方藝霖，余敏靈

(四川省樂(lè)山市食品方法檢驗(yàn)檢測(cè)中心,樂(lè)山 614000)

近年來(lái)，隨著中藥材產(chǎn)業(yè)化發(fā)展，農(nóng)藥污染問(wèn)題日益嚴(yán)重。中藥材種植及中藥飲片加工、儲(chǔ)存過(guò)程中農(nóng)藥的不當(dāng)使用，均會(huì)影響中藥飲片的質(zhì)量，嚴(yán)重危害人體健康?！吨袊?guó)藥典》2015年版四部收載了多種農(nóng)藥殘留量的氣相色譜檢查方法[1]。目前對(duì)農(nóng)藥殘留量研究報(bào)道的文獻(xiàn)多以氣相色譜法、液相色譜法、氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法及液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法為主[2-11]，但都存在對(duì)照品獲得困難、操作繁瑣或多指標(biāo)檢測(cè)成本高等問(wèn)題。浙貝母收載于《中國(guó)藥典》2015年版一部，具有清熱、化痰、止咳、解毒、散結(jié)和消癰的功效[12]，目前關(guān)于浙貝母的文獻(xiàn)報(bào)道多以藥理研究為主，還未見(jiàn)應(yīng)用GC-MS/MS法測(cè)定其多種農(nóng)藥殘留量的文獻(xiàn)報(bào)道。本文應(yīng)用GC-MS/MS法，根據(jù)色譜保留時(shí)間和質(zhì)荷比信息對(duì)樣品進(jìn)行定性分析，以聯(lián)苯菊酯二級(jí)離子掃描色譜峰(181.1/166.1)面積作為參照，計(jì)算其與甲氰菊酯二級(jí)離子掃描色譜峰(265.1/210.1)面積和溴氰菊酯二級(jí)離子掃描色譜峰(252.9/93.0)面積的校正因子，建立GS-MS/MS法測(cè)定浙貝母中聯(lián)苯菊酯等3種農(nóng)藥殘留量的一測(cè)多評(píng)法，以期為GC-MS/MS法測(cè)定中藥中農(nóng)藥殘留量提供一測(cè)多評(píng)[13-14]研究思路。

1 儀器與試藥

1.1儀器 GCMS-TQ8030氣質(zhì)聯(lián)用儀，Lab Solutions/GCMS solutions 4.20版本工作站(島津中國(guó)科技有限公司)；XS205 DualRange 型電子天平(瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司)

1.2試藥 浙貝母樣品購(gòu)于樂(lè)山中藥材有限公司，按照《中國(guó)藥典》2015年版鑒定為百合科植物浙貝母FritillariaThunbergiiMiq.的干燥鱗莖，樣品批號(hào)分別為20170901，20170902和20170903。聯(lián)苯菊酯、甲氰菊酯和溴氰菊酯對(duì)照品溶液(規(guī)格：100 μg·mL-1，批號(hào)分別為：GSB05-2333-2016，GSB05-2306-2016和GSB05-2310-2016，農(nóng)業(yè)部環(huán)境監(jiān)測(cè)保護(hù)研究所)；Cleanert TPH凈化柱(天津博納艾潔爾公司)；乙腈、丙酮為色譜純，氯化鈉、無(wú)水硫酸鈉為優(yōu)級(jí)純，水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1測(cè)定原理 以聯(lián)苯菊酯為對(duì)照品測(cè)定樣品中3種農(nóng)藥殘留的原理是利用樣品色譜圖中聯(lián)苯菊酯、甲氰菊酯和溴氰菊酯的色譜峰相對(duì)保留時(shí)間進(jìn)行定位以及二級(jí)離子碎片圖譜碎片離子峰和豐度比對(duì)聯(lián)苯菊酯、甲氰菊酯和溴氰菊酯色譜峰進(jìn)行定性分析。在定量分析時(shí)，通過(guò)精密量取聯(lián)苯菊酯、甲氰菊酯和溴氰菊酯對(duì)照品溶液各適量，配制成不同質(zhì)量濃度的混合溶液，按照設(shè)定條件進(jìn)樣，記錄色譜圖，繪制進(jìn)樣量對(duì)其峰面積的回歸曲線，以聯(lián)苯菊酯回歸曲線斜率與甲氰菊酯和溴氰菊酯回歸曲線斜率的比計(jì)算校正因子(fs/k=Ks/Kk)，通過(guò)聯(lián)苯菊酯回歸曲線計(jì)算聯(lián)苯菊酯含量，通過(guò)校正因子及聯(lián)苯菊酯回歸曲線計(jì)算甲氰菊酯和溴氰菊酯的含量。

