王縛鯤，冉向陽，陳 晶，程 琰，王廷廷，王憲靈，賀政新

隨著各種侵入性醫(yī)療操作、免疫抑制劑和廣譜抗生素在臨床工作中的廣泛應(yīng)用，這些治療手段在緩解患者病痛的同時(shí)，也使其面臨侵襲性念珠菌病(IC)的威脅[1-2]；近年來，IC病發(fā)病率不斷攀升[3]，嚴(yán)重威脅了患者的生命，帶來了沉重的醫(yī)療負(fù)擔(dān)。早診斷、早治療是提高IC病治愈率的關(guān)鍵。IC缺乏特異的癥狀和體征，與一般細(xì)菌感染鑒別困難，故目前對(duì)該病的診斷依賴于實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)技術(shù)依然是IC診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，但因該方法敏感性低、檢測(cè)周期長(zhǎng)，無法滿足臨床需求[4]。開發(fā)快速有效的臨床血清學(xué)檢測(cè)診斷技術(shù)是解決這一困擾的有效途徑，念珠菌烯醇化酶是其中重要的靶標(biāo)分子。

烯醇化酶(Eno)在多種生物細(xì)胞中保守表達(dá)，催化2-磷酸甘油酸與磷酸烯醇式丙酮酸之間的相互轉(zhuǎn)化，在糖酵解過程中起關(guān)鍵作用[5]。多項(xiàng)研究證實(shí)，Eno是一種念珠菌免疫優(yōu)勢(shì)蛋白，在念珠菌侵染宿主過程中可引發(fā)宿主產(chǎn)生高滴度的IgG型抗體，檢測(cè)念珠菌Eno IgG抗體在診斷IC時(shí)具有重要價(jià)值[6-7]。Li等[8]認(rèn)為檢測(cè)抗Eno IgG抗體可有效區(qū)分念珠菌侵襲感染、定植和細(xì)菌感染。在前期構(gòu)建表達(dá)了白色念珠菌Eno重組蛋白的基礎(chǔ)上[9]。本研究擬建立檢測(cè)抗念珠菌烯醇化酶IgG抗體免疫膠體金方法，旨在為IC實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)提供更多探索?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)試劑盒儀器 牛血清白蛋白(BSA)、氯金酸、檸檬酸三鈉購自美國Sigma公司；重組Eno蛋白由本實(shí)驗(yàn)室研制[8]；小鼠抗人IgG單克隆抗體、羊抗小鼠IgG多克隆抗體購自河北博海生物公司；硝酸纖維素膜、聚酯膜、濾紙購自美國Millipore公司；HKCB-3型恒溫磁力攪拌器購自溫州醫(yī)療電器廠，RD-20Ⅲ型低溫高速離心機(jī)購自日本Seiko公司，BP110S型電子天平購自北京Startious公司，XYZ噴金點(diǎn)膜系統(tǒng)購自美國BIO DOT公司。

1.2研究對(duì)象和血清 根據(jù)歐洲癌癥/真菌病研究與治療組織(EORTC/MSG)建立的侵襲性真菌病診斷標(biāo)準(zhǔn)[10]，選取2011年1月—2014年12月解放軍白求恩國際和平醫(yī)院實(shí)驗(yàn)組確診念珠菌血流感染38例為感染組和健康體檢者血清50例為對(duì)照組。感染組男25例，女13例；年齡(58.6±20.2)歲。對(duì)照組男32例，女8例；年齡(60.1±18.6)歲。2組性別、年齡比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)具有可比性。感染組基礎(chǔ)疾?。喊籽?例，惡性腫瘤6例，燒傷13例，呼吸衰竭6例，腹部疾病7例，其他3例；感染組危險(xiǎn)因素：應(yīng)用廣譜抗生素22例，應(yīng)用免疫抑制劑11例，中性靜脈置管7例，腸外營(yíng)養(yǎng)8例，腹腔手術(shù)9例，重癥監(jiān)護(hù)病房治療20例，中性粒細(xì)胞缺乏4例，急性腎功能衰竭2例。感染組血液標(biāo)本共分離出38株念珠菌病原：白色念珠菌17株，熱帶念珠菌7株，近平滑念珠菌6株，光滑念珠菌4株，克柔念珠菌和葡萄牙念珠菌各2株。感染組在血培養(yǎng)出現(xiàn)陽性時(shí)72 h內(nèi)收集(盡可能接近培養(yǎng)標(biāo)本送檢日期)血清，將其凍存于-80℃冰箱，于檢測(cè)前取出使用。

