田 蜜，陳 芳，賀建昌

（成都軍區(qū)昆明總醫(yī)院藥學(xué)部，昆明 650032）

黃七化瘀丸為醫(yī)院制劑，由黃芪、三七、丹參等13味中藥材制成，具有活血化瘀、補氣利水、調(diào)補肝腎的功效，用于各型肝硬化。經(jīng)臨床使用多年，有顯著的效果及良好的安全性。原有的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)僅建立了人參皂苷Rb1的含量測定方法，為了更好的控制制劑質(zhì)量，保證臨床用藥的安全有效，現(xiàn)對黃七化瘀丸的原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進行提升。本研究參考2015版《中國藥典》及有關(guān)文獻[1-10]，采用HPLC法測定其方中三七皂苷R1、人參皂苷Rg1及人參皂苷Rbl的含量，經(jīng)過方法學(xué)驗證，表明方法簡便，靈敏度高，重復(fù)性好。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 WATERS2695-2487型高效液相色譜儀；電子天平：BP121S，日本；超聲機：SY1200-T,上海聲源超聲波儀器設(shè)備有限公司；色譜柱：Symmetry C18 4.6×250 mm，5 μm；密理博純水機：Z00QSV001。

1.2 試藥 三七皂苷R1：中國食品藥品檢定研究院，110745-201318，含量94.0%；人參皂苷Rg1：中國食品藥品檢定研究院，110703-201529，含量95.0%；人參皂苷Rb1：中國食品藥品檢定研究院，110704-201424，含量93.7%；甲醇、乙醚、正丁醇、氨水、硅藻土為分析純；乙腈為色譜純。黃七化瘀丸（批號：14110、141007、141120）

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈-水為流動相梯度洗脫（見表1）；檢測波長為203 nm。理論板數(shù)分別按三七皂苷R1、人參皂苷Rg1及人參皂苷Rb1計不得少于2 500。

表1 流動相組成

2.2 樣品制備

2.2.1 對照品溶液的制備 精密稱取減壓至恒重的三七皂苷R1對照品適量，加甲醇制成每1 mL含0.2 mg的溶液；取人參皂苷Rg1及人參皂苷Rb1對照品適量，加甲醇制成每1 mL含0.5 mg的溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 取本品適量，切碎，精密稱取約2.5 g，加硅藻土1g研勻，置索氏提取器中，用甲醇提取至提取液無色，回收甲醇至干，殘渣加乙醚30 mL，浸泡5 min，傾去乙醚液，殘渣用水飽和正丁醇50 mL分次轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，加氨試液洗2次，5 mL/次，合并氨水液，用水飽和的正丁醇振搖提取2次，10 mL/次，合并正丁醇提取液。用正丁醇飽和的水洗滌2次，10 mL/次，合并水液，用水飽和的正丁醇10 mL振搖提取，合并前后2次的正丁醇提取液，蒸干，殘渣加甲醇定容至25 mL，用0.5 μm微孔濾膜濾過，作為供試品溶液。

2.2.3 陰性對照溶液的制備 取不含三七的陰性對照樣品按供試溶液制備方法同 法制備。

2.3 方法學(xué)研究

2.3.1 線性范圍考察 精密稱定三七皂苷R1、人參皂苷Rg1及人參皂苷Rbl對照品適量，分別用甲醇稀釋成 2.0 mg/mL、1.0 mg/mL、0.8 mg/mL、0.6 mg/mL、0.5 mg/mL、0.25 mg/mL、0.20 mg/mL、0.10 mg/mL、0.05 mg/mL的對照品溶液，注入高效液相色譜儀，測定其含量。以峰面積（A）為縱坐標(biāo)（Y），三七皂苷R1、人參皂苷Rg1及人參皂苷Rbl的濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)（X），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，分別得到回歸方程：Y = 467002X+7746.6，R2= 0.9997；Y= 60512X+4608.1，R2= 0.9977；Y = 409228X+6001.1，R2= 0.9995；結(jié)果顯示，黃七化瘀丸的三七皂苷R1、人參皂苷Rg1及人參皂苷Rbl含量在0.05～2.0 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3.2 專屬性試驗 將供試品溶液與陰性對照品溶液各10 μL，按照2.1 項下色譜條件進行實驗，色譜圖如下圖1～圖5。結(jié)果表明，陰性對照樣品在對照品主峰相應(yīng)位置無色譜峰，樣品與對照品主峰保留時間一致，說明該項檢測專屬性良好。

