馮 韜 官春云

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甘藍型油菜蕓薹素唑耐受因子(BnaBZR1/BnaBES1)全長CDS克隆與生物信息學分析

馮 韜 官春云*

湖南農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院 / 國家油料改良中心湖南分中心, 湖南長沙 410128

蕓薹素唑耐受因子(brassinazole-resistant, BZR)是油菜素內(nèi)酯信號轉導過程中的關鍵轉錄因子, 目前已知BZR1與BZR2 (BES1)兩種亞型。本文在甘藍型油菜湘油15號cDNA中克隆到3個全長編碼序列(coding sequence, CDS), 經(jīng)比對鑒定分別為定位于A07染色體的1拷貝BZR1和定位于A06染色體的2拷貝BES1, 分別命名為、和, 序列長分別為996、993和996 bp, 各自編碼331、330、331個氨基酸。這3個基因編碼蛋白具有典型植物BZR/BES結構域, 亞細胞定位預測主要位于細胞核。多序列比對和進化分析表明,基因編碼蛋白與甘藍、白菜、擬南芥、亞麻芥等BZR/BES蛋白具有較高的同源性, 且同源物種間BZR1或BES1相似度高于同一物種或者近緣物種中BZR1與BES1間相似度, 表明BZR1與BES1分化是一個早期進化事件。湘油15號中這3個基因表達規(guī)律相似, 苗期和花期具有高水平的基因表達, 抽薹期和角果成熟期表達稍低; 且基因表達水平在地上部分的葉、莖、花和角果中相對于地下部分的根中較高。

甘藍型油菜; 蕓薹素唑耐受因子; 基因克隆; 基因表達; 生物信息學分析

油菜素內(nèi)酯信號途徑是植物中重要的激素途徑, 其活性調(diào)控與植物生長發(fā)育以及抗逆能力息息相關。蕓薹素唑耐受因子BZR是油菜素內(nèi)酯信號與其他信號互作的核心元件, 在油菜素內(nèi)酯信號轉導中BZR1/BES1復合體與PIF4和DELLA等轉錄因子互作, 分別介導油菜素內(nèi)酯信號途徑與光信號[1]、赤霉素信號[2]、茉莉酸信號[3]等互作。在擬南芥中, AtBZR1與AtBES1形成異源復合體并相互磷酸化, 磷酸化后的異源二聚體與AtPIF4結合, 形成三元復合物介導下游基因表達調(diào)控, 從而完成油菜素內(nèi)酯信號與光信號之間的傳遞, AtBZR1/AtBES1通過磷酸化修飾結合DELLA蛋白, 從而影響赤霉素的生物合成與赤霉素信號通路產(chǎn)生互作[4]。

擬南芥[5]、水稻[6]等植物中油菜素內(nèi)酯信號途徑的研究比較深入, 不僅完成了信號途徑中主要基因的克隆, 而且對信號轉導、傳遞有了較全面的認識。擬南芥和水稻中油菜素內(nèi)酯信號轉導過程基本一致, 油菜素內(nèi)酯(BRs)結合膜表面受體BRI1激活其激酶活性, 并誘導BRI1結合BAK1形成二聚體后相互磷酸化, BSKs蛋白通過活化的BRI1磷酸化其230位絲氨酸而激活, 活化的BSKs蛋白激活BSU1活性, 進而BSU1阻斷BIN2對BZR/BES蛋白的過磷酸化, 去磷酸化的BZR/BES蛋白在細胞核積累并與PIF4和DELLA等轉錄因子互作, 同時參與下游靶基因轉錄調(diào)控。

