李正海， 劉 芳， 黃 玨， 薛文良， 錢競芳

(1. 東華大學(xué) 紡織面料技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 上海 201620； 2. 佛山中紡聯(lián)檢驗(yàn)技術(shù)服務(wù)有限公司，廣東 佛山 528000； 3. 中華人民共和國上海海關(guān)， 上海 200120)

雙酚A(BPA)在紡織服裝生產(chǎn)過程中常充當(dāng)顯色劑，被廣泛應(yīng)用于變色功能紡織品的熱敏變色印花上[1]，但BPA是一種環(huán)境激素，在長期與皮膚密切接觸時(shí)可導(dǎo)致人體內(nèi)分泌失調(diào)，致使生殖功能下降，并且對胚胎具有一定的致畸性和毒性，存在誘發(fā)體內(nèi)細(xì)胞癌變的風(fēng)險(xiǎn)[2]。在經(jīng)濟(jì)全球化的時(shí)代背景下，進(jìn)出口服裝的質(zhì)量安全問題也備受各個(gè)國家的關(guān)注。加拿大是世界上首個(gè)將BPA列為有毒化學(xué)物質(zhì)的國家，宣布將控制BPA 的使用[3]。

表面等離子體共振(SPR)現(xiàn)象是一種基于折射率變化的物理光學(xué)現(xiàn)象[4]。當(dāng)偏振光入射角超過臨界角時(shí)會發(fā)生全反射，在金屬膜中產(chǎn)生消逝波，偏振光被耦合入表面等離子體內(nèi)，界面上的等離子體就會與消逝波發(fā)生共振，即SPR原理[5-6]。SPR技術(shù)由于檢測過程方便快捷、無需精度提純、特異性識別度高、可實(shí)時(shí)監(jiān)測等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)在醫(yī)學(xué)診斷、化學(xué)檢測、生物技術(shù)、食品安全等眾多領(lǐng)域得到了應(yīng)用，并且正逐漸地向消費(fèi)品檢測領(lǐng)域擴(kuò)展。在使用SPR技術(shù)直接檢測時(shí)，通常只有相對分子質(zhì)量高于2 000的物質(zhì)產(chǎn)生的共振才能得到相對顯著的SPR信號。但雙酚A相對分子質(zhì)量很小，僅為228，且紡織品中雙酚A的含量相對較低，直接采用SPR技術(shù)檢測低濃度的雙酚A幾乎難以得到響應(yīng)信號，因此需要對傳感器芯片進(jìn)行修飾以得到放大信號來實(shí)現(xiàn)高靈敏度檢測。

目前傳感器芯片常用的修飾方法有直接吸附法、金屬螯合法、共價(jià)偶聯(lián)法、親和素-生物素結(jié)合法等[7]。在對紡織品中BPA的檢測研究中，可利用BPA-琥珀酰亞胺酯和BPA-卵清蛋白偶聯(lián)物來對傳感器芯片進(jìn)行電修飾，但該方法檢測過程復(fù)雜，偶聯(lián)物修飾不穩(wěn)定，檢出限低[8]。此外，有研究者分別利用TiO2/Au 復(fù)合膜酪氨酸酶和卡那霉素分子印跡技術(shù)等方式對芯片表面進(jìn)行預(yù)處理，但該方法對納米TiO2材料、交聯(lián)劑和引發(fā)劑的要求較高，使得檢測成本過高[9-10]。本文利用BPA-牛血清蛋白抗原(BPA-BSA)與雙酚A抗體的特異性結(jié)合原理，采用SPR技術(shù)競爭法檢測紡織品中的雙酚A，以探索芯片在檢測前期進(jìn)行BPA-BSA的修飾方法及最佳修飾條件。

1 競爭法檢測雙酚A原理

用SPR進(jìn)行小分子物質(zhì)競爭檢測時(shí)存在圖1所示的2種不同方式來提高信號的強(qiáng)度：一種是2個(gè)待測物競爭傳感器表面的同一抗原，即表面競爭；另一種是待測物和傳感片上固定的物質(zhì)競爭溶液中的抗原，即溶液競爭[11]。