2.2溶液的制備

2.2.1對(duì)照品儲(chǔ)備液 精密量取聯(lián)苯菊酯、甲氰菊酯和溴氰菊酯對(duì)照品溶液各1 mL，置于10 mL量瓶中，加丙酮稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品儲(chǔ)備液(聯(lián)苯菊酯、甲氰菊酯和溴氰菊酯質(zhì)量濃度均為10 μg·mL-1)。

2.2.2樣品溶液和空白溶液 取浙貝母(批號(hào)20170901)50 g，粉碎，過(guò)三號(hào)篩，精密稱取粉末1.017 9 g，置于50 mL離心管中，加入15 mL乙腈，以15 000 r·min-1勻漿提取1 min，加入氯化鈉2 g，再勻漿提取1 min，以4 200 r·min-1離心5 min，取上清液，置于150 mL雞心瓶中，在離心管中加入15 mL乙腈，按照上述方法重復(fù)勻漿提取1次，合并提取液，置于40 ℃水浴中旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至1 mL。在Cleanert TPH固相萃取柱上加入2 cm高的無(wú)水硫酸鈉，用10 mL正己烷-丙酮(6∶4)預(yù)洗后，將樣品濃縮液移入柱中，用25 mL正己烷-丙酮(6∶4)洗脫，收集洗脫液，于40 ℃水浴旋轉(zhuǎn)濃縮至近干，用丙酮定容至1 mL，用0.2 μm微孔濾膜過(guò)濾，即得；除稱取樣品粉末外，按照上述操作制備空白溶液。

2.2.3樣品加標(biāo)溶液 精密稱取2.2.2項(xiàng)下粉碎的浙貝母粉末1.027 7 g，按照2.2.2項(xiàng)下方法制備樣品溶液。從置于50 mL離心管中起到收集洗脫液于40 ℃水浴旋轉(zhuǎn)濃縮至近干，用丙酮移至1 mL量瓶中，另取2.2.1項(xiàng)下制備的對(duì)照品儲(chǔ)備液1 mL，置于10 mL量瓶中，用丙酮稀釋至刻度，搖勻，精密量取此溶液5 μL，置于上述樣品溶液中，用丙酮定容至刻度，搖勻，用0.2 μm微孔濾膜過(guò)濾，即得。

2.3測(cè)定條件

2.3.1氣相色譜條件 采用Rxi-5SilMS毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)；進(jìn)樣口溫度：250 ℃；線速度：47.2 cm·s-1；程序升溫：50 ℃保持1 min，以25 ℃·min-1速率升至125 ℃，再以10 ℃·min-1速率升至300 ℃，保持15 min；進(jìn)樣體積：1 μL；載氣：高純氦氣(質(zhì)量分?jǐn)?shù)>99.999%)。

2.3.2質(zhì)譜條件 離子源溫度：200 ℃；接口溫度：250 ℃；溶劑延遲時(shí)間：5 min；碰撞氣氬氣(質(zhì)量分?jǐn)?shù)>99.999%)；電離方法見(jiàn)表1。

表1電離方法

Tab.1 The ionization mode

名稱母離子子離子碰撞電壓(CE)/V聯(lián)苯菊酯181.1166.112153.18179.112甲氰菊酯265.1210.112172.11489.028溴氰菊酯252.993.020171.9877.026