有研究表明, 油菜素內(nèi)酯可以促進油菜對高鹽環(huán)境耐受性, 調(diào)節(jié)油菜真菌抗性, 影響油菜脂代謝。油菜素內(nèi)酯處理可明顯改善油菜幼苗對滲透脅迫的抗性[7], 2,4-表油菜素內(nèi)酯可增強油菜對丁香假單胞菌的抗性[8], 同時2,4-表油菜素內(nèi)酯影響油菜脂代謝, 調(diào)控酯質(zhì)信號的產(chǎn)生和轉導[9]。過表達油菜素內(nèi)酯合成基因可以促進油菜提高產(chǎn)量[10], 表明油菜素內(nèi)酯與甘藍型油菜生長發(fā)育息息相關, 油菜素內(nèi)酯在油菜生產(chǎn)上有廣闊的應用前景。然而甘藍型油菜中油菜素內(nèi)酯信號途徑的相關研究卻比較薄弱, 信號通路的構成元件大部分都還處于未知狀態(tài), 嚴重制約了油菜素內(nèi)酯信號相關基因篩選在高含油、高抗性油菜新品種選育過程中的作用, 限制了油菜分子育種中相關基因工程的應用, 同時由于理論研究的空白限制了油菜素內(nèi)酯在油菜生產(chǎn)上的應用。

本文通過甘藍型油菜基因組數(shù)據(jù)庫中預測的基因序列設計引物, 從甘藍型油菜品種湘油15號中克隆獲得3個基因CDS序列, 一個鑒定為BZR1型, 2個鑒定為BES型, 均位于A染色體組。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

甘藍型油菜雙低品系湘油15號由國家油料改良中心湖南分中心提供。

1.2 RNA提取與cDNA合成

將湘油15號在22℃、光周期為16 h/8 h條件下培養(yǎng)至2片真葉, 取幼苗50~100 mg。加液氮充分研磨后, 使用TRIzol RNA提取試劑盒(TransGen生物技術有限公司)按其所示方法提取總RNA, 以此RNA為模板參照Easy Script First-Strand cDNA Synthesis SuperMix試劑盒(TransGen生物技術有限公司)說明書合成第1鏈cDNA。

1.3 BnaBZR基因的克隆及序列分析

從BRAD數(shù)據(jù)庫(http://brassicadb.org/brad/)甘藍型油菜全轉錄組中提取以及的轉錄本序列。分析比對, 設計含起始密碼子的5'端引物和含有終止密碼子的3'端引物, 合成備用。設計的引物序列為BnaBZR1-F: 5'-ATGACGTCAGA TGGAGCTAC-3', BnaBZR1-R: 5'-TCAACCACGAG CTTTGCCG-3', BnaBES1-F: 5'-ATGACGTCTGACG GTGCG-3', BnaBES1-R: 5'-CTAACGACCTTTAGCG TTTCC-3'。以1.2所述cDNA為模板進行PCR擴增。PCR體系含50 ng μL–1模板1 μL、10 mmol L–1dNTPs 0.5 μL、2 μmol L–1BnaBZR1-F 0.75 μL、2 μmol L–1BnaBZR1-R 0.75 μL、10×反應緩沖液1 μL、HiFi高保真DNA聚合酶0.5 μL和ddH2O 15.5 μL。程序為預變性95℃ 5 min; 95℃ 50 s, 58℃ 45 s, 72℃ 3 min, 35個循環(huán); 72℃后延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳, 用凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad)檢測和記錄結果。將PCR產(chǎn)物回收后與pMD18-T載體(TransGen生物技術有限公司)連接, 轉化大腸桿菌感受態(tài)細胞Trans1-T1 (北京天根生化有限公司), 篩選陽性克隆進行基因測序, 通過BRAD數(shù)據(jù)庫(http://brassicadb.org/brad/)對獲得的克隆序列進行染色體步移分析, 隨后使用DNAman對克隆獲得的和基因全長CDS序列進行序列比對。通過NCBI核酸數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm. nih.gov/nuccore/)下載甘藍型油菜BZR相關基因轉錄本序列及植物BZR相關蛋白, 構建HMM文件, 使用HMMER軟件檢索甘藍型油菜預測蛋白組, 并就BZR相關轉錄本在甘藍型油菜基因組中的分布進行分析。

