析, LOD=5; 連鎖群左右兩側(cè)分別標(biāo)示圖距(單位為cM)和標(biāo)記名稱。

Linkage map constructed by using QTL IciMapping 4.0 software, LOD=5; map distances (cM) and marker names are shown on the left and right sides of the linkage group, respectively.

圖3 抗豆象QTLqBr3的定位圖譜

利用QTL IciMapping 4.0軟件的完備區(qū)間作圖法(ICIM)進行QTL 定位分析; 連鎖群左右兩側(cè)分別標(biāo)示圖距(單位為cM)和標(biāo)記名稱; 豎線標(biāo)示LOD閾值(3.18)。

QTL mapping based on inclusive composite interval mapping method (ICIM) using QTL IciMapping 4.0 software; map distances (cM) and marker names are shown on the left and right sides of the linkage group, respectively; the vertical line shows the LOD threshold (3.18).

圖4 QTL定位結(jié)果共線性比較分析

基于7個共有標(biāo)記, 利用MapChart 2.2軟件[30]作本研究與Kaewwongwal等[21]構(gòu)建的連鎖圖譜的共線性圖譜; 左側(cè)標(biāo)尺標(biāo)示連鎖群長度, 單位為cM; “LG1”為本研究構(gòu)建的連鎖圖譜, “LG2”為Kaewwongwal等構(gòu)建的連鎖圖譜; QTL名字用斜體字標(biāo)示。

A synteny map between the genetic linkage map from this study and the linkage map constructed by Kaewwongwal et al.[21], this map was drown using MapChart 2.2 software[30]based on seven common markers; the scale bars on the left of the figure indicate the length of each linkage group in cM; “LG1” is the linkage group constructed in this study, “LG2” was constructed by Kaewwongwal et al.; the names of QTLs are shown in italics.

為了確定基因的染色體位置, 利用其兩側(cè)標(biāo)記的引物序列與已經(jīng)公布的綠豆基因組數(shù)據(jù)庫[31]進行BLAST分析。DMB158位于綠豆第5染色體(Chr5: 5 597 658… 5 597 891), VRID5位于綠豆第5染色體(Chr5: 5 410 272… 5 410 493), VRBR-SSR032位于綠豆第5染色體(Chr5: 5 310 107…5 310 281), VRBR-SSR033位于綠豆第5染色體(Chr5: 5 380 081…5 380 180)。若取4個標(biāo)記間的最遠(yuǎn)距離(VRBR-SSR032和DMB158之間), 可以將定位在綠豆第5染色體約288 kb的物理區(qū)間內(nèi)(5 310 107… 5 597 891)。在此區(qū)間內(nèi)共有11個注釋基因(表2), 其中有5個基因編碼RD22類蛋白, 2個基因編碼多聚半乳糖醛酸酶抑制劑類蛋白, 3個基因編碼未知蛋白;則為假基因。

3 討論

從第一份抗豆象野生綠豆資源TC1966被發(fā)現(xiàn)以來, 研究者就沒有停止過對不同抗豆象資源的遺傳規(guī)律、基因定位、抗豆象機制等的研究。大量的研究表明, 不同抗豆象綠豆資源中均存在主效的顯性抗豆象基因[8,11-12]。同TC1966、ACC41、V2802、V2709的抗豆象遺傳規(guī)律相似, V1128的抗豆象特性也由主效的顯性單基因控制。但從不同抗豆象單株的種子被害率存在差異、抗豆象性狀表現(xiàn)出一定程度的數(shù)量性狀遺傳特征來看, 很可能也存在其他微效基因起修飾作用。這與Chen等[13]對TC1966抗豆象遺傳規(guī)律的分析結(jié)論相同。

基于抗豆象綠豆資源中存在主效抗性單顯性基因, 可以將抗豆象性狀作為質(zhì)量性狀定位, 如Young等[15]、Kaga等[12]、Wang等[18]、孫蕾等[19]在對TC1966、ACC41、V2709的抗豆象基因定位研究中均采用了此策略。同時, 抗豆象性狀表現(xiàn)出一定程度的數(shù)量性狀遺傳特征, 因此可以將其按照數(shù)量性狀QTL定位的方法定位。如Chotechung等[20]、Kaewwongwal等[21]、Mei等[17]、Hong等[32]、Chen等[13]均采用數(shù)量性狀QTL定位的方法, 根據(jù)種子被害率對V2802、V2709、ACC41、TC1966的抗豆象性狀進行QTL定位。本研究同時采用上述2種方法均將定位在相同的標(biāo)記區(qū)間內(nèi)。2種方法的結(jié)果可以相互驗證, 從而增加定位的準(zhǔn)確度。

表2 V1128抗豆象基因位點范圍內(nèi)基因注釋

V1128抗豆象基因所在的物理區(qū)間(5 310 107… 5 597 891)包含在Kaga等[12]對TC1966抗豆象基因的定位標(biāo)記區(qū)間內(nèi)(Bng143~Bng110, 物理區(qū)間為Chr.5: 5 052 031…6 779 027)。同時, 該區(qū)間包含Chotechung等[20]對V2802抗豆象基因定位的標(biāo)記區(qū)間(VrSSR013~ DMB158, 物理區(qū)間為Chr.5: 5 561 387…5 597 891), 而與Kaewwongwal等[21]對V2709抗豆象基因定位的標(biāo)記區(qū)間(VRID5~VRBR-SSR037, 物理區(qū)間為Chr.5: 5 410 272… 5 647 621)存在大部分重疊。表明這些不同的抗豆象種質(zhì)可能具有相同或緊密連鎖的抗豆象基因。.

