王麗暉，吳廣禮，劉青娟，林 靜，楊新軍，汪晶華

近年來(lái)，糖尿病腎病(DN)已成為終末期腎功能衰竭的首要致病因素，其發(fā)病機(jī)制是多因素綜合作用的結(jié)果。高糖狀態(tài)下腎臟血流動(dòng)力學(xué)紊亂，炎癥反應(yīng)、糖基化終末產(chǎn)物作用、細(xì)胞增殖和凋亡等參與了DN的發(fā)生發(fā)展[1]，引起腎臟細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路激活，使其組織機(jī)構(gòu)和功能發(fā)生變化導(dǎo)致腎損傷[2]。p38絲裂原活化蛋白激酶 (p38 MAPK)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在高血糖狀態(tài)下被激活，使多種核轉(zhuǎn)錄因子活化，影響目的基因的表達(dá)[3]。絲裂原激活蛋白激酶磷酸酶-1(MKP-1)作為MAPK信號(hào)途徑的副調(diào)控因子，可使MAPK上的絲/蘇氨酸和酪氨酸去磷酸化而使MAPK失活，發(fā)揮一定的生物學(xué)效應(yīng)[4]。羥甲基戊二酰(HMG-CoA)還原酶抑制劑氟伐他汀作為常用的降脂藥物，有非依賴降脂的腎臟保護(hù)作用[5]，可降低DN的尿蛋白，延緩慢性腎功能損害等[6]。氟伐他汀是否通過(guò)影響MKP-1表達(dá)干擾相應(yīng)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路尤其是p38 MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活，對(duì)DM腎組織起保護(hù)作用，目前尚無(wú)確切報(bào)道。本研究應(yīng)用DM大鼠模型，觀察了氟伐他汀對(duì)其腎功能、MKP-1和p38 MAPK的作用，以探討其對(duì)腎臟的保護(hù)機(jī)制?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)雄性Wistar大鼠60只，河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：1607934 。1～12周齡，體重120～150 g，性周期4～5 d。飼養(yǎng)條件：按性周期一致性原則，每3只合并一籠，室溫21～22℃，濕度67%～75%，光照比例1∶1。

1.2實(shí)驗(yàn)儀器和試劑 氟伐他汀鈉粉劑(北京諾華制藥有限公司制藥有限公司)；鏈脲佐菌素(STZ，美國(guó)sigma公司)；兔抗大鼠MKP-1和鼠抗p-p38 MAPK 購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz 公司；兔抗大鼠纖維粘連蛋白(Laminin，LN)和小鼠抗大鼠纖維粘連蛋白(Fibronectin，F(xiàn)N)均購(gòu)自美國(guó)Neomarker 公司；免疫組化試劑盒(北京中山生物技術(shù)有限責(zé)任公司)；考馬斯亮藍(lán)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所；聚偏二氟乙烯膜(PVDF)購(gòu)自美國(guó)merckmillipor公司；Trizol購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；RT-PCR試劑為美國(guó)Promega公司；其他試劑均為分析純。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1大鼠模型構(gòu)建：按65 mg/kg腹腔單劑量注射STZ(溶于0.1 mol/L枸櫞酸緩沖液， pH=4.5)建立糖尿病模型，48 h后大鼠尾尖取血測(cè)血糖，取尿測(cè)尿糖。血糖≥16.7 mmol/L，尿糖+++～++++者為建模成功。建模成功的糖尿病大鼠隨機(jī)分為糖尿病組和氟伐他汀組，每組10只；另取10只大鼠為對(duì)照組注射相同體積的枸櫞酸緩沖液。氟伐他汀組給予氟伐他汀20 mg/kg，灌胃，1/d，連續(xù)給藥28 d。糖尿病組和對(duì)照組給予灌入等量生理鹽水。實(shí)驗(yàn)觀察期間動(dòng)物自由進(jìn)食飲水，不使用降糖藥物。

1.3.2腎組織標(biāo)本收集：于成模后的第4周處死大鼠。處死前1 d用代謝籠收集大鼠24 h尿液，測(cè)定尿蛋白(Upro)。處死大鼠時(shí)股動(dòng)脈取血，分離血清用于測(cè)定血糖(Glu)、肌酐(SCr)、尿素(BUN)；切取腎臟，去掉被膜，濾紙吸干血跡后稱重，留取部分腎組織迅速置于-70℃液氮中提取RNA和蛋白質(zhì)，留作RT-PCR和Western實(shí)驗(yàn)檢測(cè)；部分置于新鮮配制的4%多聚甲醛溶液(0.01 mol/L的 PBS配制)進(jìn)行固定，留作常規(guī)腎臟病理和免疫組化檢測(cè)。

