方藝霖，余敏靈

(四川省樂山市食品方法檢驗檢測中心,樂山 614000)

近年來，隨著中藥材產業(yè)化發(fā)展，農藥污染問題日益嚴重。中藥材種植及中藥飲片加工、儲存過程中農藥的不當使用，均會影響中藥飲片的質量，嚴重危害人體健康?！吨袊幍洹?015年版四部收載了多種農藥殘留量的氣相色譜檢查方法[1]。目前對農藥殘留量研究報道的文獻多以氣相色譜法、液相色譜法、氣相色譜串聯質譜法及液相色譜串聯質譜法為主[2-11]，但都存在對照品獲得困難、操作繁瑣或多指標檢測成本高等問題。浙貝母收載于《中國藥典》2015年版一部，具有清熱、化痰、止咳、解毒、散結和消癰的功效[12]，目前關于浙貝母的文獻報道多以藥理研究為主，還未見應用GC-MS/MS法測定其多種農藥殘留量的文獻報道。本文應用GC-MS/MS法，根據色譜保留時間和質荷比信息對樣品進行定性分析，以聯苯菊酯二級離子掃描色譜峰(181.1/166.1)面積作為參照，計算其與甲氰菊酯二級離子掃描色譜峰(265.1/210.1)面積和溴氰菊酯二級離子掃描色譜峰(252.9/93.0)面積的校正因子，建立GS-MS/MS法測定浙貝母中聯苯菊酯等3種農藥殘留量的一測多評法，以期為GC-MS/MS法測定中藥中農藥殘留量提供一測多評[13-14]研究思路。

1 儀器與試藥

1.1儀器 GCMS-TQ8030氣質聯用儀，Lab Solutions/GCMS solutions 4.20版本工作站(島津中國科技有限公司)；XS205 DualRange 型電子天平(瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司)

1.2試藥 浙貝母樣品購于樂山中藥材有限公司，按照《中國藥典》2015年版鑒定為百合科植物浙貝母FritillariaThunbergiiMiq.的干燥鱗莖，樣品批號分別為20170901，20170902和20170903。聯苯菊酯、甲氰菊酯和溴氰菊酯對照品溶液(規(guī)格：100 μg·mL-1，批號分別為：GSB05-2333-2016，GSB05-2306-2016和GSB05-2310-2016，農業(yè)部環(huán)境監(jiān)測保護研究所)；Cleanert TPH凈化柱(天津博納艾潔爾公司)；乙腈、丙酮為色譜純，氯化鈉、無水硫酸鈉為優(yōu)級純，水為純化水。

2 方法與結果

2.1測定原理 以聯苯菊酯為對照品測定樣品中3種農藥殘留的原理是利用樣品色譜圖中聯苯菊酯、甲氰菊酯和溴氰菊酯的色譜峰相對保留時間進行定位以及二級離子碎片圖譜碎片離子峰和豐度比對聯苯菊酯、甲氰菊酯和溴氰菊酯色譜峰進行定性分析。在定量分析時，通過精密量取聯苯菊酯、甲氰菊酯和溴氰菊酯對照品溶液各適量，配制成不同質量濃度的混合溶液，按照設定條件進樣，記錄色譜圖，繪制進樣量對其峰面積的回歸曲線，以聯苯菊酯回歸曲線斜率與甲氰菊酯和溴氰菊酯回歸曲線斜率的比計算校正因子(fs/k=Ks/Kk)，通過聯苯菊酯回歸曲線計算聯苯菊酯含量，通過校正因子及聯苯菊酯回歸曲線計算甲氰菊酯和溴氰菊酯的含量。

2.2溶液的制備

2.2.1對照品儲備液 精密量取聯苯菊酯、甲氰菊酯和溴氰菊酯對照品溶液各1 mL，置于10 mL量瓶中，加丙酮稀釋至刻度，搖勻，作為對照品儲備液(聯苯菊酯、甲氰菊酯和溴氰菊酯質量濃度均為10 μg·mL-1)。

