龍聲志，吳賢波，朱海燕，陳 林，謝毅強(qiáng)，楊 帆

（1.貴陽中醫(yī)學(xué)院研究生院，貴陽 550002；2.成都醫(yī)學(xué)院附屬新都中醫(yī)院，成都 610500；3.成都醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科，成都 610500；4.海南醫(yī)學(xué)院中醫(yī)學(xué)院，?？?571199）

哮喘是常見的慢性呼吸系統(tǒng)疾病，嚴(yán)重危害人類健康。氣道重塑是哮喘發(fā)病機(jī)制中的重要環(huán)節(jié)，氣道平滑肌細(xì)胞（Airway smooth muscle cells，ASMCs）的異常增殖與細(xì)胞周期的異常調(diào)節(jié)在哮喘氣道重塑過程中具有重要意義。ASMCs的增殖能使氣道壁增厚，導(dǎo)致支氣管對刺激的收縮反應(yīng)增強(qiáng)，進(jìn)一步加重氣道高反應(yīng)性。高偉良等[1]發(fā)現(xiàn)哮喘氣道重構(gòu)時，ASMCs增殖分裂活動活躍，增殖狀態(tài)下的細(xì)胞比例增多。因此，抑制ASMCs異常增殖、調(diào)控細(xì)胞周期轉(zhuǎn)換對控制哮喘氣道重塑極其重要。防風(fēng)-烏梅作為藥對配伍具有祛風(fēng)解痙、斂肺生津功用，源于《祝諶予經(jīng)驗(yàn)集》過敏煎中的君臣配伍[2]，常被用來治療支氣管哮喘、蕁麻疹等過敏性疾患。課題組前期動物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，防風(fēng)-烏梅配伍可能通過抑制支氣管平滑肌肥厚、減少相關(guān)活性物質(zhì)分泌，進(jìn)而抑制小鼠哮喘模型氣道重塑。此次研究采用血小板衍生因子（Platelet derived growth factor，PDGF）來誘導(dǎo)人支氣管平滑肌細(xì)胞（Human bronchial smooth muscle cells，HBSMC）增殖，觀察中藥防風(fēng)-烏梅配伍對HBSMC增殖與細(xì)胞周期的影響，并從腫瘤壞死因子-α（Tumor necrosis factoralpha，TNF-α）、白細(xì)胞介素 -8（Interleukin-8，IL-8）的分泌情況，探討防風(fēng)-烏梅對HBSMC增殖與細(xì)胞周期的作用機(jī)制，為進(jìn)一步研究中藥配伍對氣道重塑的抑制機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 動物 雄性SPF級SD大鼠20只，購于上海富萊生物科技有限公司，體質(zhì)量220～250 g，合格證編號：2015000525917。

1.2 藥物 中藥防風(fēng)、烏梅購于成都杏林大藥房，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室盧先明教授鑒定，防風(fēng)為傘形科植物防風(fēng)Saposhnikovia divaricata（Turcz.）Schischk.的干燥根；烏梅為薔薇科植物烏梅Prunus mume（Sieb.）Sieb.et Zucc的干燥成熟果實(shí)。防風(fēng)、烏梅（臨床成人用量均為15 g/d），防風(fēng)-烏梅（臨床成人用量為30 g/d，防風(fēng)、烏梅劑量比為1:1）；吸入用布地奈德混懸液購于AstraZeneca公司，Lot 320341。

1.3 主要試劑及儀器 細(xì)胞系來源：HBSMC，細(xì)胞株購自Sineell公司，Catalog b3400。試劑：高糖DMEM培養(yǎng)基（Shanghai BasalMedia Technologies Co，LTD.，批號：L110）、PDGF（sino Biological，批號：10572-H07Y）、CCK-8試 劑 盒（Beyotime， 批 號：C0038）、細(xì)胞周期檢測試劑盒（Beyotime，批號：iC1052）、TNF-α ELISA Kit （ LIUHEBIO，批號：LHE10183HU）、IL-8 ELISA Kit （LIUHEBIO， 批 號：LH-E10104HU）。儀器：超凈臺（蘇州凈化設(shè)備有限公司，型號：SW-CJ-1D）、相差顯微鏡（OLYMPAS，型號：IX71）、CO2培養(yǎng)箱（Thermo fisher，型號：3111）、離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司，型號：L400）、流式細(xì)胞儀（BD Bioscience，型號：FACS Calibur）、酶標(biāo)儀（深圳雷杜生命科學(xué)股份有限公司，型號：RT-6100）。

