孫 弦 劉 睿 吳 庭 劉棟華

馬爾尼菲籃狀菌(Talaromrces Marneffei, TM)原名為馬爾尼菲青霉(Penicillium Marneffei, PM)是一種可致人類感染罹患馬爾尼菲籃狀菌病(Talaromycosis Penicilliosis Marneffei, TSM)的深部真菌，具有溫度雙相性。25℃呈菌絲相，產(chǎn)紅色素；37℃呈酵母相，產(chǎn)黑色素[1,2]。TSM患者已分布我國多地，為艾滋病、惡性腫瘤、免疫功能低下患者中較為常見的機(jī)會(huì)性感染[3,4]，病情極為兇險(xiǎn)復(fù)雜，死亡率高。前期研究表明，黑素是多種致病真菌的毒力因子，能降低對(duì)抗真菌藥物的敏感性，且TM酵母細(xì)胞在體外可利用左旋多巴合成多巴型黑素[5]。本研究將以TM黑素顆粒作為抗原，經(jīng)腹腔多次免疫BALB/c小鼠，采用雜交瘤技術(shù)來制備單抗，旨在探討TM黑素能否刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 6～8周齡SPF級(jí)雌性BALB/c小鼠，重約20 g。

1.1.2 細(xì)胞株 SP2/0-Ag14，中科院上海生命科學(xué)研究院。

1.1.3 主要試劑 RPMI-1640培養(yǎng)基(維森特生物技術(shù)有限公司)，HT/HAT培養(yǎng)基、FCA/FIA佐劑、人工合成黑素(美國Sigma公司)，牛血清白蛋白、PEG4000(Biosharp公司)，兔抗鼠IgG(SouthernBiotech公司)，羊抗人IgG (北京博奧森生物技術(shù)有限公司)

1.1.4 儀器 倒置顯微鏡(美國OLYMPUS公司)，酶標(biāo)儀、CO2培養(yǎng)箱(美國賽默飛世爾科技)

1.2 方法

1.2.1 抗原的提取 收集黑素化后的TM酵母細(xì)胞，通過溶壁酶、變性劑、蛋白酶、濃酸、強(qiáng)堿等步驟處理，獲取純化的TM多巴黑素顆粒，冷藏備用。

1.2.2 動(dòng)物免疫 小鼠隨機(jī)分組，將TM黑素(100 μg、200 μg、300 μg、500 μg)與弗氏完全佐劑/弗氏不完全佐劑充分乳化，經(jīng)小鼠腹腔注射，0.5～1 mL/只。設(shè)生理鹽水和人工合成黑素(100 μg)為空白和陽性對(duì)照組。共接種4次，間隔3周，歷時(shí)約3個(gè)月。收集小鼠腹水及血清-20℃貯存。

1.2.3 細(xì)胞融合反應(yīng) 取免疫小鼠脾細(xì)胞懸液和SP2/0細(xì)胞(按5∶1或10∶1)在50%聚乙二醇溶液介導(dǎo)下融合，置96孔板(100 μL/孔)，37℃ CO2培養(yǎng)箱中孵育。3天后倒置顯微鏡下逐日觀察，待細(xì)胞集落長至1/3～1/4每孔時(shí)，收集上清液檢測(cè)。

1.2.4 抗體特異性檢測(cè)

1.2.4.1 直接凝集反應(yīng) 稀釋TM黑素至20 μg/mL，于孔板內(nèi)與免疫小鼠腹水、血清、雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清液行抗原-抗體反應(yīng)，搖床水平、勻速、輕搖約5～8 min，記錄有無凝集現(xiàn)象。

1.2.4.2 間接ELISA法 將TM黑素包被于96孔酶標(biāo)板中，0.1 mL/孔，檢測(cè)免疫小鼠腹水、血清、雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清液中抗體的含量，加入酶結(jié)合物兔抗鼠IgG(1：4000)，用酶標(biāo)比色計(jì)測(cè)定OD值(TMB 450 nm)。

2 結(jié)果

2.1 小鼠免疫后的情況 免疫小鼠出現(xiàn)不同程度的行為、形體及臟器改變，包括反應(yīng)遲緩、脫毛、腹水，以及脾臟腫大(圖1)等。

2.2 細(xì)胞融合反應(yīng) 融合第3天起成批SP2/0細(xì)胞逐漸縮小，核固縮、碎裂，進(jìn)而凋亡；巨噬細(xì)胞(小鼠腹腔細(xì)胞)開始增生、肥大，吞噬周圍細(xì)胞碎片及雜物。1周左右，單個(gè)SP2/0細(xì)胞或小鼠脾細(xì)胞大量死亡，鏡下可見一種圓形、核較大、成團(tuán)生長的細(xì)胞(圖2)，即為雜交瘤細(xì)胞，并不斷分裂、增殖。

2.3 抗體檢測(cè)

2.3.1 直接凝集試驗(yàn) 免疫小鼠血清與TM黑素顆粒自然聚集(圖3)，正常小鼠則均勻分散，并未見凝集現(xiàn)象(圖4)。免疫小鼠的腹水和雜交瘤細(xì)胞上清也得出相同結(jié)論。另外，選取兩例臨床TSM患者血清與TM黑素顆粒反應(yīng)，亦出現(xiàn)凝集現(xiàn)象。

