張紅巖，項 顆，王雪冰，徐麗娜

（吉林省中醫(yī)藥科學(xué)院，長春 130012）

溫腎通絡(luò)顆粒是由熟地黃、肉桂、補骨脂、炮姜、牛膝、伸筋草、白芥子、菟絲子、枳殼9味藥材經(jīng)水提、干燥、加輔料制成的中藥顆粒劑，具有溫經(jīng)通絡(luò)、補腎助陽功效，可有效預(yù)防和治療骨質(zhì)疏松[1-4]。為了更好的控制質(zhì)量，保證用藥安全，筆者對其進行了質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究，采用薄層色譜法，對制劑中各藥味進行薄層色譜鑒別，結(jié)果表明牛膝、補骨脂、枳殼薄層色譜鑒別特征比較明顯，重復(fù)性好，且無干擾，所以列入質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；此外，采取高效液相色譜法，對顆粒中枳殼所含柚皮苷和新橙皮苷進行含量測定，建立制劑中這2種成分的測定方法，并進行系列的方法學(xué)考察試驗，最終測定三批樣品中柚皮苷、新橙皮苷的含量，規(guī)定了含量限度[5-8]。通過以上相關(guān)研究，建立了溫腎通絡(luò)顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，為更好控制藥品質(zhì)量奠定了基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

LC-10AT型HPLC（日本島津）；SPD-10Av型HPLC檢測器（日本島津）；LCsolution Lite色譜工作站（日本）；XS105型電子分析天平（梅特勒-托利多，十萬分之一）；UV-2800型紫外可見分光光度計（上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司）；超聲清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司，250 W，頻率40 KHz）。對照品柚皮苷：中國食品藥品檢定研究院，批號：110753-201314，96.6%，供含量測定用；對照品新橙皮苷：中國食品藥品檢定研究院，批號：111857-201102，99.6%，供含量測定用；吉林省中醫(yī)藥科學(xué)院溫腎通絡(luò)顆粒（批號：170601、170602、170603）；甲醇為色譜純；其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層色譜鑒別

2.1.1 牛膝薄層色譜鑒別 取牛膝藥材20 g，研磨到細(xì)，加甲醇試劑50 mL，通過加熱回流的方法，加熱1 h后濾過，得到的濾液揮干，將其殘渣加蒸餾水到20 mL，通過加熱的方法將其溶解，溶解后放冷，用（飽和）正丁醇提?。?次），20 mL/次，合并3次提取液，用正丁醇飽、氨試液各50 mL洗1次，取正丁醇層液，蒸干后其殘渣加甲醇2 mL，作為供試品溶液。另外取對照藥材4 g，同法制成對照藥材溶液。照薄層色譜法，吸取樣品及對照品各5 μL，點于G型硅膠板上，展開劑為三氯甲烷-甲醇-水-甲酸（7:3:0.5:0.05），展開后取出晾干，噴顯色劑硫酸乙醇試液（10%），105℃加熱，加熱至斑點清晰。樣品與對照品在色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點，見圖1。

圖1 牛膝TLC鑒別

2.1.2 補骨脂薄層色譜鑒別 取補骨脂藥材10 g，研磨到細(xì)，先加甲醇50 mL，之后超聲30 min濾過，將濾液揮干后的殘渣加水20 mL，加熱，制冷，用水飽和正丁醇提?。?次），20 mL/次，合并正丁醇提取液，蒸干，殘渣加甲醇2 mL使溶解，作為供試品溶液。另取補骨脂對照藥材0.5 g，同法制成對照藥材溶液。照薄層色譜法，吸取上述2種溶液，各5 μL點于G型薄層板上，展開劑為正己烷-乙酸乙酯（4:1），展開取出，噴顯色劑氫氧化鉀甲醇溶液（10%），紫外光燈下365 nm進行檢視。樣品與對照品顯相同顏色的斑點，見圖2。

圖2 補骨脂TLC鑒別

2.1.3 枳殼薄層色譜鑒別 取枳殼藥材3 g，研磨至細(xì)，加入甲醇20 mL后超聲處理（30 min），濾過后蒸干濾液，殘渣加甲醇2 mL后作為供試品溶液。另對照品取柚皮苷、新橙皮苷，加甲醇后制成了0.5 mg/mL混合溶液，作為對照品溶液。吸取對照品和樣品上述兩種溶液各5 μL，點于同一硅膠G薄層板上，展開劑為三氯甲烷-甲醇-水（13:6:2）的下層溶液，展開后取出，晾干，噴顯色劑三氯化鋁乙醇溶液（3 %），在105 ℃加熱約5 min后進行紫外光燈檢視（365 nm）。樣品與對照品顯相同顏色的斑點，見圖3。

