牛寧奎， 馬 濤，王自立， 師志云， 施建黨， 王學(xué)偉， 馬文鑫， 楊宗強， 丁惠強

結(jié)核病仍然是世界范圍內(nèi)致人類死亡的重大傳染病之一[1]。脊柱結(jié)核作為最常見的肺外結(jié)核[2]，即使使用規(guī)范化療并附加手術(shù)，仍面臨著復(fù)發(fā)率高、難治病例增加、二次手術(shù)率高等療效不佳的現(xiàn)狀[3]。以異煙肼（H）、利福平（R）、吡嗪酰胺（Z）為基礎(chǔ)的抗結(jié)核主藥在椎體硬化區(qū)及其所包裹的結(jié)核病灶內(nèi)很難長期存留及維持有效的藥物濃度，抗結(jié)核時間長、不良反應(yīng)大、順應(yīng)性差、督導(dǎo)困難以及宿主細(xì)胞抗結(jié)核能力差等都是脊柱結(jié)核遷延不愈和復(fù)發(fā)的主要原因。

因此，課題組前期設(shè)計研制了HRZ三聯(lián)抗結(jié)核藥/TGF-β1 siRNA納米脂質(zhì)體（HRZ/TGF-β1 siRNA納米脂質(zhì)體），通過對構(gòu)建機(jī)制即承載與轉(zhuǎn)運功能、沉默效應(yīng)、靶向作用的研究，從而以具有脂質(zhì)雙分子及自組裝特點的脂質(zhì)體為載體，結(jié)合臨床一線抗結(jié)核藥物（異煙肼7.2 mg、利福平10.9 mg及吡嗪酰胺1.8 mg），形成載藥HRZ陽離子脂質(zhì)體納米微粒，并利用該陽離子脂質(zhì)體表面的正電荷與帶有負(fù)電的表皮轉(zhuǎn)化生長因子（TGF-β1）的小干擾RNA（small interfering，siRNA）結(jié)合，靶向沉默結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis）的宿主細(xì)胞即巨噬細(xì)胞中TGF-β1mRNA基因表達(dá)，減少結(jié)核性肉芽腫的形成，利于抗結(jié)核藥物及巨噬細(xì)胞發(fā)揮抗結(jié)核作用。前期工作已對構(gòu)建的HRZ/TGF-β1 siRNA納米脂質(zhì)體進(jìn)行了粒徑、電位、包封率及形態(tài)學(xué)觀察等分析，現(xiàn)研究該納米脂質(zhì)體對人巨噬細(xì)胞體外細(xì)胞毒性及其機(jī)制，旨在為其安全性評價提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

RPMI1640（ Hyclone，SH30809.01B/500 mL），胎 牛 血 清（Hyclone，SH30070.03）， 胰 酶（Hyclone，SH30042.01/100 mL），四唑鹽（MTT）（biosharp，5 g），PI-AnnexinV-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（eBioscience，BMS500FI），PI染色液（BD，550825），SYBR?Premix Ex Taq（TaKaRa，RR820A），PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（TaKaRa，RR047A），RNAiso Plus（TaKaRa，9108），抗 -TGF β1抗體（abcam，ab92486）；酶標(biāo) 儀（Thermo fi sher，Multiskan 51119000），CO2培 養(yǎng) 箱（Thermo fi sher，3131），Stepone plus 熒光 定 量 PCR（ABI），Nano drop 2000（Thermo fi sher），透射電鏡儀（JEM1011），Leica UC6超薄切片機(jī)（Leica，EM UC6）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)

人單核細(xì)胞株THP-1購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所細(xì)胞庫。采用含10%胎牛血清（FCS，GIBCO）的RPMI 1640培養(yǎng)液（GIBCO）在37?℃，5%CO2條件下培養(yǎng)，待細(xì)胞增殖至2×108/L時，加入100 nmol/L 佛波醇-12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯（PMA）誘導(dǎo)48 h，誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞分化成巨噬細(xì)胞，倒置相差顯微鏡下觀察巨噬細(xì)胞貼壁且形態(tài)明確誘導(dǎo)成功后，用 PBS洗滌2次，更換培養(yǎng)基，培養(yǎng)3 h用于后續(xù)實驗。