1.4 含藥血清的制備 取雄性SD大鼠20只，根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為空白對照組、防風(fēng)組、烏梅組、防風(fēng)-烏梅組[按生藥15.425 g/（kg·d）、15.425 g/（kg·d）、30.850 g/（kg·d）藥液灌胃 ]，按實(shí)驗(yàn)動物與人體標(biāo)準(zhǔn)體質(zhì)量計(jì)算公式換算給藥劑量，空白組給予生理鹽水，3次/d，1 mL/次，給藥3天后禁食8 h，第4天末次給藥1 h后予7%水合氯醛麻醉，無菌操作下打開腹腔，于腹主動脈取血。血樣常溫放置1 h，2 000 rpm離心15 min，0.22 μm微孔濾膜過濾，分裝于EP管中，- 20 ℃保存。使用前合并各組血清，56 ℃水浴滅活30 min。

1.5 細(xì)胞模型建立 參照王超智等[3]方法通過20 ng/mL PDGF刺激誘導(dǎo)HBSMC增殖。取4代對數(shù)生長期的HBSMC，胰酶消化后以5×104細(xì)胞密度接種于培養(yǎng)版，37 ℃5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。細(xì)胞融合度為70%～80%時，更換DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，使細(xì)胞同步化于G0期。

1.6 細(xì)胞分組 按下列分組對細(xì)胞進(jìn)行相應(yīng)處理：空白對照組（10%FBS、DMEM）；細(xì)胞模型組（20 ng/mL PDGF、10%FBS、DMEM）；正常大鼠血清組（10%正常大鼠血清、DMEM）；正常大鼠血清細(xì)胞模型組（10%正常大鼠血清、20 ng/mL PDGF、DMEM）；激素干預(yù)組（10-6mol/L布地奈德、20 ng/mL PDGF、DMEM）；防風(fēng)血清組（10%防風(fēng)血清、20 ng/mL PDGF、DMEM）；烏梅血清組（10%烏梅血清、20 ng/mL PDGF、DMEM）；防風(fēng)-烏梅血清組（10%防風(fēng)-烏梅血清、20 ng/mL PDGF、DMEM），37 ℃ 5%CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。

1.7 CCK-8檢測HBSMC增殖情況 種板前確保細(xì)胞狀態(tài)良好，將處于對數(shù)生長期的HBSMC用胰酶消化后，完全培養(yǎng)基重懸成為細(xì)胞懸液，將其傳代至96孔板里，每孔的細(xì)胞密度為5×103，配制5%、10%、20%三個不同濃度的防風(fēng)血清、烏梅血清、防風(fēng)-烏梅血清分別和20 ng/mL含PDGF的DMEM完全培養(yǎng)基作用于細(xì)胞48 h后，使用CCK-8試劑盒檢測細(xì)胞活力；選取藥物血清抑制細(xì)胞增殖的效果最好的藥物濃度，分別作用于細(xì)胞24、48、72 h后，使用CCK-8試劑盒檢測細(xì)胞活力。

1.8 流式細(xì)胞檢測細(xì)胞周期 胰酶消化對數(shù)生長期的目的細(xì)胞后，完全培養(yǎng)基重懸成細(xì)胞懸液，傳代至6孔板里，每孔密度為1×106，次日給細(xì)胞加藥（根據(jù)MTT實(shí)驗(yàn)篩選的濃度），培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞，加入預(yù)冷的70%乙醇（PBS配制），4 ℃固定過夜，離心收集細(xì)胞，以1 mL預(yù)冷的PBS洗細(xì)胞一次，加入預(yù)冷的 PBS重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1.0×106，取出100 μL細(xì)胞懸液，加入RNase A酶，使RNase A終濃度為1 mg/mL，混勻后37 ℃水浴30 min，加入PI綜合染色液，使PI終濃度為50 μg/mL，混勻，流式細(xì)胞儀檢測。

1.9 Elisa技術(shù)檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TNF-α、IL-8表達(dá) 具體操作分別按照TNF-α ELISA Kit、IL-8 ELISA Kit 使用說明書嚴(yán)格操作，測出吸光度，描繪標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算濃度。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 16.0分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組均數(shù)比較用單因素方差分析（One-way ANOVA）和LSD法，方差不齊則使用Dunnetts T3法，P＜ 0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 防風(fēng)-烏梅含藥血清對HBSMC細(xì)胞增殖能力的影響 見圖1。

圖1 防風(fēng)-烏梅含藥血清對HBSMC細(xì)胞增殖能力的影響

2.2 防風(fēng)-烏梅含藥血清對HBSMC細(xì)胞增殖率的影響 見表1。

表1 防風(fēng)-烏梅含藥血清對HBSMC細(xì)胞增殖率的影響（±s，n = 8） %

表1 防風(fēng)-烏梅含藥血清對HBSMC細(xì)胞增殖率的影響（±s，n = 8） %

注：與細(xì)胞模型組、正常大鼠血清細(xì)胞模型組比較，# P＜0.05；與防風(fēng)-烏梅血清組、激素干預(yù)組比較，△P＜0.05

組 別 增殖率空白對照組 100.00±2.71#△細(xì)胞模型組 138.05±5.5△正常大鼠血清組 93.60±1.34#△正常大鼠血清細(xì)胞模型組 139.55±4.05△激素干預(yù)組 116.50±2.45#防風(fēng)血清組 132.71±3.18△烏梅血清組 126.20±3.76#△防風(fēng)-烏梅血清組 115.57±3.68#