圖3 枳殼TLC鑒別

2.2 含量測定

2.2.1 色譜條件 色譜柱：Agilent Zorbax SB（4.6×150 mm，5 μm）；流動相：甲醇-0.1%磷酸溶液（33:67）；檢測波長為282 nm。理論板數(shù)（按柚皮苷峰）不低于3 000。

2.2.2 對照品溶液的制備 取一定量的對照品柚皮苷和新橙皮苷，精密稱定后加甲醇，各制成80 μg/mL的溶液，即得。

2.2.3 供試品溶液的制備 取本品適量研磨，精密稱定細(xì)粉1 g，加入具塞錐形瓶，再精密加入甲醇（50 mL），稱定重量后用超聲處理（功率250 w，頻率40 kHz）30 min，取出放冷后稱定重量，用甲醇補足丟失的重量后濾過，取續(xù)濾液，得到供試品。

2.2.4 方法學(xué)考察

2.2.4.1 線性范圍考察 精密稱取對照品柚皮苷、新橙皮苷，加甲醇制成各含0.295 1 mg/mL、0.311 2 mg/mL的混合溶液，精密吸取0.5 mL、1 mL、3 mL、5 mL、7 mL、9 mL，分別置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻。精密吸各個濃度對照品溶液（各10 μL），測定。橫坐標(biāo)為柚皮苷、新橙皮苷的含量，縱坐標(biāo)為峰面積，進行繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，柚皮苷在0.148～2.656 μg，新橙皮苷在0.156～2.8 μg范圍內(nèi)，對照品的量與峰面積積分值呈良好線性關(guān)系。回歸方程：柚皮苷Y= 1933513.8X，相關(guān)系數(shù)r = 0.999 8，新橙皮苷Y = 2041786.1X，相關(guān)系數(shù)r = 0.999 7。

2.2.4.2 穩(wěn)定性試驗 取一批供試品溶液，在0、2、4、8、12、24、36、48 h進樣10 μL，測定峰面積積分值。結(jié)果，在不同時間點測得的峰面積積分值分別如下。柚皮苷：1 266 140、1 274 072、1 291 201、1 309 236、1 269 335、1 282 508、1 278 546、1 299 005，RSD% =1.17；新橙皮苷：1 115 695、1 122 845、1 134 948、1 155 020、1 118 546、1 130 110、1 122 584、1 142 613、1 130 295，RSD% = 1.18，結(jié)果表明，2種成分在48 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.4.3 精密度考察 精密吸取2.2.3項下供試品溶液10 μL，按照色譜條件，對同一供試品溶液連續(xù)進樣6次，并測定峰面積積分值。結(jié)果，2種成分峰面積積分值分別為柚皮苷：1 229 694、1 240 047、1 249 650、1 240 109、1 233 526、1 237 798，RSD% = 1.45；新橙皮苷：1 085 590、1 091 630、1 101 921、1 094 612、1 089 216、1 092 289，RSD% = 1.42，說明儀器精密度良好。

2.2.4.4 重復(fù)性試驗 對同一批次溫腎通絡(luò)顆粒樣品按2.2.3項下方法制備供試品溶液，共6份，依法測定，6次測定結(jié)果分別為柚皮苷：3.052 0、3.084 6、3.073 0、3.091 1、2.990 6、2.996 2 mg/g，RSD% = 1.45；新橙皮苷：2.580 3、2.605 9、2.602 2、2.613 2、2.531 4、2.534 2、2.577 9 mg/g，RSD% = 1.42，測定結(jié)果表明，本方法重復(fù)性良好。

2.2.4.5 加樣回收率試驗 取已知含量溫腎通絡(luò)顆粒6份（批號：170601，柚皮苷、新橙皮苷含量30.419 9 mg/袋、25.893 1 mg/袋），分別精密加入柚皮苷、新橙皮苷對照品一定量，依法測定，計算回收率，柚皮苷平均回收率為99.62%，RSD% = 1.45；新橙皮苷平均回收率為97.61%，RSD% = 2.04，結(jié)果見表1。

表1 加樣回收率測定結(jié)果

2.2.4.6 樣品測定 依法測定3批溫腎通絡(luò)顆粒中試樣品中柚皮苷、新橙皮苷含量，結(jié)果見表2。

3 討論

3.1 薄層色譜鑒別 牛膝主要含有黃酮、甾酮、多糖、三萜、生物堿、有機酸等成分[9]。中國藥典2015版牛膝鑒別項下中用甲醇提取，蒸干加水溶解，通過上大孔樹脂柱除雜制備供試品溶液，但本品為復(fù)方顆粒成分較為復(fù)雜，所以導(dǎo)致了甲醇提取液蒸干后水溶液顏色非常深，雜質(zhì)也多，不宜選擇大孔樹脂柱除雜，故采用更為簡單徹底的除雜方法，即水溶后用正丁醇提取，采用氨試液洗滌，可除去大部分色素等雜質(zhì)，制備后的供試品溶液易于點樣，不黏稠。同時，香草醛試液和10%硫酸乙醇試液的顯色效果進行比較，10%硫酸乙醇試液顯色效果較好，在色譜特征中干擾雜質(zhì)斑點少，斑點清晰。在展開劑的選擇中，通過比較三氯甲烷-甲醇-水-甲酸（7：3：0.5：0.05）（《中國藥典》2015版（一部）牛膝鑒別項下新的展開系統(tǒng)）和乙酸乙酯-乙醇（4：1）[10]的展開效果研究發(fā)現(xiàn)，藥典中的展開劑分離效果更好。