1.4 BnaBZR蛋白生物信息學分析

1.4.1 BnaBZR1_A07、BnaBES1_A06F和BnaBES1_ A06R氨基酸序列特征與二級結構預測 通過ANTHEPROT 6.2軟件分析來源于甘藍型油菜的BnaBZR1和BnaBES1基因所編碼的蛋白質(zhì)。統(tǒng)計編碼蛋白的氨基酸殘基組分、分析編碼蛋白的等電點、信號肽序列和親疏水特征并使用Gariner模型進行二級結構預測。使用PSORT (http://psort.hgc.jp/form. html)和Plant-mPLoc (http://www.csbio.sjtu.edu.cn/ cgi-bin/PlantmPLoc.cgi)進行亞細胞定位預測。

1.4.2 BnaBZR蛋白同源結構域分析 使用DNAman對BnaBZR蛋白進行同源比對分析; 同時使用NCBI (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)分別對不同的BnaBZR蛋白序列進行保守結構域分析; 使用SMART (http://smart.embl-heidelberg.de/)、MOTIF (http://www. genome.jp/tools/motif/)及InterPro (http://www.ebi.ac. uk/interpro/)分析BnaBZR包含的特殊結構域。

1.4.3 BZR蛋白聚類分析 通過NCBI蛋白數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein)、String數(shù)據(jù)庫(http://string.embl.de/)和PDB數(shù)據(jù)庫(http://www. pdb.org/pdb/home/home.do)檢索來源于不同物種的BZR相關蛋白序列, 并使用MEGA6.0對來源不同的BZR1相關蛋白進行聚類分析。

1.5 甘藍型油菜中BnaBZR1_A07、BnaBES1_ A06F和BnaBES1_A06R基因時空表達分析

以1.2方法提取甘藍型油菜湘油15號不同時期根、莖、葉、花和角果皮總RNA, 使用寶生物工程(大連)有限公司PrimeScript RTreagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real-time)試劑盒進行反轉錄, 獲得cDNA第1鏈作為qRT-PCR模板。分析1.3中克隆獲得的片段, 根據(jù)序列特征設計分型引物, 以作為內(nèi)參基因[11], 用于和時空表達分析, 每樣品進行3次重復。QRT-PCR在ABI 7500熒光定量PCR系統(tǒng)上運行。PCR體系包含1 μL cDNA、10 μL 2×FastStart Universal SYBR GreenMaster with ROX、10 μmol L–1正向引物和反向引物各0.5 μL、8 μL ddH2O。PCR程序為95℃ 10 min; 95℃ 15 s, 60℃ 15 s, 72℃ 32 s, 35個循環(huán)。反應完成后進行95℃ 20 s, 60℃ 20 s, 95℃ 20 s, 59℃ 20 s繪制熔解曲線檢測擴增產(chǎn)物的正確性和引物二聚體。

2 結果與分析

2.1 BnaBZR基因全長CDS序列的克隆

以湘油15 cDNA為模板, 克隆到3個CDS序列, 長度分別為996、993和996 bp (圖1), 分別定位于A07、A06和A06染色體上, 分別命名為、和。通過BRAD數(shù)據(jù)庫比對, 確認3個CDS序列的完整性, 以3條CDS序列為模板分別對BRAD數(shù)據(jù)庫進行檢索, 發(fā)現(xiàn)1條同源序列位于C06染色體, 相似度82.5%, 發(fā)現(xiàn)1條和共有同源序列位于C08染色體, 相似度分別為85.2%和84.9%; 同時對、和進行多序列比對發(fā)現(xiàn),與和相似度分別為82.28%和82.26%,和相似度98.79%。以上結果表明, 克隆獲得的與和分屬2個不同的家族亞類群, 并在C亞基因組上存在對應的同源基因; 甘藍型油菜基因組具異源多倍性, 其A、C兩個亞基因組之間高度同源, 在A染色體組上的基因大多存在C染色體組同源基因, C染色體組基因亦然。

圖1 BnaBZR1_A07、BnaBES1_A06F和BnaBES1_A06R 基因克隆

M: 2K DNA marker; 1:編碼序列; 2:編碼序列; 3:編碼序列。

M: 2K DNA marker; 1:CDS; 2:CDS; 3:CDS.