1.3膠體金免疫層析試劑的制備和組裝

1.3.1膠體金標(biāo)記抗體的制備： 膠體金溶液采用檸檬酸三鈉還原法制備。于100 ml終濃度為0.01%的沸騰氯金酸中加入1.5 ml的1%檸檬酸三鈉溶液，反應(yīng)穩(wěn)定后溶液至亮紅色，經(jīng)濾膜過濾，重新定容至原體積。以透射電鏡和紫外-可見光光譜觀察確定，金顆粒的直徑約為30 nm。按2 μl/ml 比例加入0.2 mol/L 的碳酸鉀溶液至金溶液中，混勻后按8 μg/ml的比例加入1.0 mg/ml的小鼠抗人IgG逐滴加入，邊加邊攪拌，混勻后靜置，4 ℃過夜；加入BSA至終濃度為10 g/L，繼續(xù)攪拌20 min，4 ℃靜置4 h取出，4 ℃ 10 000/min離心20 min。棄上清液，加入10%原溶液體積的復(fù)溶液(0.01 mol/L TRIS，5%蔗糖，1%海藻糖, pH 8.5)。

1.3.2金標(biāo)墊的制作：將BIO DOT點(diǎn)膜系統(tǒng)設(shè)置包被量為10 μl/cm，將上述制備的金標(biāo)液噴涂于奧斯龍9864玻璃纖維上，寬度為5 mm，長(zhǎng)度為30 cm。噴金后放入烘箱37℃烘干。

1.3.3硝酸纖維素膜的包被：重組Eno蛋白和羊抗小鼠IgG多克隆抗體用0.01 mol/L的pH 7.53磷酸鹽緩沖液稀釋。為確定捕獲用的重組Eno蛋白最佳包被量，Eno在預(yù)實(shí)驗(yàn)中分別稀釋至0.5，1.0，1.5和2.0 mg/ml。羊抗小鼠IgG稀釋至1.0 mg/ml。繼而，用BIO DOT點(diǎn)膜系統(tǒng)將其分別包被在硝酸纖維素膜上，包被量為1 μl/cm，置37℃烘箱烘干。

1.3.4檢測(cè)試紙條的組裝：將包被的硝酸纖維素膜，金標(biāo)墊，樣本墊，吸水墊等依次貼合于PVC背板上，此按5 mm/條的寬度將其切割分裝于塑料外殼中，干燥密封后室溫保存?zhèn)溆谩?見圖1。)

圖1免疫膠體金層析試紙組裝示意圖

1.3.5試紙檢測(cè)原理及方法：檢測(cè)時(shí)，將待檢血清滴加于樣本墊上，15 min左右讀取結(jié)果。含抗念珠菌Eno IgG的陽性血清樣本滴加于樣本墊上，向吸水墊方向流動(dòng)?？笶no與金標(biāo)墊上的小鼠抗人IgG結(jié)合后被硝酸纖維素膜上包被的重組Eno蛋白捕獲，形成重組Eno-抗Eno IgG-小鼠抗人IgG復(fù)合物沉淀于檢測(cè)線處，呈肉眼可見的紅色。未結(jié)合的小鼠抗人IgG繼續(xù)向前流動(dòng)，被質(zhì)控線處的羊抗小鼠IgG捕獲形成小鼠抗人IgG-羊抗小鼠IgG復(fù)合物，沉淀于質(zhì)控線處，呈肉眼可見的紅色。不含抗念珠菌Eno IgG的陰性血清在檢測(cè)線處無沉淀形成，僅質(zhì)控線呈紅色。讀取結(jié)果時(shí)，陽性標(biāo)本在檢測(cè)線和質(zhì)控線處可見兩條紅線，而陰性標(biāo)本僅形成質(zhì)控線一條紅線。見圖2。

圖2 免疫膠體金檢測(cè)試紙?jiān)硎疽鈭D

1.4臨床樣本檢測(cè) 將2組收集的血清50 μl滴加于樣本墊上，15 min后讀取結(jié)果。以血培養(yǎng)結(jié)果作為金標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算免疫膠體金法檢測(cè)的靈敏度、特異性、陽性預(yù)測(cè)值(PPV)和陰性預(yù)測(cè)值(NPV)。PPV=真陽性/(真陽性+假陽性)，NPV=真陰性/(真陰性+假陰性)。