圖1 SPR競爭法的2種方式Fig.1 SPR competition in two ways

將具有特異性吸附屬性的生物蛋白抗原通過一定的技術(shù)固定于金屬膜表面后，依據(jù)反應(yīng)的響應(yīng)程度來判斷溶液中被分析物與該抗原的結(jié)合的動力學(xué)過程[12]。當(dāng)目標(biāo)物流過經(jīng)固定抗原后的金膜表面時(shí)，便可與抗原產(chǎn)生特異性結(jié)合，從而共振使反射光譜發(fā)生變化，將結(jié)合物分子量的變化以光學(xué)信號的形式反映出來，實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)傳感檢測；因此，作為實(shí)驗(yàn)第1步芯片的表面修飾就顯得極其重要。本文將探索在溶液競爭法檢測紡織品中BPA過程中傳感芯片的選擇、修飾和抗原固定的最佳實(shí)驗(yàn)條件。經(jīng)修飾后的芯片可與抗原進(jìn)行共價(jià)鍵結(jié)合，有效消除抗原的非特異性吸附，從而很大程度上提高了SPR分析靈敏度。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 實(shí)驗(yàn)儀器

H-SPR表面等離子體共振儀。

傳感芯片：羧甲基葡聚糖組裝(CM5) 芯片、裸金芯片(Au)。

2.2 實(shí)驗(yàn)溶液的配制

2.2.1芯片修飾溶液

2-嗎啉乙磺酸(MES)溶液：質(zhì)量濃度為0.009 76 g/mL，pH值為6.0。

1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽(EDC)溶液：質(zhì)量濃度為0.003 875 g/mL，溶劑為MES溶液。

N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)溶液：質(zhì)量濃度為0.004 34 g/mL，溶劑為MES溶液。

乙醇胺-鹽酸溶液：濃度為1 mol/L，pH值為8.5。

11-巰基十一烷酸(11-MUA)的乙醇溶液：質(zhì)量濃度為0.00 109 g/mL，溶劑為無水乙醇。

2.2.2測試溶液

醋酸鹽緩沖液：取4.9 mL濃度為0.2 mol/L的醋酸鈉溶液和5.1 mL濃度為0.2 mol/L的醋酸溶液進(jìn)行混合，用三級水和氫氧化鈉溶液將混合溶液濃度調(diào)至0.01 mol/L，pH值為4.5。

雙酚A-牛血清白蛋白(BPA-BSA)溶液：將購買的BPA-BSA原溶液用醋酸鹽緩沖液稀釋至100 μg/mL，備用。

2.3 實(shí)驗(yàn)步驟

2.3.1芯片修飾原理

本文實(shí)驗(yàn)分別使用裸芯片(Au)和具有一層羧甲基葡聚糖修飾CM5芯片。由于裸芯片表面沒有羧甲基葡聚糖，故需對其表面進(jìn)行羧化。羧化后的裸芯片和CM5芯片一樣具有羧甲基葡聚糖，待測物的BSA偶聯(lián)物會因共價(jià)鍵的極性作用與葡聚糖表面進(jìn)行結(jié)合，如圖2所示。

圖2 芯片修飾氨基偶聯(lián)示意圖Fig.2 Schematic diagram of amino-coupling of chip modified

2.3.2裸芯片修飾步驟

1)取全新裸芯片，用1 mmol/L的11-巰基十一烷酸(11-MUA)溶液浸沒，在4 ℃條件下浸泡12 h；

2)取出裸芯片，用滅菌三級水清洗，隨后用N2吹干；

3)將芯片放入SPR儀中，通入滅菌三級水，設(shè)置流速為300 μL/min，得到穩(wěn)定基線；

4)通入EDC和NHS(體積比為1∶1)300 μL，設(shè)置流速為20 μL/min，使傳感片表面的羧基活化為酯基；

5)通入300 μL BPA-BSA偶聯(lián)物溶液(醋酸鹽溶液稀釋，pH值為4.5，濃度為0.01 mol/L)，設(shè)置流速為20 μL/min；

