杜 娜 ， 林 云 ， 劉淑敏 ， 牛 敏 ， 李亞波 ， 施雄飛 ， 周 芳 ， 堯 靜 ， 張孟爽 ，杜 艷

弗勞地枸櫞酸桿菌屬腸桿菌科細(xì)菌，是重要的醫(yī)院感染病原菌，可引起腹瀉、腦膜炎、尿路感染、呼吸道感染和血流感染[1]。臨床分離的弗勞地枸櫞酸桿菌對(duì)碳青霉烯類耐藥最主要的機(jī)制是產(chǎn)碳青霉烯酶，主要包括KPC、VIM、IMP、OXA-48和NDM-1酶[2]。部分產(chǎn)NDM-1酶細(xì)菌會(huì)對(duì)除氨曲南外的幾乎所有抗菌藥物耐藥，僅剩替加環(huán)素和多黏菌素可用。已有報(bào)道表明質(zhì)粒是介導(dǎo)blaNDM-1基因水平轉(zhuǎn)移的重要移動(dòng)元件，但是這些發(fā)現(xiàn)大多集中在肺炎克雷伯菌[3]、大腸埃細(xì)菌[4]和鮑曼不動(dòng)桿菌[5]，弗勞地枸櫞酸桿菌研究相對(duì)較少。本研究擬通過(guò)對(duì)18株產(chǎn)NDM-1酶弗勞地枸櫞酸桿菌進(jìn)行接合試驗(yàn)、脈沖場(chǎng)凝膠電泳（PFGE）試驗(yàn)及Southern印跡雜交試驗(yàn)，明確blaNDM-1基因的水平轉(zhuǎn)移機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 收集昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院2012年6月－2014年10月產(chǎn)NDM-1酶弗勞地枸櫞酸桿菌18株，經(jīng)改良Hodge試驗(yàn)、金屬酶（MBL）表型確證試驗(yàn)以及聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）法檢測(cè)NDM-1酶及基因，通過(guò) VITEK 2 進(jìn)行菌株鑒定。菌株來(lái)源于尿液標(biāo)本。包括移植中心12株，干療科3株，泌尿外科、神經(jīng)外科、中醫(yī)科各1株。沙門菌 H9812 菌株由俞云松教授惠贈(zèng)，質(zhì)控菌大腸埃希菌ATCC 25922由本科室保存。

1.1.2 試劑 MH肉湯/瓊脂干粉購(gòu)自英國(guó)OXOID公司，亞胺培南購(gòu)自合肥博美生物科技有限公司，利福平購(gòu)自北京酷來(lái)博科技有限公司，PCR所用試劑、大量瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、5×TBE等購(gòu)于天根（北京）科技有限公司，AgaroseⅢ膠購(gòu)于美國(guó)Bio-Rad公司，蛋白酶K和Brij58購(gòu)于美國(guó)Sigma公司，S1核酸內(nèi)切酶購(gòu)于美國(guó)Promega公司，尼龍膜購(gòu)于美國(guó)Millipore公司，Southern印跡雜交試劑盒DIG-High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit I購(gòu)于美國(guó)Roche公司，枸櫞酸鈉、Tris、氯化鈉和低熔點(diǎn)膠等試劑購(gòu)自上海生工生物工程有限公司。

1.1.3 儀器 VITEK 2全自動(dòng)微生物鑒定與藥敏分析儀購(gòu)自法國(guó)生物梅里埃公司，培養(yǎng)箱購(gòu)自昆明友寧科技公司，1G603二級(jí)生物安全柜購(gòu)自美國(guó)Baker公司，MyCycler TM thermalCycler DNA擴(kuò)增儀、Power Pac3000型電泳儀、CHEF Mapper XA PFGE系統(tǒng)、化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)均購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司，紫外分光光度計(jì)購(gòu)自美國(guó)Thermo公司，分子雜交箱購(gòu)自美國(guó)SHELLAB公司，水浴箱購(gòu)自上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌鑒定及藥敏試驗(yàn) 采用VITEK 2系統(tǒng)進(jìn)行菌種鑒定及藥敏試驗(yàn)。藥敏結(jié)果的判讀參照2014 年 CLSI M100-S24 標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.2 接合試驗(yàn) 供體菌為前期研究基礎(chǔ)上分離的產(chǎn)NDM-1酶弗勞地枸櫞酸桿菌，受體菌為利福平耐藥的大腸埃希菌EC600。將供受體菌轉(zhuǎn)種于MH平皿上，37?℃過(guò)夜培養(yǎng)后挑取單個(gè)菌落接種于MH肉湯，37?℃過(guò)夜培養(yǎng)，將供、受體菌按1∶1比例加入MH肉湯混合靜置培養(yǎng)，37?℃過(guò)夜。將混合菌液和供、受體菌純菌液均接種在含4 mg/L 亞胺培南和256 mg/L利福平的MH平皿上，供受體純菌液不生長(zhǎng)而混合菌液生長(zhǎng)為接合子，再采用VITEK 2 兩對(duì)接合子進(jìn)行菌種鑒定，菌種為大腸埃希菌者為接合子，最后再通過(guò)PCR驗(yàn)證，擴(kuò)增NDM-1基因陽(yáng)性者為接合子。