2.4圖譜解析 精密量取2.2.1項(xiàng)下制備的對(duì)照品儲(chǔ)備液25 μL，置于5 mL量瓶中，加丙酮稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品溶液。取2.2項(xiàng)下制備的對(duì)照品溶液、樣品溶液、樣品加標(biāo)溶液和空白溶液分別進(jìn)樣，按照2.3項(xiàng)下測(cè)定條件進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜圖，在對(duì)照品溶液二級(jí)離子掃描色譜圖中有聯(lián)苯菊酯二級(jí)離子掃描(181.1/166.1)、甲氰菊酯二級(jí)離子掃描(265.1/210.1)和溴氰菊酯二級(jí)離子掃描(252.9/93.0)色譜峰，聯(lián)苯菊酯、甲氰菊酯和溴氰菊酯保留時(shí)間分別為17.514，17.695和21.783 min，在空白溶液色譜圖和樣品溶液色譜圖中無(wú)上述色譜峰，在樣品加標(biāo)溶液色譜圖中有與對(duì)照品溶液色譜圖中保留時(shí)間一致的聯(lián)苯菊酯、甲氰菊酯和溴氰菊酯二級(jí)離子掃描色譜峰，見(jiàn)圖1；對(duì)照品溶液和樣品加標(biāo)溶液的二級(jí)離子碎片圖譜中聯(lián)苯菊酯在153.1，166.1和179.1處(豐度比為5∶100∶19，以166.1為參比)、甲氰菊酯在為89.0，172.1和210.1處(豐度比為40∶14∶100，以210.1為參比)、溴氰菊酯在77.0，93.0和171.9處(豐度比為22∶100∶84，以93.0為參比)均有二級(jí)離子碎片峰，見(jiàn)圖2。

圖1二級(jí)離子掃描色譜圖

A.對(duì)照品溶液；B.樣品溶液；C.樣品加標(biāo)溶液；D.空白溶液；1.聯(lián)苯菊酯；2.甲氰菊酯；3.溴氰菊酯。

Fig.1.The secondary ions scanning chromatograms

A.standard solution；B.sample solution；C.sample solution of adding standard；D.blank solution；1.bifenthrin；2.fenpropathrin；3.deltamethrin.

2.5線性關(guān)系考察 精密量取2.2.1項(xiàng)下制備的對(duì)照品儲(chǔ)備液5，10，20，25，30，40和50 μL，分別置于7個(gè)5 mL量瓶中，加丙酮稀釋至刻度，搖勻。按照2.3項(xiàng)下方法測(cè)定，以聯(lián)苯菊酯、甲氰菊酯和溴氰菊酯的二級(jí)離子掃描峰(181.1/166.1，265.1/210.1和252.9/93.0)面積為縱坐標(biāo)(y)、進(jìn)樣量(ng)為橫坐標(biāo)(x)，進(jìn)行線性回歸，計(jì)算回歸方程，結(jié)果聯(lián)苯菊酯、甲氰菊酯和溴氰菊酯3種成分的回歸方程分別為y1=10 388 461x1-236，y2=523 142x2-283和y3=520 881x3-144；三者的線性范圍均為0.01～0.1 ng；相關(guān)系數(shù)r值均為0.999 7。

2.6f值和t值的計(jì)算與耐受性考察

2.6.1f值和t值的測(cè)定 甲氰菊酯與聯(lián)苯菊酯色譜峰峰面積的校正因子f甲/聯(lián)=523 142/10 388 461=0.050 4，相對(duì)保留時(shí)間t甲/聯(lián)=17.695/17.514=1.010 3；溴氰菊酯與聯(lián)苯菊酯色譜峰峰面積的校正因子f溴/聯(lián)=520 881/10 388 461=0.050 1，相對(duì)保留時(shí)間t溴/聯(lián)=21.783/17.514=1.243 7。

圖2二級(jí)離子碎片圖譜

A.聯(lián)苯菊酯；B.甲氰菊酯；C.溴氰菊酯。

Fig.2 The chromatograms of secondary fragment ions

A.bifenthrin；B.fenpropathrin；C.deltamethrin.