1.3.3免疫組化檢測(cè)MKP-1和磷酸化p38 MAPK(p-p38 MAPK)在腎皮質(zhì)的表達(dá)：采用SP法，切片厚4 μm，常規(guī)脫蠟水化，一抗為兔抗鼠MKP-1多克隆抗體和鼠抗p-p38 MAPK單克隆抗體(1∶100稀釋)，二抗為生物素化羊抗兔或鼠IgG(1∶100稀釋)，以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照，DAB顯色，光鏡觀察陽(yáng)性信號(hào)，陽(yáng)性部位呈棕黃色。免疫組化結(jié)果應(yīng)用HPIAS-1000高清晰度彩色病理圖文分析系統(tǒng)進(jìn)行分析，MKP-1和磷酸化p38 MAPK均為胞核著色，免疫組化結(jié)果的判定應(yīng)用每個(gè)腎小球視野內(nèi)免疫組化結(jié)果陽(yáng)性的胞核細(xì)胞數(shù)與所有腎小球細(xì)胞數(shù)之比。每組分析6個(gè)標(biāo)本，每個(gè)標(biāo)本切片取10個(gè)完整的腎小球進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。10個(gè)腎小球陽(yáng)性百分比代表一只大鼠的某個(gè)檢測(cè)指標(biāo)在腎小球中的表達(dá)，以積分光密度(IOD)表示其表達(dá)強(qiáng)度。

1.3.4Western blotting檢測(cè)腎皮質(zhì)細(xì)胞MKP-1和p38 MAPK的活性：取-70℃保存的腎皮質(zhì)約100 mg，加入預(yù)冷的蛋白裂解液0.5 ml。取100 μg蛋白加入上樣緩沖液后用12%SDS-聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳，轉(zhuǎn)PVDF膜，分別加入MKP-1和p-p38 MAPK抗體(1∶100)，4℃ 冰箱過(guò)夜。再度洗膜后加入1∶2500稀釋的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗， 37℃，2 h。洗膜后加增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光(ECL, Santa Cruz公司) 試劑,將PVDF 膜放入X 光片暗盒，壓片、顯影、定影。用美國(guó)Kodak公司1D 數(shù)碼成像分析系統(tǒng)軟件對(duì)Western條帶進(jìn)行相對(duì)定量分析。

1.3.5RT-PCR檢測(cè)腎皮質(zhì)MKP-1 mRNA的表達(dá)：采用Trizol提取腎皮質(zhì)RNA，用紫外線可見(jiàn)分光光度儀測(cè)定其純度和含量。取總RNA 2 μg作為模板，在逆轉(zhuǎn)錄酶(US)催化下合成cDNA，以適量cDNA為模板在Taq DNA聚合酶催化下進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。MKP-1及GAPDH引物均由北京奧科生物工程有限公司合成,使用的基因引物為：MKP-1上游 5'-ACAGGGCAGAAGGGAAAGGAC -3'；下游 5' -GCTGAAAGCCTGCTCTGGGTC -3' ，產(chǎn)物：263bp。GAPDH：上游5′-TATCGGACGCCTGGTTAC3′；下游5′-CTGTGCCGTTGAACTTGC3′，產(chǎn)物140bp。PCR反應(yīng)條件：94℃，5 min；95℃，1 min；退火溫度分別為55.9、54.9和56.9℃，1 min；72℃，1 min；擴(kuò)增32個(gè)循環(huán)，最后72℃，10 min。取5 μl PCR產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行觀察。應(yīng)用凝膠圖像分析系統(tǒng)(Bio Rad公司, 美國(guó))進(jìn)行吸光度掃描分析，以GAPDH 作為內(nèi)參照進(jìn)行校正, 用MKP-1基因的吸光度與GAPDH 吸光度相比代表MKP-1相對(duì)含量。

2 結(jié)果

2.1體重、腎重、腎/體質(zhì)量比的比較 第4周時(shí)，與對(duì)照組比較，氟伐他汀組和糖尿病組的體重降低，腎/體質(zhì)量比升高，且氟伐他汀組變化較糖尿病組更為明顯(P<0.01)。3組腎重比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 3組大鼠腎重、體重和腎/體重比的比較