從NCBI共獲取甘藍型油菜BZR/BES及BZR/BES類似序列轉錄本13個, 7個位于C染色體組, 6個位于A染色體組, 主要集中于A06、A07、A08、C06、C08和C09染色體; HMMER檢索甘藍型油菜預測蛋白組數(shù)據(jù)庫共發(fā)現(xiàn)31條具有BZR/BES家族特征結構域的序列, 其中17個位于A染色體組, 14個位于C染色體組; 表明具有特征的基因在甘藍型油菜A/C基因組間分布較均勻, 具有特征的家族基因在甘藍和白菜2個亞組間可能具有相似的進化規(guī)律。

2.2 BnaBZR生物信息學分析

和基因各自編碼長度331、330和331個氨基酸殘基的蛋白, 分別命名為BnaBZR1_A07、BnaBES1_ A06F和BnaBES1_A06R (表1)。

表1 BnaBZR1、BnaBES1_F和BnaBES1_R蛋白信息匯總表

BnaBZR蛋白主要表現(xiàn)疏水性, 未發(fā)現(xiàn)信號肽序列, 暗示其不存在信號肽介導的跨膜轉運。PSORT與Plant–mPLoc亞細胞定位預測顯示, BnaBZR1_A07與BnaBES1_A06F和BnaBES1_A06 R 均主要定位于細胞核, 可信度0.789, 這與BZR蛋白作為轉錄因子的功能一致。

二級結構預測結果如圖2, BnaBZR1_A07有27% α螺旋、14% β折疊、29% β轉角和32%無規(guī)卷曲; BnaBES1_A06F分別有24%、16%、29%和31%; BnaBES1_A06R分別有23%、16%、29%和32%。

圖2 BnaBZR1_A07、BnaBES1_A06F和BnaBES1_A06R蛋白二級結構

通過ANTHEPROT分析了BnaBZR1_A07、BnaBES1_A06F和BnaBES1_A06R蛋白具有的序列特異性識別位點。由表2可知, BnaBES1_A06F和BnaBES1_A06R具有僅含微弱差別的特異性識別序列, BnaBES1_A06R相對于BnaBES1_A06F僅175– 177位置識別序列存在一個氨基酸殘基的差別, 其他位置的特異性識別序列完全一致, 表明BnaBES1_ A06F和BnaBES1_A06R蛋白相似度極高。BnaBZR1_A07蛋白缺少PS00016特異性序列, 同時PS00006特異性序列數(shù)量也更少。3條蛋白序列中特異性識別序列主要為糖基化修飾、磷酸化修飾、酰化修飾和細胞連接序列, 表明BnaBZR蛋白可能受多種激酶介導的糖基化、磷酸化、酰基化修飾調(diào)節(jié), 并可能介導細胞間連接, 這與擬南芥BZR蛋白通過磷酸化水平改變實現(xiàn)核質(zhì)穿梭與互作因子結合, 調(diào)控下游靶基因表達的功能相吻合。

表2 BnaBZR1_A07、BnaBES1_A06F和BnaBES1_A06R蛋白特殊識別位點序列總表

（續(xù)表2）

蛋白編號Serial number位點類型Domains type數(shù)量Number位置Location序列Sequence序列模式Sequence motif BnaBES1_A06RPS00005518–20, 23–25, 83–85, 99–101, 174–176TRR, SWR, TYR, SSR, TNK[ST]-x-[RK] PS00006623–26, 112–115, 134 –137, 227 –230, 237–240, 305–308SWRE, SPFE, SRGD, TIPE, STVD, TPWE[ST]-x(2)-[DE] PS0000855–10, 149–154, 150–155, 259–264, 325–330GATSTS, GGIPSS, GIPSSL, GVSSAV, GNAKGRG-{EDRKHPFYW}-x(2)-[STAGCN]-{P} PS000161135–137RGDR-G-D PS000011139–142NISTN-{P}-[ST]-{P} PS00004121–24RKPS[RK](2)-x-[ST] PS00005518–20, 24–26, 84–86, 100–102, 175–177TRR, SWR, TYR, SSR, TSK[ST]-x-[RK] PS00006624–27, 113–116, 135–138, 228–231, 238–241, 306–309SWRE, SPFE, SRGD, TIPE, STVD, TPWE[ST]-x(2)-[DE] PS0000855–10, 150–155, 151–156, 260–265, 326–331GATSTS, GGIPSS, GIPSSL, GVSSAV, GNAKGRG-{EDRKHPFYW}-x(2)-[STAGCN]-{P} PS000161136–138RGDR-G-D