1.3 實驗分組

HRZ三聯(lián)抗結(jié)核藥陽離子納米脂質(zhì)體表面帶正電荷，能與核酸中磷酸根通過靜電作用將RNA分子包裹入內(nèi)，形成siRNA-納米脂質(zhì)體復(fù)合體，納米脂質(zhì)體與siRNA按照5∶1的質(zhì)量比例混勻，室溫孵育30 min后包裹完成。實驗中A組是單純HRZ三聯(lián)抗結(jié)核藥陽離子納米脂質(zhì)體加入巨噬細(xì)胞培養(yǎng)，B組是結(jié)合NC亂序的HRZ三聯(lián)抗結(jié)核藥納米脂質(zhì)體加入巨噬細(xì)胞培養(yǎng)（NC亂序的序列GAAGGCCCATAGCCAGTGACT），C組是加入結(jié)合TGF-β1 siRNA序列的HRZ三聯(lián)抗結(jié)核藥納米脂質(zhì)體加入巨噬細(xì)胞培養(yǎng)。

1.4 MTT比色試驗檢測巨噬細(xì)胞相對增殖率（RGR）及半數(shù)抑制濃度（IC50）

將THP1細(xì)胞從培養(yǎng)瓶中轉(zhuǎn)移至15 mL離心管中，1 000 r/min離心去除上清液，加入RPMI-1640 + 10%含胎牛血清的完全培養(yǎng)基（FBS）重懸細(xì)胞，將細(xì)胞分別種在96孔板中，每孔接種5 000個細(xì)胞，同時加入100 nmol/L PMA誘導(dǎo)48 h，待細(xì)胞貼壁后，使用含不同濃度HRZ/TGF-β1 siRNA納米脂質(zhì)體（0、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50 g/L）的培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，復(fù)孔各5個。培養(yǎng)24 h后加入10 μL（5 g/L）MTT，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)約3 h。去除培養(yǎng)基，每孔加入150 μL二甲基亞砜（DMSO），搖晃均勻，在560 nm波長測定吸光度值，計算細(xì)胞RGR，并對HRZ/TGF-β1 siRNA納米脂質(zhì)體的細(xì)胞毒性分級評價。RGR=（實驗組D值/對照組D值）×100%，RGR越大，材料毒性越小。細(xì)胞毒性分級：0級：RGR≥100%；1級：75%～99%：2級：50%～74%；3級：25%～49%；4級：1%～24%；5級：0。結(jié)果評價：實驗結(jié)果為0級或1級反應(yīng)為合格；2級反應(yīng)應(yīng)結(jié)合細(xì)胞形態(tài)綜合評價；3～5級反應(yīng)為不合格[4]。同時根據(jù)公式LgIC50=Xm-l [ P- ( 3-Pm-Pn ) /4 ]計算IC50。

1.5 流式細(xì)胞儀檢測巨噬細(xì)胞周期和凋亡

待細(xì)胞誘導(dǎo)成巨噬細(xì)胞貼壁后，使用含不同濃度HRZ/TGF-β1 siRNA納米脂質(zhì)體的培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞。培養(yǎng)24 h后，收集培養(yǎng)上清液，用胰酶消化貼壁的細(xì)胞，1 000 r/min離心5 min，棄上清液，將全部收集細(xì)胞加入離心管中。用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞3次，4?℃，1 000 r/min離心5 min，棄上清液。將所獲細(xì)胞懸液分為兩份：一份加入500 μL PI染色后，37?℃避光孵育30 min，用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期；另一份加入5 μL PI和5 μL FITC-Annexin V雙染，常溫避光孵育15 min，加入400 μL 綁定緩沖液混勻，立刻用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡。