注：與對(duì)照組比較，bP<0.01; 與糖尿病組比較，dP<0.01

2.2腎功能、血脂等生化指標(biāo)的比較 糖尿病組和氟伐他汀組4周時(shí)Glu、BUN、CHO、TG、Ccr、Upro高于對(duì)照組(P<0.01)。氟伐他汀組BUN、Ccr、Upro低于糖尿病組(P<0.01)，氟伐他汀組和糖尿病組Glu、TG、CHO比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表2。

2.3p-p38 MAPK和MKP-1蛋白表達(dá)的比較 免疫組化檢測(cè)結(jié)果顯示，MKP-1主要在內(nèi)皮細(xì)胞、臟層上皮細(xì)胞、系膜細(xì)胞、壁層上皮細(xì)胞及小管上皮細(xì)胞的胞核中表達(dá)。見(jiàn)圖1。p-p38 MAPK主要表達(dá)在腎小球系膜區(qū)、內(nèi)皮細(xì)胞及臟層上皮細(xì)胞，腎小管上皮細(xì)胞的胞核內(nèi)，偶有漿胞著色。見(jiàn)圖2。與對(duì)照組比較，造模4周后MKP-1在糖尿病組和氟伐他汀組表達(dá)減少，p-p38MAPK表達(dá)增強(qiáng)(P<0.01)。與糖尿病組比較，氟伐他汀組MKP-1表達(dá)增強(qiáng)，p-p38MAPK表達(dá)降低(P<0.01)。見(jiàn)表3、4。

表2 3組大鼠的生血化指標(biāo)和24 h尿蛋白比較

注：與對(duì)照組比較，bP<0.01;與糖尿病組比較，dP<0.01

圖1MKP-1在糖尿病組和氟伐他汀組中的表達(dá)(DAB×400) A.糖尿病組；B.氟伐他汀組

2.4腎皮質(zhì)MKP-1和p38 MAPK的活性比較 糖尿病組在4周時(shí)MKP-1表達(dá)水平較對(duì)照組下降，p38 MAPK的活性較對(duì)照組增強(qiáng)(P< 0.01)。與糖尿病組比較，氟伐他汀組MKP-1在腎組織的表達(dá)升高，而p38 MAPK的活性下降(P<0.01)。見(jiàn)圖3，表3、表4。

2.5腎皮質(zhì)MKP-1 mRNA表達(dá)的比較 糖尿病組MKP-1 mRNA 表達(dá)下調(diào)，氟伐他汀組MKP-1 mRNA 表達(dá)上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)圖4，表3、表4。

圖2 p-p38 MAPK 在2組大鼠腎組織的表達(dá)(DAB×400)

圖3MKP-1和p-p38MAPK在3組大鼠腎組織的表達(dá)

1.對(duì)照組;2.糖尿病組;3.氟伐他汀組

圖4 MKP-1 mRNA 在3組大鼠腎組織的表達(dá)

表3 免疫組化、蛋白印跡和RT-PCR檢測(cè)3組大鼠腎組織MKP-1 蛋白和mRNA表達(dá)

注：與對(duì)照組比較，bP<0.01；與糖尿病組比較，dP<0.01

表4 3組大鼠p38 MAPK 蛋白和活性比較

注：與對(duì)照組比較，bP<0.01;與糖尿病組比較，dP<0.01

3 討論

p38 MAPK被激活后進(jìn)入細(xì)胞核，使核轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子磷酸化，從而調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄，引起細(xì)胞增殖、生長(zhǎng)、分化、凋亡等多種生理過(guò)程，并在細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)化等病理過(guò)程中起重要作用，因此認(rèn)為p38 MAPK是細(xì)胞信息傳遞的交匯點(diǎn)或共同通路[8]，其轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活在可加速了DN的發(fā)生、發(fā)展；p38 MAPK可通過(guò)影響細(xì)胞因子如轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)和結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(CTGF)的表達(dá)[9]，影響高糖狀態(tài)下系膜細(xì)胞分泌FN等細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分，加速DN的腎小球硬化也可促進(jìn)腎臟足細(xì)胞的凋亡[10]，影響炎癥因子在DN中表達(dá)[2]。白藜蘆醇在DN大鼠模型中可通過(guò)抑制p38 MAPK活性，從而抑制TGF-β1和FN水平保護(hù)腎臟功能[11]。故選擇適當(dāng)?shù)乃幬镒柚筽38 MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路激活或抑制p38 MAPK活性可成為預(yù)防和治療DN的有效方法。