PS00001: 糖基化位點; PS00004: cAMP/GMP 依賴激酶磷酸化位點; PS00005: 蛋白激酶C磷酸化位點; PS00006: 酪蛋白激酶磷酸化位點; PS00008: 豆蔻?；稽c; PS00016: 細胞粘連序列。

PS00001: N-glycosylation site; PS00004: cAMP- and cGMP-dependent protein kinase phosphorylation site; PS00005: Protein kinase C phosphorylation site; PS00006: Casein kinase II phosphorylation site; PS00008: N-myristoylation site; PS00016: Cell attachment sequence.

同源比對BnaBZR1_A07、BnaBES1_A06F和BnaBES1_A06R, 同時使用SMART和MOTIF分析結構域發(fā)現(xiàn), 3條BnaBZR蛋白具有基本相同的結構域, N端表現(xiàn)明顯的植物BZR/BES結構特征序列, C端結構差異相對明顯; 全長蛋白序列與pfam05687、PLN02905、cd00609等結構域相似度高, 3條蛋白序列中均存在多個激酶特征域, 可能參與磷酸化、?；? 蛋白本身又具豐富的磷酸化位點, 這與BZR/BES蛋白可以通過結合并相互磷酸化進行構象調(diào)控介導核質(zhì)穿梭的功能一致(圖3)。

通過不同數(shù)據(jù)庫, 共獲得70種來源于不同植物的BZR相關蛋白序列, 使用MEGA6.0進行聚類分析, 繪制進化樹(圖4)。

BZR/BES相關蛋白聚類表現(xiàn)出了明顯單、雙子葉植物差異, 十字花科植物BZR/BES蛋白明顯聚于同一亞群。對十字花科BZR/BES相關蛋白亞群分析可以發(fā)現(xiàn), BZR1及其相似蛋白明顯聚類, BZR2與其相似蛋白明顯聚類, 蛋白類別之間的差異遠大于物種差異, 同一亞類蛋白在不同的十字花科植物中相似度極高, 分枝距離極近, 然而, 甚至在同一物種中BZR1與BZR2亞群的分枝距離都較遠, 相似度相對較低, 表明BZR1與BZR2的分化是一個早期進化事件。但物種親緣關系極遠的單雙子葉植物中BZR/BES蛋白同樣具有較高的相似度, 較近的親緣關系, 表明BZR/BES蛋白家族在進化中起源古老且高度保守, 側面顯示BZR/BES家族蛋白可能具有能影響植物生存的重要作用。

2.3 甘藍型油菜中BnaBZR1時空表達特征

為進一步了解在甘藍型油菜中的功能, 對甘藍型油菜不同時期, 不同組織中、和表達進行了分析, 三基因定量引物為 BZR1_A07-F: 5'-CTCTC ATCTCCAACTTCCAA-3', BZR_A07-R: 5'-GACTC ATCACACTCAGGTAT-3'; BES1_A06F-F: 5'-TTCTC CGACCTTCAACCTA-3', BES1_A06F-R: 5'-TCCTC CATAGCCACATCAT-3￠; BES1_A06R-F: 5'-GGCTACTATACCTGAATGTGA-3', BES1_A06R-R: 5'-GCT GTTGCTGTTGTGAGA-3'; 內(nèi)參引物為BnUBC21- F: 5'-CCTCTGCAGCCTCCTCAAGT-3', BnUBC21-R: 5'-TATCTCCCCTGTCTTGAAATGC-3'。