圖1 三七皂苷R1對照品HPLC色譜圖

圖2 人參皂苷Rg1對照品HPLC色譜圖

圖3 人參皂苷Rb1對照品HPLC色譜圖

圖4 黃七化瘀丸樣品（141120）HPLC色譜圖

圖5 陰性對照樣品HPLC色譜圖

2.3.3 精密度試驗 取濃度為21.675 μg/mL的對照品溶液連續(xù)測定6次，結(jié)果RSD 分別為3.51%、0.39%、2.62%，均小于4%。表明該法精密度良好。

2.3.4 重復(fù)性試驗 取同一批號（141120）樣品6份，照樣品制備方法制備測定，照上述色譜條件測定，結(jié)果RSD 分別為4.21%、7.99%、8.65%，均小于9%，表明該法重復(fù)性良好。

2.3.5 加樣回收試驗 精密稱取同一批（141120）樣品6份，分別加入一定量的對照品，按供試品溶液制備方法制備，各取10 μL進樣，計算加樣回收率，結(jié)果其平均回收率分別為100.8%、92.5%、98.3%，RSD%分別為6.42%、10.02%、14.82%，見表2～表4。表明該方法準(zhǔn)確可靠。

表2 三七皂苷R1加樣回收試驗結(jié)果

表3 人參皂苷Rg1加樣回收試驗結(jié)果

表4 人參皂苷Rb1加樣回收試驗結(jié)果

2.3.6 穩(wěn)定性研究 取供試品溶液（141107），分別在0，2，4，6，8 h進樣，記錄峰面積。結(jié)果峰面積平均值分別為 68 727、297 657、175 127.8 ，RSD為10.02% 、2.86%、4.30% ，表明供試品溶液在8 h內(nèi)較穩(wěn)定。

2.4 樣品含量測定 取三批樣品，每批樣品平行制樣2份進行含量測定，結(jié)果如表5。

表5 樣品含量測定結(jié)果 mg/g

3 討論

含量限度指標(biāo)的確定：從3批樣品測定結(jié)果看，三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1的平均值分別為0.68 mg/g、2.10 mg/g、1.76 mg/g，其80%分別為0.68 mg/g×80% = 0.55 mg/g、2.10 mg/g×80% =1.68 mg/g、1.76 mg/g×80% = 1.41 mg/g，合計為0.5+1.6+1.4 = 3.5 mg/g。即本品含三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1每克不得少于3.5 mg。

原建立的含量測定方法僅測定了人參皂苷Rb1的含量，指標(biāo)成分單一，參考《中國藥典》2015年版一部“三七”項下，增加了三七皂苷R1；人參皂苷Rg1的含量測定，并對原測定方法進行了優(yōu)化，結(jié)果提示能更好的控制黃七化瘀丸的制劑質(zhì)量。

《中國藥典》2015年版一部“三七”項下，含量測定也采用HPLC 法，以乙腈∶水為流動相測定，但是其檢測時間長達60 min，本方法在大約20 min即可檢測完成，大大節(jié)約了時間，且靈敏度高，重復(fù)性好?！吨袊幍洹?015年版一部“三七”項下，采用甲醇溶液直接提取，本方法采用甲醇提取后用氨試液、乙醚溶液、水飽和的正丁醇溶液進行萃取分離后測定，減少了非目標(biāo)成分的影響，為其他含有三七藥材的成方制劑的含量測定提供了參考。