2.2.2樣品溶液和空白溶液 取浙貝母(批號20170901)50 g，粉碎，過三號篩，精密稱取粉末1.017 9 g，置于50 mL離心管中，加入15 mL乙腈，以15 000 r·min-1勻漿提取1 min，加入氯化鈉2 g，再勻漿提取1 min，以4 200 r·min-1離心5 min，取上清液，置于150 mL雞心瓶中，在離心管中加入15 mL乙腈，按照上述方法重復勻漿提取1次，合并提取液，置于40 ℃水浴中旋轉蒸發(fā)至1 mL。在Cleanert TPH固相萃取柱上加入2 cm高的無水硫酸鈉，用10 mL正己烷-丙酮(6∶4)預洗后，將樣品濃縮液移入柱中，用25 mL正己烷-丙酮(6∶4)洗脫，收集洗脫液，于40 ℃水浴旋轉濃縮至近干，用丙酮定容至1 mL，用0.2 μm微孔濾膜過濾，即得；除稱取樣品粉末外，按照上述操作制備空白溶液。

2.2.3樣品加標溶液 精密稱取2.2.2項下粉碎的浙貝母粉末1.027 7 g，按照2.2.2項下方法制備樣品溶液。從置于50 mL離心管中起到收集洗脫液于40 ℃水浴旋轉濃縮至近干，用丙酮移至1 mL量瓶中，另取2.2.1項下制備的對照品儲備液1 mL，置于10 mL量瓶中，用丙酮稀釋至刻度，搖勻，精密量取此溶液5 μL，置于上述樣品溶液中，用丙酮定容至刻度，搖勻，用0.2 μm微孔濾膜過濾，即得。

2.3測定條件

2.3.1氣相色譜條件 采用Rxi-5SilMS毛細管柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)；進樣口溫度：250 ℃；線速度：47.2 cm·s-1；程序升溫：50 ℃保持1 min，以25 ℃·min-1速率升至125 ℃，再以10 ℃·min-1速率升至300 ℃，保持15 min；進樣體積：1 μL；載氣：高純氦氣(質量分數>99.999%)。

2.3.2質譜條件 離子源溫度：200 ℃；接口溫度：250 ℃；溶劑延遲時間：5 min；碰撞氣氬氣(質量分數>99.999%)；電離方法見表1。

表1電離方法

Tab.1 The ionization mode

名稱母離子子離子碰撞電壓(CE)/V聯苯菊酯181.1166.112153.18179.112甲氰菊酯265.1210.112172.11489.028溴氰菊酯252.993.020171.9877.026

2.4圖譜解析 精密量取2.2.1項下制備的對照品儲備液25 μL，置于5 mL量瓶中，加丙酮稀釋至刻度，搖勻，作為對照品溶液。取2.2項下制備的對照品溶液、樣品溶液、樣品加標溶液和空白溶液分別進樣，按照2.3項下測定條件進行測定，記錄色譜圖，在對照品溶液二級離子掃描色譜圖中有聯苯菊酯二級離子掃描(181.1/166.1)、甲氰菊酯二級離子掃描(265.1/210.1)和溴氰菊酯二級離子掃描(252.9/93.0)色譜峰，聯苯菊酯、甲氰菊酯和溴氰菊酯保留時間分別為17.514，17.695和21.783 min，在空白溶液色譜圖和樣品溶液色譜圖中無上述色譜峰，在樣品加標溶液色譜圖中有與對照品溶液色譜圖中保留時間一致的聯苯菊酯、甲氰菊酯和溴氰菊酯二級離子掃描色譜峰，見圖1；對照品溶液和樣品加標溶液的二級離子碎片圖譜中聯苯菊酯在153.1，166.1和179.1處(豐度比為5∶100∶19，以166.1為參比)、甲氰菊酯在為89.0，172.1和210.1處(豐度比為40∶14∶100，以210.1為參比)、溴氰菊酯在77.0，93.0和171.9處(豐度比為22∶100∶84，以93.0為參比)均有二級離子碎片峰，見圖2。

圖1二級離子掃描色譜圖

A.對照品溶液；B.樣品溶液；C.樣品加標溶液；D.空白溶液；1.聯苯菊酯；2.甲氰菊酯；3.溴氰菊酯。

Fig.1.The secondary ions scanning chromatograms

A.standard solution；B.sample solution；C.sample solution of adding standard；D.blank solution；1.bifenthrin；2.fenpropathrin；3.deltamethrin.