本研究結(jié)果顯示，糖尿病組腎組織MKP-1表達(dá)明顯下降，p-p38MAPK的表達(dá)明顯升高。蛋白印記及RT-PCR結(jié)果顯示：氟伐他汀能明顯提高M(jìn)KP-1蛋白及mRNA的表達(dá)，降低p38 MAPK的活性。 MKP-1位于細(xì)胞核內(nèi)，是絲裂原活化蛋白激酶(MAPKs)的天然負(fù)性調(diào)節(jié)因子，在MAPKs 去磷酸化過(guò)程中發(fā)揮重要作用[12]。MAPKs 調(diào)節(jié)位點(diǎn)中保守的蘇氨酸或酪氨酸基團(tuán)可被雙特異性蛋白激酶磷酸化激活，該酶可使同位點(diǎn)的蘇氨酸或酪氨酸基團(tuán)去磷酸化，從而滅活MAPKs，使其活性下降[13]。目前發(fā)現(xiàn)蛋白磷酸酶的活性是蛋白激酶活性的100～1000 倍，在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中作用重要，故對(duì)蛋白磷酸酶的更多。Awazu等[14]研究發(fā)現(xiàn)DN時(shí)大鼠MAPK 活性增加，MKP-1 活性下降，且比對(duì)照組下降60%；提示DN時(shí)MAPK 活化是其磷酸化增強(qiáng)、MKP-1 的脫磷酸化減弱所致。本研究結(jié)果顯示，糖尿病大鼠模型4 周時(shí)腎重體重比增加，腎臟處于高灌注高濾過(guò)狀態(tài)，此時(shí)腎組織中p38 MAPK 活性升高，MKP-1表達(dá)下降，同時(shí)該組血糖、血脂、血尿素、血肌酐和24 h尿蛋白均高于對(duì)照組，提示糖尿病早期腎臟細(xì)胞處于增殖和肥大狀態(tài)，與p38 MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)激活相關(guān)。此時(shí)MKP-1水平下降，MKP-1脫磷酸化功能減弱可能是p38 MAPK活性增高的原因之一，與文獻(xiàn)報(bào)道一致。故選擇提高M(jìn)KP-1的活性的藥物可減緩DN的發(fā)生和進(jìn)展[15]。

他汀類(lèi)藥物作為膽固醇合成酶系中的限速酶，是臨床上最常用的降脂藥物；其具有非依賴降脂的腎臟保護(hù)作用[5]。他汀類(lèi)藥物的甲羥戊酸途徑，主要是通過(guò)阻斷細(xì)胞內(nèi)膽固醇合成過(guò)程使其產(chǎn)生減少；他汀類(lèi)藥物還能抑制非甾醇異戊二烯產(chǎn)物生成，抑制蛋白質(zhì)的異戊二烯化修飾，可引起這些蛋白的MAPK 通路尤其是p38 MAPK通路級(jí)聯(lián)活化受抑，p38 MAPK活性下降，從而影響核轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)，產(chǎn)生相應(yīng)的生物學(xué)效應(yīng)[16]。本研究結(jié)果顯示，與糖尿病組相比，氟伐他汀組可p38 MAPK 表達(dá)水平降低而MKP-1的表達(dá)升高，同時(shí)腎重/體重比、24 h尿蛋白和肌酐清除率均下降。提示氟伐他汀可降低DN早期的增殖和肥大，降低尿蛋白排泄，對(duì)早期糖尿病大鼠的腎功能有一定的保護(hù)作用，與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道一致[17]。其主要是通過(guò)降低MKP-1的表達(dá)，抑制炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡實(shí)現(xiàn)。

相關(guān)研究表明MKP-1對(duì)底物的作用能力順序?yàn)椋簆38>JNK>ERK1/2[18]，提示MKP-1可以抑制p38 MAPK、JNK、ERK1/2通路。目前有關(guān)MKP-1在DN發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制尚未完全清楚。我們的研究結(jié)果僅提示在糖尿病早期MKP-1蛋白及其mRNA表達(dá)均降低，氟伐他汀對(duì)其腎臟保護(hù)作用可能部分是通過(guò)提高M(jìn)KP-1表達(dá)，進(jìn)一步抑制P38信號(hào)途徑活化實(shí)現(xiàn)的。