2.6.2f值的耐受性考察 實(shí)際應(yīng)用中的色譜條件可能會(huì)有一些變化，因此我們對(duì)可能影響f值的因素如對(duì)線速度和進(jìn)樣體積進(jìn)行考察，結(jié)果表明，f值的波動(dòng)較小，見(jiàn)表2。

表2相對(duì)校正因子耐受性考察

Tab.2 The tolerance investigation of relative correction factors

影響因素f甲/聯(lián)f溴/聯(lián)進(jìn)樣量/μL0.90.050 30.050 11.00.050 40.050 11.10.050 40.050 2線速度/cm·s-146.20.050 10.050 0 47.20.050 40.050 148.20.050 20.050 2

2.7精密度實(shí)驗(yàn) 精密量取2.2.1項(xiàng)下制備的對(duì)照品儲(chǔ)備液20 μL，置于5 mL量瓶中，加丙酮稀釋至刻度，搖勻。按照2.3項(xiàng)下測(cè)定條件重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)得聯(lián)苯菊酯二級(jí)離子掃描色譜峰(181.1/166.1)平均峰面積為411 233，RSD值為0.9%；甲氰菊酯二級(jí)離子掃描色譜峰(265.1/210.1)平均峰面積為20 918，RSD值為0.5%；溴氰菊酯二級(jí)離子掃描色譜峰(252.9/93.0)的平均峰面積為20 473，RSD值為0.7%。

2.8重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 精密量取2.2.1項(xiàng)下制備的對(duì)照品儲(chǔ)備液20 μL，分別置于6個(gè)5 mL量瓶中，加丙酮稀釋至刻度，搖勻。按照2.3項(xiàng)下測(cè)定條件分別進(jìn)樣，測(cè)得聯(lián)苯聚酯二級(jí)離子掃描色譜峰(181.1/166.1)平均峰面積為410 871，RSD值為0.3%；甲氰菊酯二級(jí)離子掃描色譜峰(265.1/210.1)平均峰面積為21 089，RSD值為0.8%；溴氰菊酯二級(jí)離子掃描色譜峰(252.9/93.0)平均峰面積為21 056，RSD值為0.4%。

2.9穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取2.2.3項(xiàng)下制備的樣品加標(biāo)溶液，按照2.3項(xiàng)下條件分別在0，2，4，8，12，14，16，20和24 h進(jìn)樣，結(jié)果聯(lián)苯菊酯、甲氰菊酯和溴氰菊酯二級(jí)離子掃描色譜峰面積變化較小，RSD值分別為1.0%，1.1%和0.8%。

2.10檢出限與定量限 取2.2.3項(xiàng)下制備的樣品加標(biāo)溶液，按照2.3項(xiàng)下條件測(cè)定，測(cè)得聯(lián)苯菊酯、甲氰菊酯和溴氰菊酯信噪比(S/N)分別為15.14，61.78和13.92，以S/N的3倍計(jì)算最低檢出限、10倍計(jì)算最低定量限。結(jié)果聯(lián)苯菊酯、甲氰菊酯和溴氰菊酯的最低檢出限(以進(jìn)樣量計(jì))分別為9.907×10-4，2.428×10-4和1.078×10-3ng；最低定量限(以進(jìn)樣量計(jì))分別為3.303×10-3，8.093×10-4和3.592×10-3ng。

2.11回收率實(shí)驗(yàn) 取2.2.2項(xiàng)下粉末9份，分為3組，每組3份，每份1 g，精密稱定，分別置于9個(gè)50 mL的離心管中，每組分別加入對(duì)照品儲(chǔ)備液4，5和6 μL，按照2.2項(xiàng)下方法制備樣品溶液，按照2.3項(xiàng)下測(cè)定條件分別進(jìn)樣，記錄圖譜，按照回歸方程y=10 388 461x-236計(jì)算供試品中聯(lián)苯菊酯的含量；按照校正方程A甲氰菊酯=10 388 461mf甲/聯(lián)-236計(jì)算甲氰菊酯含量，按照校正方程A溴氰菊酯=10 388 461mf溴/聯(lián)-236計(jì)算溴氰菊酯的含量。結(jié)果聯(lián)苯菊酯、甲氰菊酯和溴氰菊酯的平均回收率分別為96.9%，97.2%和94.4%；RSD值分別為1.1%，1.0%和0.9%。結(jié)果見(jiàn)表3至表 5。

2.12樣品測(cè)定 分別取批號(hào)為20170901,20170902和20170903的浙貝母樣品50 g，粉碎，過(guò)三號(hào)篩，分別取粉末1 g，精密稱定，按照2.2項(xiàng)下方法制備樣品溶液，按照2.3項(xiàng)下測(cè)定條件分別進(jìn)樣，記錄圖譜，并按照2.10項(xiàng)下方法計(jì)算樣品聯(lián)苯菊酯、甲氰菊酯和溴氰菊酯殘留量，結(jié)果表明，3批樣品的殘留量測(cè)定結(jié)果均為0 ng·kg-1。