2 結(jié)果

2.1確認(rèn)最佳重組Eno包被量 用4個(gè)濃度的重組Eno包被試紙分別檢測(cè)陽性和陰性血清，計(jì)算約登指數(shù)，綜合考慮靈敏度和特異性之間的平衡，確認(rèn)約登指數(shù)最高的包被濃度1.0 mg/ml作為最佳包被濃度。見表2。

表2 不同濃度重組Eno包被的膠體金試紙檢測(cè)效能

*約登指數(shù)J(t)=靈敏度+特異性-1

2.2試紙檢測(cè)臨床樣本結(jié)果 感染組38例IC血清共檢出27例陽性：白色念珠菌11例(11/17)，熱帶念珠菌5例(5/7)，近平滑念珠菌5例(5/6)，光滑念珠菌3例(3/4)，葡萄牙念珠菌2例(2/2)和克柔念珠菌1例(1/2)。對(duì)照組50例無感染者血清，弱陽性2例。由此計(jì)算該試紙用于檢測(cè)念珠菌血流感染的靈敏度為71.1%、特異性為96.0%、PPV為93.1%和NPV為83.4%。

3 討論

IC的早期快速診斷技術(shù)是研究的熱點(diǎn)與難點(diǎn)之一，免疫膠體金層析技術(shù)不需要特殊的儀器與場(chǎng)地，操作簡(jiǎn)便，在感染性疾病診斷中被廣泛應(yīng)用[11-13]。本研究制備了一種可以檢測(cè)患者血清中抗念珠菌Eno IgG型抗體的免疫膠體金層析試紙，已應(yīng)用于IC的診斷。該試紙以重組的Eno蛋白包被于硝酸纖維素膜上，與金標(biāo)墊上包被的金標(biāo)小鼠抗人IgG單克隆抗體配對(duì)，檢測(cè)人血清中的抗Eno IgG抗體。硝酸纖維素膜上重組Eno的包被量對(duì)試紙的檢測(cè)效能有最直接的影響，過高可能導(dǎo)致假陽性，過低則可能導(dǎo)致假陰性。本研究確認(rèn)最佳包被濃度為1.0 mg/ml(噴膜1 μl/cm)。

白色念珠菌Eno蛋白存在于念珠菌細(xì)胞壁[14]，檢測(cè)該蛋白的相應(yīng)抗體可用來診斷IC病[7-8]。本實(shí)驗(yàn)組在前期研究中制備了重組Eno蛋白[9]，并利用小鼠模型證實(shí)了Eno是一種免疫優(yōu)勢(shì)蛋白[15]，應(yīng)用價(jià)值好。本研究中制備的免疫膠體金層析試紙檢測(cè)念珠菌血流感染的靈敏度、特異性、PPV和NPV分別為71.1%、96.0%、93.1%和83.4%。與ELISA實(shí)驗(yàn)相比，對(duì)于IC，膠體金法有更高的PPV值和特異性，能在早期篩查性實(shí)驗(yàn)中更可靠地發(fā)現(xiàn)CI患者。Clancy等[16]用白色念珠菌Eno可檢測(cè)不同IC患者血清中的抗Eno抗體，與本研究結(jié)論一致。用重組白色念珠菌Eno制備的膠體金試紙可成功的檢測(cè)多種念珠菌(白色念珠菌、熱帶念珠菌、近平滑念珠菌、光滑念珠菌、葡萄牙念珠菌和克柔念珠菌)感染者血清中的抗Eno抗體。

當(dāng)前有多種實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)如ELISA[17]，PCR[18]，β-葡聚糖檢測(cè)[19]等被研究應(yīng)用于IC的實(shí)驗(yàn)室診斷，特別是葡聚糖檢測(cè)法已經(jīng)商品化并在臨床得到了推廣。這些技術(shù)普遍需要較長(zhǎng)的檢測(cè)時(shí)間和較為復(fù)雜的技術(shù)手段。本研究制備的膠體金檢測(cè)試紙可以在15 min內(nèi)對(duì)念珠菌抗Eno IgG型抗體作出檢測(cè)，用于診斷IC，方法簡(jiǎn)便易行，適合在基層醫(yī)療單位和野外特殊條件下使用。