2.5線性關系考察 精密量取2.2.1項下制備的對照品儲備液5，10，20，25，30，40和50 μL，分別置于7個5 mL量瓶中，加丙酮稀釋至刻度，搖勻。按照2.3項下方法測定，以聯苯菊酯、甲氰菊酯和溴氰菊酯的二級離子掃描峰(181.1/166.1，265.1/210.1和252.9/93.0)面積為縱坐標(y)、進樣量(ng)為橫坐標(x)，進行線性回歸，計算回歸方程，結果聯苯菊酯、甲氰菊酯和溴氰菊酯3種成分的回歸方程分別為y1=10 388 461x1-236，y2=523 142x2-283和y3=520 881x3-144；三者的線性范圍均為0.01～0.1 ng；相關系數r值均為0.999 7。

2.6f值和t值的計算與耐受性考察

2.6.1f值和t值的測定 甲氰菊酯與聯苯菊酯色譜峰峰面積的校正因子f甲/聯=523 142/10 388 461=0.050 4，相對保留時間t甲/聯=17.695/17.514=1.010 3；溴氰菊酯與聯苯菊酯色譜峰峰面積的校正因子f溴/聯=520 881/10 388 461=0.050 1，相對保留時間t溴/聯=21.783/17.514=1.243 7。

圖2二級離子碎片圖譜

A.聯苯菊酯；B.甲氰菊酯；C.溴氰菊酯。

Fig.2 The chromatograms of secondary fragment ions

A.bifenthrin；B.fenpropathrin；C.deltamethrin.

2.6.2f值的耐受性考察 實際應用中的色譜條件可能會有一些變化，因此我們對可能影響f值的因素如對線速度和進樣體積進行考察，結果表明，f值的波動較小，見表2。

表2相對校正因子耐受性考察

Tab.2 The tolerance investigation of relative correction factors

影響因素f甲/聯f溴/聯進樣量/μL0.90.050 30.050 11.00.050 40.050 11.10.050 40.050 2線速度/cm·s-146.20.050 10.050 0 47.20.050 40.050 148.20.050 20.050 2

2.7精密度實驗 精密量取2.2.1項下制備的對照品儲備液20 μL，置于5 mL量瓶中，加丙酮稀釋至刻度，搖勻。按照2.3項下測定條件重復進樣6次，測得聯苯菊酯二級離子掃描色譜峰(181.1/166.1)平均峰面積為411 233，RSD值為0.9%；甲氰菊酯二級離子掃描色譜峰(265.1/210.1)平均峰面積為20 918，RSD值為0.5%；溴氰菊酯二級離子掃描色譜峰(252.9/93.0)的平均峰面積為20 473，RSD值為0.7%。

2.8重復性實驗 精密量取2.2.1項下制備的對照品儲備液20 μL，分別置于6個5 mL量瓶中，加丙酮稀釋至刻度，搖勻。按照2.3項下測定條件分別進樣，測得聯苯聚酯二級離子掃描色譜峰(181.1/166.1)平均峰面積為410 871，RSD值為0.3%；甲氰菊酯二級離子掃描色譜峰(265.1/210.1)平均峰面積為21 089，RSD值為0.8%；溴氰菊酯二級離子掃描色譜峰(252.9/93.0)平均峰面積為21 056，RSD值為0.4%。

2.9穩(wěn)定性實驗 取2.2.3項下制備的樣品加標溶液，按照2.3項下條件分別在0，2，4，8，12，14，16，20和24 h進樣，結果聯苯菊酯、甲氰菊酯和溴氰菊酯二級離子掃描色譜峰面積變化較小，RSD值分別為1.0%，1.1%和0.8%。

2.10檢出限與定量限 取2.2.3項下制備的樣品加標溶液，按照2.3項下條件測定，測得聯苯菊酯、甲氰菊酯和溴氰菊酯信噪比(S/N)分別為15.14，61.78和13.92，以S/N的3倍計算最低檢出限、10倍計算最低定量限。結果聯苯菊酯、甲氰菊酯和溴氰菊酯的最低檢出限(以進樣量計)分別為9.907×10-4，2.428×10-4和1.078×10-3ng；最低定量限(以進樣量計)分別為3.303×10-3，8.093×10-4和3.592×10-3ng。