圖3 BnaBZR氨基酸序列比對

由圖5可知, 湘油15號中、和具有相似的表達模式, 基因表達均表現(xiàn)一定的組織差異和一定的生長發(fā)育時間差異, 在莖葉花果等地上部分表達比地下部分高, 苗期、花期表達比抽薹期和角果成熟期高。在湘油15號根中的表達在各個生育時期均相對較低且平穩(wěn), 在莖葉中表達水平較高, 但在角果成熟過程中莖葉中表達水平顯著下降, 同時在花中可以發(fā)現(xiàn)高水平的表達。在湘油15號中相對于整體表現(xiàn)較低表達水平, 莖葉與根中表達水平的差異相對較小。在花期和表達水平達到峰值, 根中表達水平隨發(fā)育時期表現(xiàn)較明顯的差異。植物各組織均有油菜素內(nèi)酯合成能力, 但地上部分組織中油菜素內(nèi)酯含量高于地下部分, 尤其是花、種子和嫩葉中含量較高,、和在甘藍型油菜中表現(xiàn)的組織差異與此具有相似規(guī)律, 這也與油菜素內(nèi)酯一方面能通過一系列信號轉導促進BZR/BES活化, 同時BZR/BES又能對油菜素內(nèi)酯生物合成形成負反饋的規(guī)律吻合, 這一定程度上表明甘藍型油菜中、和與油菜素內(nèi)酯信號具有緊密的關聯(lián)性。

3 討論

湘油15號是我國第一個通過國家審定并大面積推廣的雙低油菜品種, 是油菜育種中應用非常廣泛的重要種質(zhì)資源, 但湘油15號未經(jīng)重測序, 大量基因并未被克隆和研究, 一定程度上制約了種質(zhì)資源的有效利用。本文從甘藍型油菜湘油15號中克隆獲得3個基因拷貝, 測序比對顯示與油菜基因組測序品種中雙11中序列一致, 各自編碼的BnaBZR蛋白的生物信息學分析顯示其具有典型的植物BZR/BES功能結構域, 亞細胞定位于細胞核, 具有多重轉錄因子功能的核心元件序列, 存在大量磷酸化, ?；δ芪稽c, 且本身具有磷酸化酶活性域, 表明基因是重要的涉及磷酸化調(diào)控的轉錄因子, 這與擬南芥[11]、水稻[12]等植物中BZR1/BES1通過形成復合體并相互磷酸化, 介導與PIF4、SMOS1等轉錄因子的互作, 并調(diào)控下游基因表達一致。

圖4 不同植物BZR/BES蛋白的進化樹分析

圖5 不同發(fā)育時期不同組織中BnaBZR1_A07、BnaBES1_A06F和BnaBES1_A06R的表達量

DAG表示種子萌發(fā)后天數(shù)。DAG means days after seed germination.

聚類分析顯示, BZR/BES蛋白在進化上具有較高的保守性, BnaBZR1_A07與白菜、甘藍、擬南芥等植物中BZR1及相似蛋白具有高度同源性, BnaBES1_A06F/R則與白菜、甘藍、擬南芥等植物中BZR2及相似蛋白高度同源, 同時, 十字花科各近緣種中BZR1與BZR2間分枝距離相對較遠, 表明BZR1與BZR2的分化可能先于物種分化, 但進化上又高度保守。另對甘藍型油菜BZR/BES相關基因染色體分布分析發(fā)現(xiàn)A、C亞基因組中BZR/BES出現(xiàn)較平衡, 這顯示了甘藍型油菜A、C亞基因組在進化關系上仍然具有較高的同源性, 也間接證實“禹氏三角”中白菜與甘藍的近緣關系[13]。