2.3 防風(fēng)-烏梅含藥血清對HBSMC細(xì)胞周期的影響 見表2。

表2 防風(fēng)-烏梅含藥血清對HBSMC細(xì)胞周期的影響（±s，n = 8）

表2 防風(fēng)-烏梅含藥血清對HBSMC細(xì)胞周期的影響（±s，n = 8）

注：與細(xì)胞模型組、正常大鼠血清細(xì)胞模型組比較，# P＜0.05；與防風(fēng)-烏梅血清組、激素干預(yù)組比較，△P＜0.05

組 別 G0/G1 G2/M S空白對照組 73.05±1.01#△ 3.53±.078#△ 23.42±1.61#△細(xì)胞模型組 55.12±1.08△ 13.54±0.80△ 31.35±1.81△正常大鼠血清組 74.57±0.88#△ 4.14±0.19#△ 21.29±0.75#△正常大鼠血清細(xì)胞模型組 54.39±0.97△ 10.93±0.68△ 34.69±1.44△激素干預(yù)組 62.18±0.86# 10.81±1.37 27.01±1.68#防風(fēng)血清組 62.29±0.87# 6.93±0.78#△ 30.79±1.22△烏梅血清組 72.80±1.16#△ 5.76±0.94#△ 21.44±2.08#防風(fēng)-烏梅血清組 63.99±1.54# 13.49±0.88 22.53±1.81#

2.4 防風(fēng)-烏梅含藥血清對HBSMC TNF-α、IL-8表達(dá)的影響 見表3。

表3 防風(fēng)-烏梅含藥血清對HBSMC TNF-α、IL-8表達(dá)的影響（±s，n = 8） pg/mL

表3 防風(fēng)-烏梅含藥血清對HBSMC TNF-α、IL-8表達(dá)的影響（±s，n = 8） pg/mL

注：與細(xì)胞模型組、正常大鼠血清細(xì)胞模型組比較，# P＜0.05；與防風(fēng)-烏梅血清組、激素干預(yù)組比較，△P＜0.05

組 別 TNF-α IL-8空白對照組 129.28±1.27#△ 198.74±5.42#△細(xì)胞模型組 984.22±45.84△ 2031.16±69.51△正常大鼠血清組 148.47±19.36#△ 230.22±25.81#△正常大鼠血清細(xì)胞模型組 920.40±44.77△ 2117.72±86.75△激素干預(yù)組 460.30±66.72# 509.12±57.76#防風(fēng)血清組 885.53±1.46△ 794.04±27.33#△烏梅血清組 862.95±17.25△ 847.26±89.23#△防風(fēng)-烏梅血清組 640.60±1.48# 554.45±48.04#

3 討論

哮喘是由多種細(xì)胞及其細(xì)胞組分參與的慢性氣道炎癥，ASMCs增殖在哮喘氣道重塑形過程中具有十分重要的地位[4]。氣道重塑會出現(xiàn)ASMCs增生、肥大、細(xì)胞間質(zhì)重塑等病理改變，哮喘發(fā)作時ASMCs作為重要的效應(yīng)細(xì)胞，在多種細(xì)胞因子、炎性介質(zhì)的作用下產(chǎn)生收縮、增殖、遷移等一系列生物學(xué)效應(yīng)[5]。研究[6-7]發(fā)現(xiàn)PDGF可促進(jìn)ASMCs釋放炎癥因子和細(xì)胞因子，導(dǎo)致氣道重塑和氣道高反應(yīng)性，進(jìn)而又引起炎性細(xì)胞募集并活化，擴(kuò)大炎癥反應(yīng)，繼續(xù)影響ASMCs增殖，故常用其誘導(dǎo)ASMCs增值。本研究結(jié)果表明，細(xì)胞模型組、正常大鼠血清細(xì)胞模型組細(xì)胞增殖能力相比空白對照組、正常大鼠血清組明顯提高（P＜0.05），提示PDGF刺激HBSMC可使其細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)，與上述研究相符；各給藥組均表現(xiàn)出對細(xì)胞增殖能力的抑制作用，而防風(fēng)-烏梅血清組與激素干預(yù)組的抑制效果要優(yōu)于防風(fēng)血清組和烏梅血清組（P＜0.05），提示防風(fēng)-烏梅配伍含藥血清能更好抑制ASMCs增值。細(xì)胞周期調(diào)節(jié)對細(xì)胞增殖起著重要的作用[8]，哮喘發(fā)作時，胞外各種絲裂原可通過不同的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑促進(jìn)ASMCs增殖，若能阻斷細(xì)胞完成細(xì)胞分裂周期，便能達(dá)到控制或逆轉(zhuǎn)氣道重塑的目的[9]。細(xì)胞周期具有兩個關(guān)鍵限制點(diǎn)，即G1/S期和G2/M期[10]，決定了細(xì)胞周期進(jìn)程的速度和方向，準(zhǔn)確、有序地進(jìn)出各個周期時相是細(xì)胞正常生長、代謝的關(guān)鍵。一般情況下，細(xì)胞無增殖活動時皆停留于G0期，在絲裂原等因素刺激下，一些細(xì)胞進(jìn)入S期，通過G2期及M期，即進(jìn)入增殖周期。本研究結(jié)果表明，各給藥組均能增加G0/G1期細(xì)胞比例，以烏梅血清組最佳，烏梅血清組與防風(fēng)-烏梅血清組能顯著減少S期細(xì)胞數(shù)，提示烏梅血清組與防風(fēng)-烏梅血清組均能阻滯細(xì)胞周期進(jìn)展。