1.6 透射電子顯微鏡觀察巨噬細(xì)胞自噬

細(xì)胞處理好后，輕輕去除培養(yǎng)基，加入預(yù)冷PBS洗2次后，加入1 mL胰酶，搖晃均勻后放入培養(yǎng)箱中消化2 min；消化結(jié)束后加入完全培養(yǎng)基中和胰酶作用，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至15 mL離心管中，1 000 r/min常溫離心5 min；去除培養(yǎng)基，加入預(yù)冷的PBS重懸細(xì)胞，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至EP管中，1 000 r/min常溫離心5 min。去除PBS，輕輕加入1%戊二醛 4?℃固定細(xì)胞過夜；室溫下用1%四氧化鋨固定樣品1 h，然后用10%明膠包埋固定好的樣品；在4?℃環(huán)境下用戊二醛固定樣品1 h；樣品用濃度遞增的乙醇溶液（30%、50%、70%、90%、95%、100%）脫水；用環(huán)氧樹脂浸透包埋后，用Leica UC6超薄切片機(jī)切片；最后在110 kV的條件下，用透射電子顯微鏡觀察樣品并拍攝照片。

1.7 反轉(zhuǎn)錄-PCR（RT-PCR）及Western-blot檢測巨噬細(xì)胞TGF-β1靶基因表達(dá)

RT-PCR及Western-blot檢測siRNA沉默靶基因的mRNA及蛋白表達(dá)，依據(jù)RNA提取試劑TRlzol操作說明提取巨噬細(xì)胞總RNA，加入焦碳酸二乙酯（DEPC）50 μL溶解，核酸蛋白測定儀Nano drop測定RNA純度和濃度，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書（TaKaRa， RR047）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄實驗步驟，定量PCR根據(jù)sybr green說明書進(jìn)行配制，定量PCR按：預(yù)變性95.0 ℃ 10 min；變性95.0 ?℃ 5 s，退火延伸60.0 ℃ 1 min，40個循環(huán)；溶解曲線為95.0?℃變性后，從60.0?℃開始熒光信號采集，每增加0.3?℃采集1次信號，一直采集到95.0?℃。以GAPDH 為內(nèi)參，TGF-β1 mRNA相對表達(dá)水平通過2-ΔΔCt計算分析。PCR引物由上海生工生物公司合成，TGF-β1：F- GTCCTGGTGGAATGGGTTATAC，RGTTGAGTGTTCTTTGGCTTGAC；GAPDH：F- GGTGTGAACCATGAGAAGTATGA；RGAGTCCTTCCACGATACCAAAG。抽取三組巨噬細(xì)胞總蛋白，BCA法測蛋白濃度后-80℃保存。調(diào)整各組總蛋白濃度使每孔上樣量一致，10%SDS-聚丙烯酰按凝膠垂直電泳分離后通過半干電轉(zhuǎn)儀將蛋白轉(zhuǎn)到PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，TBST洗膜3次，每次5 min；4 ℃孵育一抗過夜，TBST洗膜4次，每次5 min；孵育二抗，37 ℃搖床1 h，TBST洗膜4次，每次5 min；化學(xué)發(fā)光，曝光，定影；凝膠成像儀進(jìn)行圖像處理，采用Quantity-one軟件分析目的條帶的累積光密度值（IOD值），以內(nèi)參GAPDH作為參照。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 15.0 統(tǒng)計軟件，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MTT試驗檢測巨噬細(xì)胞RGR及IC50

從MTT試驗結(jié)果可以看出，將不同濃度HRZ/TGF-β1 siRNA納米脂質(zhì)體作用于人巨噬細(xì)胞24 h后，抑制巨噬細(xì)胞增殖，隨著其濃度增加，細(xì)胞增殖能力逐漸下調(diào)；各濃度HRZ/TGF-β1 siRNA納米脂質(zhì)體的細(xì)胞毒性為1級或2級，HRZ/TGF-β1 siRNA納米脂質(zhì)體對巨噬細(xì)胞有一定的細(xì)胞毒性。根據(jù)公式計算得出IC50值為37.47 g/L，故選擇35 g/ L和40 g/L的HRZ/TGF-β1 siRNA納米脂質(zhì)體進(jìn)行后期實驗。見表1、圖 1。

2.2 流式細(xì)胞儀檢測巨噬細(xì)胞周期

以35 g/L和40 g/L濃度HRZ/TGF-β1 siRNA納米脂質(zhì)體作用于巨噬細(xì)胞，從細(xì)胞周期圖中可以看出，與未加HRZ/TGF-β1 siRNA納米脂質(zhì)體（0）相比，巨噬細(xì)胞中加入HRZ/TGF-β1 siRNA納米脂質(zhì)體后，其抑制了細(xì)胞G2期檢查點的進(jìn)行，隨著濃度的增加，G1期、S期細(xì)胞比例減少，G2期細(xì)胞比例增多，表明該納米脂質(zhì)體影響了巨噬細(xì)胞的細(xì)胞周期，并使細(xì)胞周期被捕獲于G2期，見圖2。