油菜素內(nèi)酯途徑已在多種植物中被證明與植物抗病、種子形成等生物學過程關系密切[14], 油菜素內(nèi)酯在油菜[15]、水稻[16]、番茄[17]等多種作物中被證實可以用來提高抗逆性, 并有油菜素內(nèi)酯施用增加玉米[18]、番茄等茄科作物[19]產(chǎn)量的報告。因此闡明甘藍型油菜中油菜素內(nèi)酯信號的轉化、傳遞對油菜育種和生產(chǎn)具有重要意義。BZR/BES是油菜素內(nèi)酯信號與IAA、GA、光信號等多種信號途徑互作的節(jié)點[20], 是油菜素內(nèi)酯信號調(diào)控植物生長發(fā)育的關鍵轉錄因子, 對其克隆、表達研究對闡釋油菜素內(nèi)酯信號在油菜中的作用具有重要意義。本文克隆獲得3個全長CDS, 分別定位在A07、A06、A06染色體上, 序列相似度較高, 這顯示基因起源較早且保守, 在原始的蕓薹屬植物中即已存在且具有重要功能。其中和同處在A06染色體端部相距不足10 kb的區(qū)域內(nèi)且二者序列相似性超過98%, 表明這很可能是一次基因重復造成。

對湘油15中、和表達研究顯示, 三者具有基本一致的表達規(guī)律, 表明基因在甘藍型油菜中可能具有相同或者相似的上游調(diào)控因子, 同時可能受到相同或者相似的環(huán)境因素、植物內(nèi)環(huán)境等影響。對甘藍型油菜中基因的表達調(diào)控、基因功能有待進一步研究。

4 結論

從甘藍型油菜湘油15號cDNA中克隆到3個全長編碼序列(coding sequence, CDS), 分別定位于A07、A06、A06號染色體, 分別命名為和。序列長分別為996、993、996 bp, 各自編碼331、330和331個氨基酸。該基因編碼蛋白與其他植物BZR/ BES具有較高相似性, 具有典型的BZR/BES結構域, 其起源較早, 但保守性較高。分析了和在湘油15號中的時空表達模式。

[1] Wang Z Y, Bai M Y, Oh E, Zhu J Y. Brassinosteroid signaling network and regulation of photomorphogenesis., 2012, 46: 701–724

[2] Gallego-Bartolomé J, Minguet E G, Grau-Enguix F, Abbas M, Locascio A, Thomas S G, Blázquez M A. Molecular mechanism for the interaction between gibberellin and brassinosteroid signaling pathways in., 2012, 109: 13446–13451

[3] Peleg Z, Blumwald E. Hormone balance and abiotic stress tole-rance in crop plants., 2011, 14: 290–295

[4] Wang W, Bai M Y, Wang Z Y. The brassinosteroid signaling network: a paradigm of signal integration., 2014, 21: 147–153

[5] Sun Y, Fan X Y, Cao D M, Tang W, He K, Zhu J Y, Patil S. Integration of brassinosteroid signal transduction with the transcription network for plant growth regulation in., 2010, 19: 765–777

[6] Tong H, Chu C. Brassinosteroid signaling and application in rice., 2012, 39: 3–9

[7] Efimova M V, Savchuk A L, Hasan J A K, Litvinovskaya R P, Khripach V A, Kholodova V P, Kuznetsov V V. Physiological mechanisms of enhancing salt tolerance of oilseed rape plants with brassinosteroids., 2014, 61: 733–743

[8] Skoczowski A, Janeczko A, Gullner G, Tóbias I, Kornas A, Barna B. Response of brassinosteroid-treated oilseed rape cotyledons to infection with the wild type and HR-mutant ofor with P. fluorescence., 2011, 104: 131–139

[9] Pokotylo I V, Kretynin S V, Khripach V A, Ruelland E, Blume Y B, Kravets V S. Influence of 24-epibrassinolide on lipid signalling and metabolism in., 2014, 73: 9–17

[10] Sahni S, Prasad B D, Liu Q, Grbic V, Sharpe A, Singh S P, Krishna P. Overexpression of the brassinosteroid biosynthetic geneinsimultaneously increases seed yield and stress tolerance., 2016, 6: 28298

[11] Lachowiec J, Mason G A, Schultz K, Queitsch C. Redundancy, feedback, and robustness in theBZR/BEH gene family., 2016: 053447

[12] Qiao S, Sun S, Wang L, Wu Z, Li C, Li X, Wang X. The RLA1/SMOS1 transcription factor functions with OsBZR1 to regulate brassinosteroid signaling and rice architecture., 2017, 29: 292–309