1.2.3 PFGE分離質(zhì)粒 取在MH平皿上純培養(yǎng)后的細(xì)菌調(diào)配菌液，紫外分光光度計(jì)測(cè)得的590 nm處吸光度值0.8～1.0為宜，將菌液與2%低熔點(diǎn)膠以1∶1比例進(jìn)行細(xì)菌包埋。細(xì)菌包埋后用S1核酸酶在50 μL體系[ ddH2O 44.5 μL，10×buffer 5 μL，S1核酸酶（80 U/μL）0.5 μL ] 進(jìn)行酶切，37?℃水浴箱中孵育2 h后進(jìn)行PFGE。電泳條件：6 V/cm，脈沖時(shí)間2.16～63.8 s，14?℃，0.5×TBE緩沖液，電場(chǎng)角度120°，總時(shí)間為18 h。S1核酸酶可將染色體DNA降解而質(zhì)粒DNA則消化成線性DNA，因而在PFGE圖譜中只能看見(jiàn)質(zhì)粒DNA條帶，通過(guò)與Marker進(jìn)行比對(duì)，讀取質(zhì)粒的大小。

1.2.4 Southern印跡雜交試驗(yàn) ①探針的制備：選取1株經(jīng)PCR確證為blaNDM-l基因陽(yáng)性的菌株擴(kuò)增。引物為F：5'-GGGCAGTCGCTTCCAACGGT-3'，R：5'-GATGTGCTCAGTGTCGGCAT-3'。擴(kuò)增條件為：95?℃預(yù)變性5 min；95?℃ 30 s，63?℃30 s，72?℃ 45 s，35個(gè)循環(huán)；最后72?℃延伸3 min。反應(yīng)體系為：總體積25 μL，DNA模板1 μL，2×TaqPCR Master MIX 12.5 μL，ddH2O 9.5 μL，上、下游引物各1 μL。2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定blaNDM-1基因片段。使用大量瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行切膠純化。使用DIG-High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit I試劑盒中的DIG-High Prime進(jìn)行DNA地高辛標(biāo)記；②Southern印跡雜交：將PFGE膠上的DNA轉(zhuǎn)移至尼龍膜上，按照Southern印跡雜交試劑盒DIGHigh Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit I進(jìn)行操作。

2 結(jié)果

2.1 藥敏結(jié)果

18株細(xì)菌對(duì)青霉素類、頭孢菌素類、碳青霉烯類抗生素的耐藥率高達(dá) 100%，對(duì)氨曲南、慶大霉素、甲氧芐啶-磺胺甲唑、環(huán)丙沙星、四環(huán)素、左氧氟沙星和呋喃妥因耐藥率分別為 66.7%（12株）、66.7%（12株）、66.7%（12株）、61.1%（11株）、61.1%（11株）、33.3%（6株）和 11.1%（2株）。接合子均對(duì)碳青霉烯類抗生素耐藥。

2.2 PFGE分離質(zhì)粒

質(zhì)粒條帶在PFGE圖上清晰可見(jiàn)，18株菌攜帶質(zhì)粒的大小為33.3～310.1 kb，數(shù)目為1～5個(gè)。見(jiàn)圖1。

圖1 18株產(chǎn)NDM-1酶弗勞地枸櫞酸桿菌經(jīng)S1核酸酶酶切后的脈沖場(chǎng)凝膠電泳圖Figure 1 Pulsed-field gel electrophoresis patterns of S1-digested DNA of 18 Citrobacter freundii isolates

2.3 Southern印跡雜交

18株菌中有2株菌（15、16列）的blaNDM-1基因定位在33.3～54.7 kb大小的質(zhì)粒上，其余菌株的blaNDM-1基因均位于約33.3 kb大小的質(zhì)粒上。見(jiàn)圖 2。

3 討論

圖2 質(zhì)粒與NDM-1探針的Southern印跡雜交圖Figure 2 Results of Southern blot hybridization between plasmid and NDM-1 probe

