白 妮，張紅梅，劉 杰

(1.延安市中醫(yī)醫(yī)院，延安 716000；2.延安市疾病預(yù)防控制中心，延安 716000)

土地海苓煎顆粒為延安市中醫(yī)醫(yī)院制劑室按照經(jīng)驗(yàn)方獨(dú)家生產(chǎn)品種，批準(zhǔn)文號為陜藥管制字[2001]第3694號。原方由黃芩、知母、豬苓及枳實(shí)等12味中藥組成；臨床主治濕熱下注所致之小便淋漓、灼熱、澀痛或尿頻尿急、小腹脹滿、腰困腰痛等癥。

土地海苓煎顆?，F(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)鑒別項(xiàng)僅有黃芩苷的TLC鑒別，專屬性不強(qiáng)，為完善該制劑的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)、提高患者用藥安全性，筆者對方中主要藥效成分進(jìn)行了TLC鑒別，最終選取了3種分離度較好、斑點(diǎn)清晰、重復(fù)性好的成分列入質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。參考有關(guān)文獻(xiàn)[1-18]，在大量實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，首次采用雙波長法同時(shí)測定土地海苓煎顆粒中芒果苷和辛弗林的含量，作為本制劑的定量指標(biāo)。

1 儀器與試藥

1.1儀器 LC-20AT島津高效液相色譜儀(日本島津公司)；超聲波清洗器(上海安寧科學(xué)儀器公司)；TG328B分析天平(上海精科天平有限公司，精密度0.1 mg)。

1.2試藥 芒果苷對照品(批號131507-201402，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.6%)，辛弗林對照品(批號140716-201306，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.7%,中國食品藥品檢定研究院)；土地海苓煎顆粒(延安市中醫(yī)醫(yī)院，批號分別為：20161107，20161212，20170224，20170319，20170424，20170513，20170606，20170711，20170810和20170903，規(guī)格：12 g·袋-1)。

2 方法與結(jié)果

2.1TLC鑒別

2.1.1知母 取土地海苓煎顆粒48 g，研成細(xì)粉，加稀乙醇100 mL，超聲處理30 min，取濾液，蒸干，加乙醇1 mL使溶解，作為供試品溶液。稱取芒果苷對照品，用稀乙醇制成質(zhì)量濃度為0.5 mg·mL-1的對照品溶液；取缺知母的樣品顆粒，按照供試品溶液制備方法制得陰性樣品溶液。吸取上述3種溶液各15 μL，點(diǎn)于同一硅膠薄層板上，以甲苯-正丁醇-甲酸(3.5∶4∶5)為展開劑，展開，晾干，置于紫外光燈365 nm處檢視[9]。供試品色譜中，在與對照色譜相應(yīng)位置上，顯相同的藍(lán)色斑點(diǎn)。陰性樣品無斑點(diǎn)。結(jié)果見圖1A。

2.1.2豬苓 取土地海苓煎顆粒48 g，研成細(xì)粉，加甲醇80 mL，超聲處理30 min，將濾液蒸干，用1 mL甲醇溶解，作為供試品溶液。稱取麥角甾醇對照品，用甲醇制成質(zhì)量濃度為1.0 mg·mL-1的對照品溶液。取缺豬苓的樣品顆粒，按照供試品溶液制備方法制得陰性樣品溶液。吸取上述3種溶液各20 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠薄層板上，以石油醚-乙酸乙酯(13∶1)為展開劑，展開，晾干，噴20 mL·L-1香草醛硫酸溶液，顯色，加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的紫色斑點(diǎn)。陰性樣品無此斑點(diǎn)。結(jié)果見圖1B。

2.1.3枳實(shí) 取土地海苓煎顆粒48 g，研成細(xì)粉，加甲醇80 mL，超聲處理30 min，將濾液蒸干，用1 mL甲醇溶解，作為供試品溶液。稱取辛弗林對照品，用甲醇制成質(zhì)量濃度為2 mg·mL-1的對照品溶液。取缺枳實(shí)的樣品顆粒，按照供試品溶液的制備方法制得陰性樣品溶液。吸取上述3種溶液各20 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠薄層板上，以正丁醇-冰醋酸-水(4∶1∶5)的上層溶液為展開劑，展開，以質(zhì)量濃度為5 g·L-1的茚三酮乙醇液為顯色劑，加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。在供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同紫紅色的斑點(diǎn)。陰性樣品無此斑點(diǎn)。結(jié)果見圖1C。

圖1TLC圖

A:1.陰性樣品；2～4.供試品；5.芒果苷對照品。B:1.陰性樣品；2～4.供試品；5.麥角甾醇對照品。C:1.陰性樣品；2～4.供試品；5.辛弗林對照品。

Fig.1 TLC chromatograms

A:1.negative sample；2-4.sample；5.mangiferin.B:1.negative sample;2-4.sample;5.ergosterol.C:1.negative sample;2-4.sample;5.synephrine.