2.11回收率實驗 取2.2.2項下粉末9份，分為3組，每組3份，每份1 g，精密稱定，分別置于9個50 mL的離心管中，每組分別加入對照品儲備液4，5和6 μL，按照2.2項下方法制備樣品溶液，按照2.3項下測定條件分別進樣，記錄圖譜，按照回歸方程y=10 388 461x-236計算供試品中聯苯菊酯的含量；按照校正方程A甲氰菊酯=10 388 461mf甲/聯-236計算甲氰菊酯含量，按照校正方程A溴氰菊酯=10 388 461mf溴/聯-236計算溴氰菊酯的含量。結果聯苯菊酯、甲氰菊酯和溴氰菊酯的平均回收率分別為96.9%，97.2%和94.4%；RSD值分別為1.1%，1.0%和0.9%。結果見表3至表 5。

2.12樣品測定 分別取批號為20170901,20170902和20170903的浙貝母樣品50 g，粉碎，過三號篩，分別取粉末1 g，精密稱定，按照2.2項下方法制備樣品溶液，按照2.3項下測定條件分別進樣，記錄圖譜，并按照2.10項下方法計算樣品聯苯菊酯、甲氰菊酯和溴氰菊酯殘留量，結果表明，3批樣品的殘留量測定結果均為0 ng·kg-1。

表3聯苯菊酯回收率實驗結果

Tab.3 Results of the bifenthrin recovery test (n=9)

表4甲氰菊酯回收率實驗結果

Tab.4 Results of the fenpropathrin recovery test (n=9)

表5溴氰菊酯回收率實驗結果

Tab.5 Results of the deltamethrin recovery test (n=9)

3 討論

3.1耐受性考察 本實驗中的相對保留時間可能會因色譜條件的細微改變而發(fā)生變化，但在該實驗中，被測定物質的定性主要采用二級離子碎片峰及其豐度比確認，因此未對相對保留時間的耐受性進行考察。在對相對校正因子f值耐受性進行考察時，因儀器廠家建議進樣體積不超過1 μL，因此對進樣體積0.9，1.0和1.1 μL時的f值進行了比較，結果變化不大。

3.2校正因子的計算 校正因子計算法常應用于化學藥有關物質的測定、中藥材及其復方制劑中多指標成分的測定[17-19]。校正因子的表示方法很多，本實驗的校正因子是指氣相色譜法中的相對質量校正因子。校正因子的測定可精密取一個成分對照品和其他物質對照品各適量，分別配制成不同質量濃度的溶液進樣，記錄色譜圖，繪制選定成分進樣量和其他成分進樣量對其峰面積的回歸曲線，用回歸直線斜率之間的比值來計算校正因子。

3.3提取溶劑的考察 選擇提取溶劑時，因乙腈對聯苯菊酯等農藥溶解度較大，可溶入的雜質量適中，故選擇乙腈為提取溶劑；在Cleanert TPH固相萃取柱上加入2 cm高的無水硫酸鈉以除去樣品溶液及洗脫液中的水份。

3.4GC-MS(MS/MS)聯用法的優(yōu)勢 我們對多種中藥材的農藥殘留含量測定進行了研究，由于中藥材含有多種化學成分，會對測定有一些干擾，因此在測定具體某一品種時應設計具體的實驗參數，并進行相應方法學論證。GC-MS(MS/MS)聯用法既具有氣相色譜的高分離效能，又具有質譜(二級質譜)可鑒定化合物結構的特點，可同時快速測定樣品中多種殘留農藥及其衍生物。

3.5一測多評法的優(yōu)勢 一測多評法是以一種對照品來建立該成分與其他成分間的相對響應因子，通過相對響應因子來計算其他成分含量的質量控制方法，這是本文創(chuàng)新點，以往文獻暫無此方法的詳細報道。該法具有成本低、效率高等優(yōu)點，能有效解決多指標質量控制面臨的對照品短缺、不易獲得、檢測成本相對昂貴和農藥對照品造成的環(huán)境污染等問題。