弗勞地枸櫞酸桿菌常寄生于人和動(dòng)物腸道，廣泛分布于自然界及醫(yī)院環(huán)境中，是條件致病菌，可引起腹瀉、腦膜炎、尿路感染、呼吸道感染和血流感染。據(jù)中國(guó)醫(yī)院內(nèi)病原菌耐藥性監(jiān)測(cè)網(wǎng)（NPRS） 顯示近年來(lái)在分離的腸桿菌科細(xì)菌中，枸櫞酸桿菌屬占較大比例。隨著碳青霉烯類抗生素的大量使用，臨床分離的耐碳青霉烯類弗勞地枸櫞酸桿菌不斷增加。NDM-1酶是2008年由Yong等[6]在1例感染肺炎克雷伯菌的印度裔瑞典患者的尿液標(biāo)本中首次發(fā)現(xiàn)，此后在世界范圍內(nèi)屢見(jiàn)報(bào)道。NDM-1酶常在肺炎克雷伯菌、大腸埃希菌、鮑曼不動(dòng)桿菌、銅綠假單胞菌及陰溝腸桿菌中檢出，在弗勞地枸櫞酸桿菌中少見(jiàn)報(bào)道。2016年林迪等[7]報(bào)道了4株產(chǎn)NDM-1酶弗勞地枸櫞酸桿菌，但是并未對(duì)blaNDM-1基因進(jìn)行定位分析。本研究對(duì)18株產(chǎn)NDM-1酶弗勞地枸櫞酸桿菌blaNDM-1基因定位于質(zhì)粒進(jìn)行了系統(tǒng)分析。

本研究藥敏結(jié)果顯示產(chǎn)NDM-1酶弗勞地枸櫞酸桿菌以多重耐藥為顯著特點(diǎn)，除對(duì)碳青霉烯類、頭孢菌素類、青霉素類、氟喹諾酮類和氨基糖苷類抗菌藥物耐藥外，部分菌株還對(duì)氨曲南耐藥，而金屬β內(nèi)酰胺酶不能水解氨曲南[8]，因此推測(cè)部分菌株中還存在其他β內(nèi)酰胺酶介導(dǎo)對(duì)氨曲南的耐藥。接合試驗(yàn)表明18株菌中有13株接合成功，blaNDM-1基因成功地從弗勞地枸櫞酸桿菌中轉(zhuǎn)移至大腸埃希菌，并呈現(xiàn)出碳青霉烯類抗生素耐藥表型，這初步表明blaNDM-1基因是位于接合質(zhì)粒上，能通過(guò)質(zhì)粒進(jìn)行水平轉(zhuǎn)移。

碳青霉烯類耐藥基因常位于一些移動(dòng)元件如質(zhì)粒、整合子和插入序列共同區(qū)（ISCR）上，在同種屬或不同種屬細(xì)菌間穿梭，導(dǎo)致多重耐藥菌株的產(chǎn)生，給臨床抗感染治療帶來(lái)了極大困難。本組在前期研究中對(duì)產(chǎn)NDM-1酶弗勞地枸櫞酸桿菌進(jìn)行了克隆傳播研究及整合子和ISCR 1元件的檢測(cè)，結(jié)果表明產(chǎn)NDM-1酶弗勞地枸櫞酸桿菌克隆傳播趨勢(shì)不明顯，且blaNDM-1基因的傳播與整合子和ISCR1元件無(wú)關(guān)，但是在這兩種移動(dòng)元件中檢出了氨基糖苷類和磺胺類抗菌藥物耐藥基因[9]。本研究繼續(xù)對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行深入研究，在PFGE圖譜上可以清晰地看到每株菌中含有的質(zhì)粒數(shù)目及大小都不一樣，但是有16株菌均含有一個(gè)約33.3 kb大小的質(zhì)粒，通過(guò)Southern印跡雜交進(jìn)行定位分析發(fā)現(xiàn)這16株菌的blaNDM-1基因均位于該質(zhì)粒上，另外2株菌的blaNDM-1基因也位于質(zhì)粒上，大小為33.3～54.7 kb。國(guó)內(nèi)已有多個(gè)地區(qū)包括北京、上海、香港、山東、河南及云南等報(bào)道了blaNDM-1基因位于質(zhì)粒上，質(zhì)粒的大小為50～360 kb[10-11]，質(zhì)粒的大小與我們的報(bào)道不一致。

“NDM-1超級(jí)細(xì)菌”已在世界范圍內(nèi)播散，遏制此種細(xì)菌的傳播不僅需要多地區(qū)的合作，更需要醫(yī)院感染控制部門、微生物檢驗(yàn)部門及臨床相關(guān)科室間的相互協(xié)作。本研究證明了耐碳青霉烯類弗勞地枸櫞酸桿菌中的blaNDM-1基因是通過(guò)質(zhì)粒進(jìn)行水平傳播的，期望能為臨床抗感染治療及遏制產(chǎn)NDM-1酶細(xì)菌的傳播提供理論依據(jù)。