6)通入100 μL pH值為8.5的乙醇胺-鹽酸(MUA)溶液，設(shè)置流速為20 μL/min，封閉未反應(yīng)的活化羧基官能團(tuán)。

2.3.3CM5芯片修飾步驟

全新CM5芯片表面已修飾了羧甲基葡聚糖，存在穩(wěn)定Au—S鍵，故只需進(jìn)行2.3.2節(jié)中3)～6)步驟。

3 結(jié)果分析

3.1 不同芯片修飾后溶液測試曲線

取CM5芯片和經(jīng)羧化后的裸金芯片分別放入SPR儀，調(diào)節(jié)室溫至25 ℃，調(diào)節(jié)流池流速為20 μL/min，具體步驟如下：1)通入醋酸鹽緩沖溶液，直至基線穩(wěn)定；2)通入某一濃度的BPA-BSA偶聯(lián)物溶液(醋酸鹽溶液稀釋，pH為4.5)300 μL，設(shè)置流速為20 μL/min；3)通入醋酸鹽緩沖溶液5 min清洗芯片。該反應(yīng)采用國際單位RU來衡量：1 RU=1 pg蛋白/mm2=1×10-6RIU(折射指數(shù)單位)。圖3示出質(zhì)量濃度為40 μg/ mL的BPA-BSA溶液的吸附響應(yīng)曲線。由于BPA-BSA溶液的濃度不同，使得在芯片上與酯基反應(yīng)的氨基數(shù)量也不同，引起的RU響應(yīng)值也不同(②段和①段RU的差值)。

①段為通入緩沖液基線穩(wěn)定階段；②段為通入的BPA-BSA偶聯(lián)物溶液反應(yīng)階段；③段為通入醋酸鹽緩沖溶液清洗階段。圖3 2種修飾后芯片的BPA-BSA溶液測試曲線Fig.3 Test diagram of BPA-BSA solution of two modified chips

由圖3可知，CM5芯片由于自身金膜上已修飾羧甲基葡聚糖，故而在反應(yīng)中，曲線穩(wěn)定，響應(yīng)值明顯。裸芯片經(jīng)11-巰基十一烷酸(MUA)修飾后，表面雖覆有羧甲基葡聚糖，但在同樣的反應(yīng)條件下，所得曲線不太穩(wěn)定，存在上下浮動。故在對芯片進(jìn)行修飾時(shí)，CM5芯片比裸芯片更為穩(wěn)定，為保證后續(xù)實(shí)驗(yàn)數(shù)值的穩(wěn)定性，將選用CM5芯片進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作。

3.2 不同pH值緩沖液的溶液測試曲線

將BPA-BSA固定在CM5型傳感片上時(shí)，還需考察靜電吸附等因素。BSA的等電點(diǎn)是4.9，而通常溶液的pH值在3.0～4.9之間時(shí)，最有利于BPA-BSA的吸附。本文實(shí)驗(yàn)中考察了pH值在3.5～6.0之間時(shí)，BSA在CM5傳感片上的靜電吸附行為。用醋酸和NaOH調(diào)節(jié)偶聯(lián)物溶液的pH值，以0.5為pH值梯度分別配制pH值為6.0、5.5、5.0、4.5、4.0、3.5的BPA-BSA溶液。使用全新的CM5芯片，通入25 μL醋酸鹽緩沖液來獲取實(shí)驗(yàn)基線，設(shè)置流速為5 μL/min，再依次通入上述pH值的BSA-BSA溶液樣品各2 min，響應(yīng)曲線如圖4所示。

圖4 不同pH值抗原溶液固定響應(yīng)圖Fig.4 Response diagram of antigen solution at different pH values