2.3.2 間接ELISA法 添加顯色劑TMB后，肉眼可見免疫小鼠腹水、血清以及細(xì)胞培養(yǎng)上清液所在孔的顏色較正常小鼠和空白組而言，明顯加深。酶標(biāo)儀內(nèi)測(cè)得450 nm處的OD值依次為1.635±0.085、1.820±0.249、0.671±0.142。

圖1 免疫小鼠脾臟腫大 圖2 融合反應(yīng)第7天鏡下觀(×200) 圖3 直接凝集反應(yīng)(×100) 圖4 直接凝集反應(yīng)(×100，正常小鼠)

3 討論

TM主要侵犯人體的單核巨噬系統(tǒng)，可致發(fā)熱、消瘦、貧血、肝脾腫大、肺部感染、淋巴結(jié)腫大、關(guān)節(jié)疼痛、皮疹等臨床表現(xiàn)，常缺乏特異性，極易誤診、漏診[6]。目前確診TSM的重要手段為真菌培養(yǎng)或病理檢查，但真菌培養(yǎng)周期長且陽性率低，而病理診斷易與其它細(xì)胞內(nèi)病原真菌相混淆。當(dāng)今，單抗技術(shù)早已廣泛運(yùn)用于真菌學(xué)領(lǐng)域，但尚無一種快速、高效、特異性強(qiáng)的方法來檢測(cè)TM抗原。Chaiyaroj等[7]制備了兩株TM單抗經(jīng)ELISA法來檢測(cè)TM感染，其敏感性、特異性和準(zhǔn)確性分別是92.45%，97.5%，96.59%。Panichakul等[8]用單抗8C3克隆株經(jīng)ELISA夾心法檢測(cè)臨床TM感染患者血液及尿液中的抗原，發(fā)現(xiàn)有較高敏感性和特異性。

本實(shí)驗(yàn)在3個(gè)月內(nèi)用TM黑素對(duì)BALB/c小鼠多次免疫接種，觀察發(fā)現(xiàn)，免疫小鼠有不同程度的形體和行為變化，如脫毛、腹部膨隆、行走緩慢、嗜睡等，解剖后見腹腔內(nèi)彌漫性腹水，實(shí)質(zhì)性和空腔臟器腫大，包膜增厚及系膜纖維結(jié)締組織增生、黏連，以脾臟為重。初步說明TM黑素具有較強(qiáng)的免疫原性，能刺激小鼠產(chǎn)生強(qiáng)烈的免疫應(yīng)答。當(dāng)TM黑素量為100 μg時(shí)，小鼠就已存在以上反應(yīng)，當(dāng)增至500 μg時(shí)也未加重或死亡，證明TM黑素在這個(gè)區(qū)間尚不具備致死性。另外，有學(xué)者采用小鼠脾臟內(nèi)注射免疫，可縮短免疫接種周期，節(jié)省了時(shí)間、人力、物力，但注射難度大。

經(jīng)融合反應(yīng)，在選擇性培養(yǎng)基里有一類細(xì)胞存活下來，通過凝集試驗(yàn)、ELISA法對(duì)其培養(yǎng)上清液進(jìn)行檢測(cè)，部分孔出現(xiàn)凝集現(xiàn)象或OD升高的情況，由此證明雜交瘤細(xì)胞形成可能。收集陽性孔的瘤細(xì)胞擴(kuò)大化培養(yǎng)，注射到正常小鼠腹腔，抽取腹水后檢測(cè)，亦得出相似結(jié)論。這與Nosanchuk等[9]利用新型隱球菌黑素制備單抗時(shí)基本一致。

研究表明，黑素有保護(hù)菌體免受宿主巨噬細(xì)胞吞噬及氧化殺傷的作用，感染后可引起宿主強(qiáng)烈的免疫應(yīng)答。Rosas等[10]給感染新型隱球菌的小鼠注射抗黑素單抗，發(fā)現(xiàn)能減輕被感染小鼠菌負(fù)荷量，且延長了被感染小鼠的生存時(shí)間。接下來，實(shí)驗(yàn)組會(huì)利用TM黑素抗體來檢測(cè)臨床TSM患者治療前后的血清中抗體滴度的變化，了解其是否可以作為評(píng)判TSM預(yù)后的標(biāo)準(zhǔn)之一，另將通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)來探索TM黑素抗體能否增強(qiáng)小鼠對(duì)TM感染的抵抗力。本次實(shí)驗(yàn)雖然獲取了雜交瘤細(xì)胞，證明了TM黑素的免疫原性，但檢測(cè)時(shí)發(fā)現(xiàn)其陽性反應(yīng)靈敏度不甚理想，有待更進(jìn)一步的摸索與驗(yàn)證。我們將TM黑素與臨床隱球菌感染患者血清進(jìn)行凝集試驗(yàn)，并未出現(xiàn)明顯凝集現(xiàn)象，提示TM黑素可能具有一定特異性。毋庸置疑的是，TM黑素抗體的應(yīng)用研究對(duì)臨床工作具有極為重要的理論價(jià)值和實(shí)用價(jià)值，對(duì)TSM診斷和治療有指導(dǎo)意義。