Chotechung等[20]在V2802的抗豆象分離后代群體中發(fā)現(xiàn)標(biāo)記DMB158與抗豆象性狀共分離, 該標(biāo)記位于()基因內(nèi)部, 認(rèn)為基因很可能是V2802的抗豆象候選基因。另外一個與緊密連鎖的基因()與抗豆象性狀不存在共分離, 認(rèn)為不是抗豆象基因。然而Liu等[33]在NM92íTC1966的重組自交系群體中發(fā)現(xiàn)DMB158與抗豆象性狀不完全連鎖, 表明不是TC1966的抗豆象基因。根據(jù)綠豆基因組注釋結(jié)果, Kaewwongwal等[21]確定V2709的定位區(qū)間內(nèi)共有8個注釋基因, 其中包括和。VrPGIP1和VrPGIP2蛋白同屬于多聚半乳糖醛酸酶抑制劑類蛋白, 研究表明該類蛋白在植物抵御微生物病原體侵染及昆蟲危害中起作用。如菜豆的基因在抗菌核病中發(fā)揮作用[34]; 菜豆PvPGIP3/PvPGIP4蛋白可以抑制盲蝽象的多聚半乳糖醛酸酶[35]。因此, 預(yù)測和可能是V2709的抗豆象候選基因。本研究構(gòu)建的連鎖圖譜與Kaewwongwal等[21]構(gòu)建的連鎖圖譜具有很好的共線性。但在本研究中DMB158與抗豆象性狀之間并不存在共分離。因此,可能不是V1128的抗豆象基因。在定位區(qū)間內(nèi)的11個注釋基因中, 5個為RD22類蛋白編碼基因。研究表明RD22類蛋白可能與植物抵御生物或非生物脅迫有關(guān)。如擬南芥的RD22蛋白參與耐脫水脅迫過程[36]。然而, 不能排除這類基因在抗豆象過程中發(fā)揮作用的可能性。同樣, 在11個注釋基因中還有3個未知蛋白的編碼基因, 它們是否在抗豆象過程中起作用還無法判斷。因此, 目前還不能僅僅依靠定位區(qū)間內(nèi)基因功能分析的結(jié)果來判斷V1128抗豆象基因的歸屬。有待進一步利用較大的近等基因系群體, 從中尋找交換單株, 對抗豆象基因精細(xì)定位。

致謝:對泰國農(nóng)業(yè)大學(xué)Peerasak Srinnives教授提供抗豆象栽培綠豆種質(zhì)V1128表示感謝。

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Genetic Mapping of Bruchid Resistance Gene in Mungbean V1128

LIU Chang-You1, SU Qiu-Zhu1, FAN Bao-Jie1, CAO Zhi-Min1, ZHANG Zhi-Xiao1, WU Jing2, CHENG Xu-Zhen2, and TIAN Jing1, *

1Institute of Food and Oil Crops, Hebei Academy of Agricultural and Forestry Sciences / Hebei Laboratory of Crop Genetic and Breeding, Shijiazhuang 050031, Hebei, China;2Institute of Crop Sciences, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China

It is an urgent research topic to map the bruchid resistance gene and to carry out bruchid resistance breeding using molecular marker-assisted method in mungbean. This study was carried out to identify a F2isolated group formed by the hybrid of a bruchid-resistant cultivar “V1128” and a bruchid-susceptible cultivar “Jilyu 7”, and to analyze the genetic regularity of V1128 in resistance to bruchids. The bulked segregant analysis (BSA) method was used for screening the polymorphic markers. Genetic linkage map construction and quantitative trait locus (QTL) mapping were conducted using software QTL IciMapping 4.0. The results showed that the bruchid resistance of V1128 was controlled by a dominant gene with main effect. According to previous naming rules, the bruchid resistance gene of V1128 was temporarily named as “”. When we treated bruchid-resistance as a quality trait,was used as a marker for linkage map construction and was positioned between the markers DMB158 and VRBR-SSR033 (VRID5, VRBR-SSR032, and VRBR-SSR033 are located at the same map position). The genetic distances ofaway from the two markers were 4.4 cM and 5.8 cM, respectively.was positioned on chromosome 5 in the physical range of about 288 kb. By using the inclusive composite interval mapping (ICIM) to locate the seed damage rate, a main QTL locus with LOD score of 38.04 was identified in the marker intervals from DMB158 to VRBR-SSR033, contributing 71.64% of the observed phenotypic variation. The allele of male parent V1128 had a significant effect on reducing the rate of seed damage. The results can provide useful information for the molecular marker-assisted breeding of mungbean, and the fine localization and cloning of.

mungbean; bruchid resistance; V1128;; QTL

2018-05-08;

2018-08-20;

2018-09-18.

10.3724/SP.J.1006.2018.01875

通信作者(Corresponding author): 田靜, E-mail: nkytianjing@163.com, Tel: 0311-87670655

E-mail: Liuchangyou2006@aliyun.com.cn

本研究由國家自然科學(xué)基金項目(31601367), 國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(CARS-08), 河北省科技計劃項目(16227508D)和河北省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新工程項目(F18R494004-01)資助。

This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (31601367), the China Agriculture Research System (CARS-08), the Science and Technology Program of Hebei (16227508D), and the Modern Agricultural Science and Technology Innovation Program of Hebei Province (F18R494004-01).

URL:http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20180915.1120.004.html