ASMCs是各種炎癥細(xì)胞因子、趨化因子的來源。TNF-α是一種重要的促炎細(xì)胞因子，在哮喘氣道病理學(xué)中發(fā)揮重要作用，是難治性哮喘中重要潛在因素[11]。TNF-α可用來誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞（VSMCS）增殖[12]，促進(jìn)VSMC由G0/G1期進(jìn)入S期[13-14]。哮喘患者存在較高的TNF-α的表達(dá)，刺激ASMCs，引起平滑肌的增生肥厚，參與調(diào)節(jié)哮喘細(xì)胞免疫，哮喘緩解時TNF-α又會恢復(fù)至正常水平[15]。IL-8是炎性趨化因子，能促進(jìn)ASMCs增殖參與氣道重塑[16]，吸引中性粒細(xì)胞、T細(xì)胞向炎癥部位聚集，對中性粒細(xì)胞的趨化及激活作用可導(dǎo)致氣道反應(yīng)性增高誘發(fā)加重哮喘[17-18]。IL-8還能通過影響細(xì)胞周期的重新分布來調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖[19]。氣道中性粒細(xì)胞積聚是哮喘急性發(fā)作的重要標(biāo)志，IL-8、TNF-α在一定程度上能反映哮喘患者炎癥的嚴(yán)重程度[20]。本研究結(jié)果表明，PDGF刺激HBSMC可使IL-8、TNF-α釋放增多，炎癥反應(yīng)增強(qiáng)，影響細(xì)胞周期，加重細(xì)胞增殖，各給藥組均有一定抑制作用，以防風(fēng)-烏梅含藥血清組與激素干預(yù)組抑制作用較強(qiáng)，提示防風(fēng)-烏梅含藥血清能顯著降低IL-8、TNF-α的釋放量。

祝老常用防風(fēng)-烏梅作為藥對配伍，用于支氣管哮喘的治療[2]。防風(fēng)善于疏風(fēng)勝濕止痙，《本草綱目》稱其為“除風(fēng)去濕仙藥”，《藥類法象》言其能“瀉肺實(shí)……除上焦邪”；烏梅斂肺生津，可瀉風(fēng)木而降沖擊，《本草綱目》用其療治久咳不已。二藥相配，相制相成，相須為用，祛邪不耗氣津，斂酸不留邪，能顯著改善哮喘氣道攣急之病理。本研究結(jié)果表明，防風(fēng)-烏梅含藥血清與激素對于HBSMC增殖，IL-8、TNF-α釋放的抑制作用優(yōu)于單獨(dú)使用防風(fēng)血清或單獨(dú)使用烏梅血清，雖對細(xì)胞G0/G1期的抑制作用不及烏梅血清，但也表現(xiàn)出對細(xì)胞周期的阻滯作用，提示防風(fēng)-烏梅配伍可能通過降低IL-8、TNF-α的釋放影響ASMCs細(xì)胞周期進(jìn)程及增殖，進(jìn)而抑制哮喘氣道重塑。

由于長期使用激素會給機(jī)體帶來一定的危害[21-23]，療效性與安全性還存在爭議[24-28]，故挖掘利用中醫(yī)藥研究藥對配伍規(guī)律不失為治療哮喘的一種新方法。至于為何細(xì)胞G0/G1期時烏梅組效果最優(yōu)，其原因還需更進(jìn)一步研究。