2.3 流式細(xì)胞儀檢測巨噬細(xì)胞凋亡

從圖3的凋亡結(jié)果圖中可以看到畫十字的散點圖，左上象限是死細(xì)胞，左下象限是正常活細(xì)胞，右下象限是早期凋亡細(xì)胞，右上象限是晚期凋亡細(xì)胞。實驗中統(tǒng)計的是右上象限細(xì)胞的比例。從圖中可以看出，與空白對照組相比，巨噬細(xì)胞加入HRZ/TGF-β1 siRNA納米脂質(zhì)體24 h早期凋亡細(xì)胞和晚期凋亡細(xì)胞的比例逐漸增加，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），表明凋亡在HRZ/TGF-β1 siRNA納米脂質(zhì)體誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞毒性效應(yīng)中起了一定作用。

表1 不同濃度HRZ/TGF-β1 siRNA納米脂質(zhì)體對巨噬細(xì)胞相對增殖率和細(xì)胞毒性分級結(jié)果Table 1 Relative proliferation rate of macrophages and the cytotoxicity in the presence of different concentrations of HRZ/TGF-β1 siRNA naroliposomes

圖1 不同濃度HRZ/TGF-β1 siRNA納米脂質(zhì)體對巨噬細(xì)胞增殖的影響Figure 1 Effect of different concentrations of HRZ/TGF-β1 siRNA nanoliposomes on proliferation of macrophage

2.4 透射電子顯微鏡觀察巨噬細(xì)胞自噬

從電鏡圖像中可以看出空白對照組未見自噬體以及納米顆粒，C1組與C2組均出現(xiàn)大量納米顆粒（黃色箭頭所示），細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)自噬體（紅色箭頭所示），C2組內(nèi)自噬體與溶酶體結(jié)合形成自噬溶酶體（藍(lán)色箭頭所示），將其中納米顆粒在溶酶體酶作用下降解，表明HRZ/TGF-β1 siRNA納米脂質(zhì)體可引起細(xì)胞自噬從而表現(xiàn)出一定的細(xì)胞毒性，見圖4。

2.5 RT-PCR及Western-blot檢測巨噬細(xì)胞TGF-β1靶基因表達(dá)結(jié)果

RT-PCR結(jié)果顯示，不同濃度的HRZ/TGF-β1 siRNA納米脂質(zhì)體組較空白對照組明顯抑制TGF-β1 mRNA水平，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。Western blot檢測結(jié)果可以看出，在巨噬細(xì)胞中加入不同濃度HRZ/TGF-β1 siRNA納米脂質(zhì)體后TGF-β1蛋白表達(dá)較空白對照組顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖5-1、圖5-2。

3 討論

脂質(zhì)體作為一種載體，具有改善藥物溶解性，延長藥物半衰期，提高藥物靶向性，降低藥物不良反應(yīng)及提高生物利用度等優(yōu)點而被廣泛應(yīng)用[5]。把抗結(jié)核藥物異煙肼、利福平、吡嗪酰胺包裹進(jìn)脂質(zhì)體形成HRZ三聯(lián)抗結(jié)核藥脂質(zhì)體納米微粒，進(jìn)入人體后被巨噬細(xì)胞吞噬（結(jié)核分枝桿菌正是在巨噬細(xì)胞內(nèi)致病及耐藥），改變包封藥物的體內(nèi)分布，使藥物主要在肝、脾、肺和骨等組織器官中積蓄，從而提高脊柱骨組織中的有效藥物濃度。結(jié)核病中，TGF-β1主要發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，抑制T細(xì)胞反應(yīng)，使巨噬細(xì)胞失活，與結(jié)核病發(fā)病、治療效果、病程有關(guān)，也是形成結(jié)核性肉芽腫的關(guān)鍵因素，TGF-β1在巨噬細(xì)胞內(nèi)高表達(dá)，過量表達(dá)不利于結(jié)核分枝桿菌的清除[5]。應(yīng)用RNAi技術(shù)沉默TGF-β1基因表達(dá)，減少巨噬細(xì)胞中TGF-β1蛋白分泌，使巨噬細(xì)胞中結(jié)核性肉芽腫的形成減少，同時聯(lián)合多種抗結(jié)核藥物，利于MTB清除并增加抗結(jié)核藥物的療效[6-7]。