2.2含量測定

2.2.1色譜條件 色譜柱：島津Shim-pack VP-ODS C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：乙腈(B)-水(A∶1 000 mL水中加入磷酸二氫鉀0.6 g、十二烷基磺酸鈉1.0 g和冰醋酸1.0 mL)，作梯度洗脫，0→30 min，50%B→80%B；流速：0.8 mL·min-1；檢測波長：258和285 nm；柱溫：30 ℃；在上述色譜條件下，2種待測組分均達(dá)到了基線分離。理論塔板數(shù)以芒果苷和辛弗林計(jì)均≥6 000；分離度>1.5；進(jìn)樣量：10 μL。

2.2.2溶液的制備 對照品溶液：精密稱取芒果苷和辛弗林對照品適量，置于10 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，分別制成質(zhì)量濃度分別為150和750 mg·L-1的對照品溶液。

混合對照品溶液：精密稱取芒果苷和辛弗林對照品適量，置于10 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成芒果苷和辛弗林質(zhì)量濃度分別為150和750 mg·L-1的混合對照品溶液。

供試品溶液：精密稱取土地海苓煎顆粒10.0 g，研細(xì)，置于50 mL量瓶中，加甲醇適量，超聲處理30 min，再加甲醇定容至刻度，過濾，即得。

陰性樣品溶液：按照處方比例及制備工藝，分別制備缺知母和枳實(shí)的陰性樣品，按照上述供試品溶液制備方法制得陰性樣品。

2.2.3專屬性實(shí)驗(yàn) 取2.2.2項(xiàng)下制備的對照品溶液、供試品溶液及陰性樣品溶液各10 μL，注入液相色譜測定儀，記錄色譜圖，結(jié)果顯示，陰性樣品對測定無干擾。見圖2。

圖2HPLC圖

A.芒果苷對照品(258 nm)；B.辛弗林對照品(285 nm)；C.供試品(258 nm)；D.供試品(285 nm)；E.缺知母陰性樣品(258 nm)；F.缺枳實(shí)陰性樣品(285 nm)；1.芒果苷；2.辛弗林。

Fig.2 HPLC chromatograms

A.mangiferin control (258 nm)；B.synephrine control (285 nm)；C.test sample (258 nm)；D.test sample (285 nm)；E.negative sample of missingAnemarrhenae(258 nm)；F.negative sample of missingFructusaurantiiimmaturus(285 nm)；1.mangiferin；2.synephrine.

2.2.4線性關(guān)系考察 分別精密吸取對照品溶液，用甲醇倍比稀釋，配制芒果苷質(zhì)量濃度分別為150.0，75.0，37.5，18.8，9.4和4.7 mg·L-1的系列對照品溶液；辛弗林配成質(zhì)量濃度分別為750.0，375.0，187.5，93.8和46.9 mg·L-1的系列對照品溶液，進(jìn)樣測定，記錄色譜峰。以芒果苷、辛弗林的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x)、峰面積為縱坐標(biāo)(y)，進(jìn)行回歸分析，得芒果苷和辛弗林的線性方程分別為：y1=2.274 6x1-11.654(r1=0.999 9)和y2=0.443 2x2-3.109 7(r2=0.999 9)；芒果苷和辛弗林的線性范圍分別為4.7～150.0和46.9～750.0 mg·L-1，與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.2.5精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取芒果苷和辛弗林混合對照品溶液，注入液相色譜儀，連續(xù)進(jìn)樣6次，芒果苷和辛弗林的峰面積RSD值分別為1.34%和1.14%。結(jié)果表明，所選儀器精密度良好。

2.2.6穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液，分別在0，2，4，6，8，10，12和24 h進(jìn)樣，測定樣品中芒果苷和辛弗林的峰面積，結(jié)果芒果苷和辛弗林的RSD值分別為2.36%和2.45%，結(jié)果表明，供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.7重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 精密稱取土地海苓煎顆粒10.102，10.113，10.245，10.018，10.124和10.112 g，按照2.2.2項(xiàng)下方法制備溶液，并按照2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定。樣品中芒果苷和辛弗林的平均含量(n=6)分別為0.058和2.418 mg·g-1；RSD值分別為1.56%和1.48%，結(jié)果表明，該方法重復(fù)性良好。

2.2.8回收率實(shí)驗(yàn) 取6份已知含量的土地海苓煎顆粒，加入2.2.2項(xiàng)下制備的對照品溶液適量，進(jìn)行色譜分析，記錄峰面積，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表1。

表1回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

Tab.1 Results of recovery test (n=6)

2.2.9含量測定 取10個(gè)批次的土地海苓煎顆粒，按照2.2.2項(xiàng)下方法制備溶液，精密吸取對照品溶液和供試品溶液，注入液相色譜儀，按照2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，用外標(biāo)法計(jì)算樣品中芒果苷和辛弗林的含量，結(jié)果見表2。

表2不同批次土地海苓煎顆粒中芒果苷和辛弗林的含量測定結(jié)果

Tab.2 Content determination of mangiferin and synephrine in Tudihailingjian granules from different batches

(n=10)

3 討論

土地海苓煎顆粒的TLC鑒別中考察了不同極性組合的二元系統(tǒng)展開劑，最終確定的方法重復(fù)性和專屬性較好，可快速、有效地對土地海苓煎顆粒質(zhì)量進(jìn)行控制。HPLC法對成分較復(fù)雜的中藥具有良好的分離效果，且能有效提高樣品的分析效率[10-18]。本實(shí)驗(yàn)采用HPLC法測定土地海苓煎顆粒中芒果苷和辛弗林的含量，結(jié)果表明，該法操作簡便、重復(fù)性好，分離度好，分析時(shí)間短。

從土地海苓煎顆粒的紫外掃描圖可知，辛弗林和芒果苷的最大吸收波長分別為285和258 nm，因此本實(shí)驗(yàn)采用二極管陣列檢測器[19]，使用雙波長法同時(shí)快速地對土地海苓煎顆粒中2種成分的含量進(jìn)行測定。

本實(shí)驗(yàn)所建立的土地海苓煎顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)TLC法專屬性強(qiáng)，分離度好，斑點(diǎn)顯色清晰；HPLC法分析時(shí)間短，準(zhǔn)確度高，重復(fù)性好。較現(xiàn)行土地海苓煎顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)有較大提高，可用于土地海苓煎顆粒的質(zhì)量控制。