由圖4可知：由于pH值為6.0、5.5時(shí)，高于BSA的等電點(diǎn)，使得BSA帶負(fù)電，所以吸附作用極弱；而在pH值為5.0時(shí)，BSA略帶負(fù)電，但仍然能在CM5傳感片上有較強(qiáng)的吸附行為(RU響應(yīng)增加)；當(dāng)pH值為4.5時(shí)，吸附量達(dá)到最大。通?？刹扇〗档腿芤簆H值的方法來增強(qiáng)靜電吸附，因此，選取固定BSA溶液的pH值為4.5。

3.3 不同離子強(qiáng)度緩沖液的溶液測試曲線

醋酸鈉緩沖液在實(shí)驗(yàn)中不僅能為BSA提供酸性環(huán)境，還能最大限度地激發(fā)抗原的活性，使特異性結(jié)合得更加牢固。本文實(shí)驗(yàn)使用的BPA-BSA醋酸鈉溶液的質(zhì)量濃度為27.22 g/L，pH值為4.5，再用NaCl溶液調(diào)節(jié)離子濃度分別為100、50、10 mmol/L的BPA-BSA溶液。使用全新的CM5芯片，通入100 μL三級水來獲取實(shí)驗(yàn)基線，設(shè)置流速為20 μL/min，再分別通入不同離子濃度的偶聯(lián)物樣品，響應(yīng)圖如圖5所示。

圖5 不同離子濃度抗原溶液固定響應(yīng)圖Fig.5 Response diagram of antigen solution at different ion concentrations

由圖5可看出：當(dāng)離子強(qiáng)度分別為100、50、10 mmol/L的BPA-BSA溶液通入流池后，結(jié)合量的響應(yīng)值分別為25、35、102 RU；隨著離子濃度的降低，吸附響應(yīng)值越明顯，當(dāng)離子濃度為10 mmol/L時(shí)，吸附效果最好。

3.4 不同濃度BPA-BSA的吸附響應(yīng)曲線

為了使抗原蛋白能在最大程度上固定到芯片傳感器表面，本文對不同濃度的BPA-BSA進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)。選取前述最佳離子濃度為10 mmol/L、最佳pH值為4.5的醋酸鹽緩沖溶液，配制質(zhì)量濃度分別為20、30、40、50、60、70、80 μg/ mL的BPA-BSA偶聯(lián)物溶液。使用全新的CM5芯片，通入100 μL醋酸鹽緩沖液來獲取實(shí)驗(yàn)基線，設(shè)置流速為20 μL/min，隨后依次通入上述不同濃度的BPA-BSA偶聯(lián)物樣品各5 min，響應(yīng)圖如圖6所示。

圖6 不同濃度的BPA-BSA溶液對應(yīng)的相對響應(yīng)圖Fig.6 Response diagram of BPA- BSA solution at different concentrations

由圖6可知：當(dāng)BPA-BSA溶液的質(zhì)量濃度低于30 μg/ mL時(shí)，相對響應(yīng)值隨著質(zhì)量濃度的增加而不斷增大；當(dāng)BPA-BSA溶液的質(zhì)量濃度在30～50 μg/mL之間時(shí)，相對響應(yīng)增勢放緩；當(dāng)BPA-BSA溶液的質(zhì)量濃度大于50 μg/ mL時(shí)，相對響應(yīng)幾乎不再變化，只在一定的范圍內(nèi)波動。故BPA-BSA溶液的最佳質(zhì)量濃度可確定為50 μg/ mL。

4 結(jié)束語

本文建立了紡織品中雙酚A溶液競爭法檢測前芯片的氨基偶聯(lián)預(yù)處理方法。該方法與傳統(tǒng)的雙酚A檢測前處理方法相比，特異性識別度高，避免了其他雜質(zhì)對實(shí)驗(yàn)的影響，可在紡織品雙酚A檢測前處理中予以應(yīng)用。

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