圖2 兩種濃度HRZ/TGF-β1 siRNA納米脂質(zhì)體對巨噬細(xì)胞周期的影響Figure 2 Cell cycle of macrophage in the presence of two different concentrations of HRZ/TGF-β1 siRNA nanoliposomes

圖3 兩種濃度HRZ/TGF-β1 siRNA納米脂質(zhì)體對巨噬細(xì)胞凋亡統(tǒng)計圖Figure 3 Apoptosis of macrophages in the presence of two different concentrations of HRZ/TGF-β1 siRNA nanoliposomes

圖4 兩種濃度HRZ/TGF-β1 siRNA納米脂質(zhì)體對巨噬細(xì)胞自噬電鏡圖Figure 4 Electron micrographs of macrophages in the presence of two different concentrations of HRZ/TGF-β1 siRNA nanoliposomes

圖5 -1 兩種濃度HRZ/TGF-β1 siRNA納米脂質(zhì)體對巨噬細(xì)胞TGF-β1 mRNA表達(dá)變化Figure 5-1 Changes of TGF-β1 mRNA expression in macrophages treated by two concentration HRZ/TGF-β1 siRNA nanoliposomes

本研究團(tuán)隊已成功構(gòu)建了HRZ/TGF-β1 siRNA納米脂質(zhì)體，并對其粒徑、電位、包封率及形態(tài)學(xué)觀察等做了表征。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HRZ/TGF-β1 siRNA納米脂質(zhì)體呈球形，大小均勻，粒徑為（152.69±59.47）nm，Zeta電位（28.13±2.4）mV，異煙肼、利福平及吡嗪酰胺的藥物包封率分別為90%、88%、37%，為本次實驗的生物效應(yīng)和毒性研究提供有價值的參 考。

免疫系統(tǒng)是人體抵御外源物侵犯最重要的防衛(wèi)系統(tǒng)，特別是巨噬細(xì)胞具有很強的吞噬能力，能有效吞噬、消化外來抗原如病原微生物、不溶性顆粒和內(nèi)源性物質(zhì)如細(xì)胞碎片等。顆粒材料作為外源異物進(jìn)入生物體內(nèi)，首先會被巨噬細(xì)胞識別，巨噬細(xì)胞可以通過IgGFc受體、補體受體、甘露糖受體和清道夫受體介導(dǎo)的方式特異性的或經(jīng)其他非特異性的方式將顆粒包裹起來[8-9]，形成吞噬體。目前，很多研究利用巨噬細(xì)胞這一特性（包括各種巨噬細(xì)胞系以及體外原代培養(yǎng)巨噬細(xì)胞）評價顆粒材料的生物學(xué)效應(yīng)及細(xì)胞毒性。

圖5 -2 Western blot檢測兩種濃度HRZ/TGF-β1 siRNA納米脂質(zhì)體對巨噬細(xì)胞TGF-β1表達(dá)變化Figure 5-2 Changes of TGF-β1 expression in macrophages after treatment with two concentration of HRZ/TGF-β1 siRNA nanoliposomes by Western blot

本實驗中，用不同濃度HRZ/TGF-β1 siRNA納米脂質(zhì)體（0、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50 g/L）的培養(yǎng)基培養(yǎng)巨噬細(xì)胞24 h后，MTT試驗檢測巨噬細(xì)胞存活率并計算IC50、流式細(xì)胞儀檢測巨噬細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡、透射電子顯微鏡觀察HRZ/TGF-β1 siRNA納米脂質(zhì)體對巨噬細(xì)胞自噬的影響、RT-PCR及Western-blot檢測HRZ/TGF-β1 siRNA納米脂質(zhì)體靶向巨噬細(xì)胞TGF-β1的作用。