[13] Surhone L M, Timpledon M T, Marseken S F. Rapeseed. Germany: Betascript Publishing, 2010. pp 6–8

[14] Hao J, Yin Y, Fei S. Brassinosteroid signaling network: implications on yield and stress tolerance., 2013, 32: 1017–1030

[15] 李玲, 李俊, 張春雷, 張樹杰, 馬霓, 李光明. 外源 ABA 和 BR 在提高油菜幼苗耐漬性中的作用.中國油料作物學報, 2012, 34: 489–495 Li L, Li J, Zhang C L, Zhang S J, Ma L, Li G M. Effects of exogenous ABA and BR on waterlogging resistance of juvenile rapeseed., 2012, 34: 489–495 (in Chinese with English abstract)

[16] Yang D L, Yang Y, He Z. Roles of plant hormones and their interplay in rice immunity., 2013, 6: 675–685

[17] Zheng Q, Liu J, Liu R, Wu H, Jiang C, Wang C, Guan Y. Temporal and spatial distributions of sodium and polyamines regulated by brassinosteroids in enhancing tomato salt resistance., 2016, 400: 147–164

[18] 王慶燕, 管大海, 潘海波, 李建民, 段留生, 張明才, 李召虎. 油菜素內(nèi)酯對春玉米灌漿期葉片光合功能與產(chǎn)量的調(diào)控效應.作物學報, 2015, 41: 1557–1563 Wang Q Y, Guan D H, Pan H B, Li J M, Duan L S, Zhang M C, Li Z H. Effect of brassinolide on leaf photosynthetic function and yield in spring maize filling stage., 2015, 41: 1557–1563 (in Chinese with English abstract)

[19] Hayat S, Alyemeni M N, Hasan S A. Foliar spray of brassinoste-roid enhances yield and quality ofunder cadmium stress., 2012, 19: 325–335

[20] Fridman Y, Savaldi-Goldstein S. Brassinosteroids in growth control: how, when and where., 2013, 209: 24–31

Cloning and Characterization of Brassinazole-resistant (BnaBZR1 and BnaBES1) CDS fromL.

FENG Tao and GUAN Chun-Yun*

College of Agronomy, Hunan Agricultural University / National Oilseed Crops Improvement Center in Hunan, Changsha 410128, Hunan, China

Brassinazole-resistant (BZR) is a key transcription factor in brassinosteroid signaling pathway of plants, containing brassinazole-resistant 1 (BZR1) and brassinazole-resistant 2 (BES1). In this study, three novel BZR1 coding sequences (CDSs) were isolated from cDNA ofL. cv. Xiangyou 15 leaves, which were mapped on the chromosomes A07, A06, and A06, and designated as,, and, respectively. These threeCDSs were 996, 993, and 996 bp in length and encoded predicted proteins with 331, 330, and 331 amino acid residues, respectively. BnaBZR proteins were predicted to be located on the cell nucleus and have a typical plant BZR/BES conserved domain. Multiple sequence alignments and phylogenetic analysis showed that the deduced amino acid sequences of BnaBZR were highly homologous to previously reported BZR/BES of,, and. And the similarity of BZR1 or BES1 among different related species was higher than the similarity between BZR1 and BES1 in the same species or related species, indicating that BZR1 and BES1 differentiation is an early evolutionary event. The expression patterns of,, andin Xiangyou 15 were similar, whit high expression level at the seedling stage and flowering stage, while slightly lower level at the stage of bolting and podgrain ripening. The expression level ofin the aerial parts such as leaves, stems, flowers and pods was higher than that in underground parts.

L.; BZR; gene clone; gene expression; bionformatic analysis

2018-05-03;

2018-08-20;

2018-09-19.

10.3724/SP.J.1006.2018.01793

通信作者(Corresponding author):官春云, E-mail: guancy2011@aliyun.com

E-mail: 812298771@qq.com

本研究由國家重點基礎研究發(fā)展計劃(973計劃)項目(2015CB150206)資助。

This study was supported by the National Basic Research Program (973 Program) (2015CB150206).

URL:http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.s.20180917.1543.004.html