表3聯(lián)苯菊酯回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

Tab.3 Results of the bifenthrin recovery test (n=9)

表4甲氰菊酯回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

Tab.4 Results of the fenpropathrin recovery test (n=9)

表5溴氰菊酯回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

Tab.5 Results of the deltamethrin recovery test (n=9)

3 討論

3.1耐受性考察 本實(shí)驗(yàn)中的相對(duì)保留時(shí)間可能會(huì)因色譜條件的細(xì)微改變而發(fā)生變化，但在該實(shí)驗(yàn)中，被測(cè)定物質(zhì)的定性主要采用二級(jí)離子碎片峰及其豐度比確認(rèn)，因此未對(duì)相對(duì)保留時(shí)間的耐受性進(jìn)行考察。在對(duì)相對(duì)校正因子f值耐受性進(jìn)行考察時(shí)，因儀器廠家建議進(jìn)樣體積不超過(guò)1 μL，因此對(duì)進(jìn)樣體積0.9，1.0和1.1 μL時(shí)的f值進(jìn)行了比較，結(jié)果變化不大。

3.2校正因子的計(jì)算 校正因子計(jì)算法常應(yīng)用于化學(xué)藥有關(guān)物質(zhì)的測(cè)定、中藥材及其復(fù)方制劑中多指標(biāo)成分的測(cè)定[17-19]。校正因子的表示方法很多，本實(shí)驗(yàn)的校正因子是指氣相色譜法中的相對(duì)質(zhì)量校正因子。校正因子的測(cè)定可精密取一個(gè)成分對(duì)照品和其他物質(zhì)對(duì)照品各適量，分別配制成不同質(zhì)量濃度的溶液進(jìn)樣，記錄色譜圖，繪制選定成分進(jìn)樣量和其他成分進(jìn)樣量對(duì)其峰面積的回歸曲線，用回歸直線斜率之間的比值來(lái)計(jì)算校正因子。

3.3提取溶劑的考察 選擇提取溶劑時(shí)，因乙腈對(duì)聯(lián)苯菊酯等農(nóng)藥溶解度較大，可溶入的雜質(zhì)量適中，故選擇乙腈為提取溶劑；在Cleanert TPH固相萃取柱上加入2 cm高的無(wú)水硫酸鈉以除去樣品溶液及洗脫液中的水份。

3.4GC-MS(MS/MS)聯(lián)用法的優(yōu)勢(shì) 我們對(duì)多種中藥材的農(nóng)藥殘留含量測(cè)定進(jìn)行了研究，由于中藥材含有多種化學(xué)成分，會(huì)對(duì)測(cè)定有一些干擾，因此在測(cè)定具體某一品種時(shí)應(yīng)設(shè)計(jì)具體的實(shí)驗(yàn)參數(shù)，并進(jìn)行相應(yīng)方法學(xué)論證。GC-MS(MS/MS)聯(lián)用法既具有氣相色譜的高分離效能，又具有質(zhì)譜(二級(jí)質(zhì)譜)可鑒定化合物結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)，可同時(shí)快速測(cè)定樣品中多種殘留農(nóng)藥及其衍生物。

3.5一測(cè)多評(píng)法的優(yōu)勢(shì) 一測(cè)多評(píng)法是以一種對(duì)照品來(lái)建立該成分與其他成分間的相對(duì)響應(yīng)因子，通過(guò)相對(duì)響應(yīng)因子來(lái)計(jì)算其他成分含量的質(zhì)量控制方法，這是本文創(chuàng)新點(diǎn)，以往文獻(xiàn)暫無(wú)此方法的詳細(xì)報(bào)道。該法具有成本低、效率高等優(yōu)點(diǎn)，能有效解決多指標(biāo)質(zhì)量控制面臨的對(duì)照品短缺、不易獲得、檢測(cè)成本相對(duì)昂貴和農(nóng)藥對(duì)照品造成的環(huán)境污染等問(wèn)題。