本研究MTT試驗結(jié)果顯示，隨著HRZ/TGF-β1 siRNA納米脂質(zhì)體濃度增加，細(xì)胞增殖能力逐漸下調(diào)。各濃度HRZ/TGF-β1 siRNA納米脂質(zhì)體的細(xì)胞毒性為1級或2級，其對巨噬細(xì)胞具有一定的細(xì)胞毒性。同時，該HRZ/TGF-β1 siRNA納米脂質(zhì)體IC50值為37.47 g/L，故選擇35 g/L和40 g/L的納米顆粒進(jìn)行后續(xù)實驗。流式細(xì)胞儀檢測巨噬細(xì)胞周期的結(jié)果顯示，巨噬細(xì)胞加入HRZ/TGF-β1 siRNA納米脂質(zhì)體后，該納米脂質(zhì)體抑制細(xì)胞到G2期，即G1期、S期細(xì)胞比例減少，G2期細(xì)胞比例增多，表明HRZ/TGF-β1 siRNA納米脂質(zhì)體影響了巨噬細(xì)胞的細(xì)胞周期，并使細(xì)胞周期被捕獲于G2期。細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示，巨噬細(xì)胞加入HRZ/TGF-β1 siRNA納米脂質(zhì)體24 h早期凋亡細(xì)胞和晚期凋亡細(xì)胞的比例逐漸增加，表明凋亡在該納米脂質(zhì)體誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞毒性效應(yīng)中起了一定作用。

自噬（autophagy）是真核細(xì)胞獨有的胞內(nèi)溶酶體降解途徑，細(xì)胞自身調(diào)節(jié)維持穩(wěn)態(tài)平衡的重要過程。納米材料被生物體攝取后，作為機(jī)體對外來物質(zhì)或有毒物質(zhì)的一種防御保護(hù)反應(yīng)，會誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生自噬。本研究透射電鏡結(jié)果顯示，HRZ/TGF-β1 siRNA納米脂質(zhì)體處理的巨噬細(xì)胞里出現(xiàn)大量納米顆粒及自噬體，其中40 g/L組內(nèi)自噬體與溶酶體結(jié)合形成自噬溶酶體，在溶酶體酶作用下降解納米顆粒，表明HRZ/TGF-β1 siRNA納米脂質(zhì)體可引起細(xì)胞自噬從而表現(xiàn)出一定的細(xì)胞毒 性。

RNAi基因沉默有以下顯著優(yōu)點：①高特異性，只引起與雙鏈RNA（dsRNA）同源mRNA的降解，而其他mRNA的表達(dá)不受到影響；②高效性，只需要數(shù)個小片段RNA（siRNA）就能顯著抑制細(xì)胞靶基因表達(dá)甚至完全敲除；③可傳播性，siRNA具備跨越細(xì)胞之間界限傳播的能力；④可遺傳性，RNAi的基因沉默在低等動物中可被遺傳。本實驗中，RT-PCR及Western-blot結(jié)果顯示，35 g/L和40 g/L的HRZ/TGF-β1 siRNA納米脂質(zhì)體可以在mRNA和蛋白水平明顯抑制TGF-β1基因表達(dá)，與空白對照組相比有顯著性差異，表明該納米脂質(zhì)體可以減少巨噬細(xì)胞TGF-β1蛋白分泌。

本研究體外PMA誘導(dǎo)人單核細(xì)胞珠 THP-1細(xì)胞分化成巨噬細(xì)胞（M1和M2型），未進(jìn)一步對巨噬細(xì)胞細(xì)胞進(jìn)行分選并獲得M2型巨噬細(xì)胞，可能會對實驗結(jié)果造成一定的影響。

總之，本研究構(gòu)建的HRZ/TGF-β1 siRNA納米脂質(zhì)體對體外人巨噬細(xì)胞的細(xì)胞毒性在一定范圍內(nèi)，細(xì)胞凋亡和自噬在納米顆粒誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞毒性效應(yīng)中起了一定作用；納米顆粒具有明顯的靶基因沉默作用，顯著抑制巨噬細(xì)胞TGF-β1的表達(dá)，為進(jìn)一步動物實驗及臨床研發(fā)提供前期實驗結(jié)果。