表2 3批溫腎通絡(luò)顆粒中柚皮苷、新橙皮苷含量測定結(jié)果mg/袋

補骨脂主要含有香豆素、黃酮、萜酚等成分[11]。在制備供試品溶液的預(yù)實驗中，首先進行《中國藥典》2015年（一部）版補骨脂鑒別項下通過乙酸乙酯超聲提取的方法，制得的供試品溶液點樣困難，黏性太大，同時，薄層色譜中熒光斑點亮度弱，提取不完全；將采用甲醇提取，提取液蒸干加水溶解后用正丁醇提取，蒸干后加甲醇溶解，所制備的供試品溶液易于點樣，不黏稠。展開劑的篩選中除《中國藥典》2015版一部補骨脂鑒別項下及文獻[12]采用的正己烷-乙酸乙酯（4：1）外，還試驗比較了環(huán)己烷-乙酸乙酯-甲苯（2：0.7：2）和石油醚-乙酸乙酯（2：3）的展開效果，結(jié)果以中國藥典中補骨脂鑒別項下采用的正己烷-乙酸乙酯（4：1）展開效果最好，斑點清晰且重現(xiàn)性良好，無陰性干擾。

3.2 含量測定

3.2.1 專屬性試驗 在選定的色譜條件下，樣品色譜中待測成分峰前后無雜峰干擾，基本達(dá)到基線分離，結(jié)果見圖4。

圖4 溫腎通絡(luò)顆粒高效液相色譜圖

3.2.2 系統(tǒng)適用性試驗 在色譜柱和流動相的選擇中，試驗比較了如下幾種色譜柱和流動相的分離效果。色譜柱[13-14]：1）Agilent Zorbax SB C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；2）Shim pack C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；3）Waters symmetry C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；4）Apollo C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相[15-22]：1）甲醇-0.1%磷酸溶液（33：67）；2）甲醇-0.1%磷酸溶液（34：66）；3）乙腈-水（20：80）；4）乙腈-水（16：84）；5）乙腈-水（17：83）；6）乙腈-0.1%磷酸溶液（31：69），結(jié)果表明，除Waters symmetry C18色譜柱外，其余3種色譜柱配合甲醇-0.1%磷酸溶液（33：67）流動相，均能使樣品中柚皮苷、新橙皮苷與其他組分達(dá)到很好分離（分離度＞1.5），其中以Agilent Zorbax SB（4.6 mm×250 mm，5 μm）和甲醇-0.1%磷酸溶液（33：67）組合，分離效果最好，保留時間適宜，故作為本試驗的色譜條件。

3.2.3 耐用性試驗 取同一批號樣品，考察在測定條件有變動時對測定結(jié)果的影響程度。試驗主要考察了不同色譜柱、不同柱溫、不同流動相配比等變動因素對測定結(jié)果的影響。

3.2.3.1 色譜柱 本實驗選用WondSil C18、Apollo C18、Agilent ZORBAX SB-C18三個不同品牌的色譜柱進行測定，結(jié)果，測得樣品中柚皮苷含量分別為3.141 9、3.028 2、3.041 8；新橙皮苷含量分別為2.474 4、2.551 5、2.589 1 mg/g，2種成分含量無明顯變化。

3.2.3.2 柱溫 故采用ZORBAX SB-C18色譜柱，分別在20 ℃、30 ℃、35 ℃條件下測定，結(jié)果，測得樣品中柚皮苷含量分別為3.031 7、2.981 4、3.002 4 mg/g，新橙皮苷分別是2.573 0、2.538 5、2.567 9 mg/g，2種成分含量無明顯變化。

3.2.3.3 流動相 選擇甲醇-0.1%磷酸溶液（32：68）、甲醇-0.1%磷酸溶液（33：67）、甲醇-0.1%磷酸溶液（34：66）3個比例流動相進行考察，結(jié)果柚皮苷含量分別為3.056 5、3.050 2、3.026 7 mg/g，新橙皮苷含量分別是2.602 1、2.590 4、2.590 0 mg/g，含量無明顯變化。上述試驗結(jié)果表明，在色譜條件有微小變化時，樣品中柚皮苷、新橙皮苷含量無明顯變化，本方法有很好的耐用性。