劉 蘭， 劉燕芳， 李寶才， 張 敉

(昆明理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院， 云南 昆明 650500)

白菊木屬(GochnatiaH. B. K.)為菊科(Compositae)中2個木本植物屬之一，其中絕大部分種分布于美洲的溫帶和熱帶，僅2種分布于中國和東南亞的熱帶[1-4]，白菊木〔G.decora(Kurz) A. L. Cabrera〕為其一，在中國主要分布于云南南部。白菊木樹皮可用于治療肺熱喘咳和槍傷刀傷[5]，但至今鮮有其化學(xué)成分和藥理活性方面的研究。作者所在課題組采用多種柱色譜分離手段首次從白菊木樹皮甲醇提取物的石油醚和乙酸乙酯萃取物中分離獲得30余個化合物，主要為對映-貝殼杉烷型二萜類成分，并采用脂多糖(LPS)誘導(dǎo)小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7(以下簡稱RAW264.7細(xì)胞)產(chǎn)生一氧化氮(NO)模型對分離得到的化學(xué)成分進(jìn)行活性測試，結(jié)果表明：白菊木樹皮甲醇提取物及部分單體化合物的NO抑制活性良好[6-7]。在此基礎(chǔ)上，本文研究了白菊木樹皮和枝葉甲醇提取物及其中1個單體化合物15β-hydroxy-ent-16-kaur-19-oic-β-D-glucopyranosyl ester(Gd-1)對一些炎癥因子的影響，以期為白菊木的后續(xù)成分研究和活性評價(jià)提實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

供試RAW264.7細(xì)胞購自中國科學(xué)院昆明動物研究所。供試白菊木的樹皮和枝葉分別于2013年7月和2014年7月采自云南省西雙版納傣族自治州勐臘縣勐侖鎮(zhèn)銀廠村石灰山，經(jīng)中國科學(xué)院西雙版納熱帶植物園周仕順助理研究員鑒定。樣品自然風(fēng)干。憑證標(biāo)本保存于昆明理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院天然產(chǎn)物制藥實(shí)驗(yàn)室。

分別將200 g白菊木樹皮和枝葉的干樣剪碎，每次用600 mL甲醇冷浸提取7 d，共3次。加壓回收甲醇提取液后分別得到樹皮和枝葉甲醇提取物浸膏。Gd-1的分離及鑒定參考文獻(xiàn)[6]。樹皮和枝葉甲醇提取物浸膏及Gd-1先用二甲基亞砜(DMSO)配置成一定濃度的母液，然后用DMEM高糖液體培養(yǎng)基稀釋，備用。

主要試劑：DMEM高糖液體培養(yǎng)基(美國HyClone公司)；NO硝酸還原酶檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所)；胎牛血清(美國Gibco公司)；LPS、噻唑藍(lán)(MTT)、Griess試劑盒和地塞米松(DXM)(美國Sigma公司)；TNF-α和IL-6酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測試劑盒(美國BD公司)；總NOS抑制劑L-NG-monomethyl arginine citrate(L-NMMA，上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；PBS(pH 7.2至pH 7.4，上海索萊寶生物科技有限公司)；其他試劑均為分析純。

主要儀器：MK3型酶標(biāo)儀(芬蘭Labsystems Multiskan公司)；Thermo Forma 3111型CO2培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)；BHC-1300ⅡB2型生物安全柜(蘇州金凈凈化設(shè)備公司)；CKX1倒置相差顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將RAW264.7細(xì)胞培養(yǎng)于含體積分?jǐn)?shù)10%熱滅活胎牛血清的DMEM高糖液體培養(yǎng)基中，置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對數(shù)生長期細(xì)胞接種于新的培養(yǎng)瓶繼續(xù)培養(yǎng)，根據(jù)細(xì)胞狀態(tài)以細(xì)胞懸液體積比1∶3～1∶6進(jìn)行傳代。

1.2.2 MTT實(shí)驗(yàn) 以每孔2×104個RAW264.7細(xì)胞接種于96孔板，每孔體系100 μL，置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，分別加入樹皮和枝葉甲醇提取物(終質(zhì)量濃度0.39、1.56、6.25、25和100 μg·mL-1)以及Gd-1(終濃度0.39、1.56、6.25、25和100 μmol·L-1)，以未加樹皮和枝葉甲醇提取物以及Gd-1的孔為空白孔；處理24 h后，顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)；然后每孔加入5 mg·mL-1MTT 20 μL，孵育4 h，吸棄上清液，每孔加入150 μL DMSO，振蕩15 min，于波長490 nm處測定吸光度值。根據(jù)公式“細(xì)胞存活率=(檢測孔吸光度值/空白孔吸光度值)×100%”[8]計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.2.3 細(xì)胞內(nèi)NO檢測 采用Griess法[9]檢測，以每孔1×105個RAW264.7細(xì)胞接種于96孔板，每孔體系100 μL，置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，設(shè)置正常對照組、模型對照組、處理(樹皮或枝葉甲醇提取物+LPS)組和陽性藥(L-NMMA+LPS)組，每組3個復(fù)孔；24 h后，分別加入樹皮和枝葉甲醇提取物(終質(zhì)量濃度0.39、1.56、6.25、25和100 μg·mL-1)以及L-NMMA(終濃度0.39、1.56、6.25、25和100 μmol·L-1)；孵育1 h后，各組加入LPS至終質(zhì)量濃度為1 μg·mL-1，正常對照組不做任何處理；孵育24 h，收集上清液，按照Griess試劑盒說明進(jìn)行檢測，于波長540 nm處測定吸光度值。用標(biāo)準(zhǔn)品溶液的吸光度值和濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程，計(jì)算得到各待測樣品中NO的濃度。

1.2.4 RAW264.7細(xì)胞產(chǎn)生活性氧(ROS)檢測 參考DCFH-DA熒光探針法[10]，取對數(shù)生長期的RAW264.7細(xì)胞，以每孔1×105個細(xì)胞接種于不透光的棕色96孔板，每孔體系100 μL，置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，分別加入樹皮和枝葉甲醇提取物(終質(zhì)量濃度0.625、2.5、10 μg·mL-1)、Gd-1(終濃度0.625、2.5、10 μmol·L-1)以及陽性藥DXM(終質(zhì)量濃度2.5 μmol·L-1)；孵育1 h后，各組加入LPS至終質(zhì)量濃度為1 μg·mL-1，模型對照組只加入LPS至終質(zhì)量濃度為1 μg·mL-1，正常對照組不做任何處理；繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，吸棄孔中液體，每孔加入100 μL PBS，清洗3次，每孔加入終濃度20 μmol·L-1的DCFH-DA熒光探針100 μL；繼續(xù)培養(yǎng)30 min后，去除含有DCFH-DA熒光探針的培養(yǎng)基，每孔加入100 μL PBS，清洗3次，去除殘留DCFH-DA熒光探針，最后每孔加入100 μL PBS；使用MK3型酶標(biāo)儀(激發(fā)波長485 nm，發(fā)射波長530 nm)測定檢測孔(處理組或模型對照組)和空白孔(正常對照組)吸光度值，根據(jù)公式“ROS相對含量=檢測孔吸光度值/空白孔吸光度值)×100%”計(jì)算ROS相對含量。

1.2.5 腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和白細(xì)胞介數(shù)-6(IL-6)含量檢測 參考ELISA法[11]，取對數(shù)生長期RAW264.7細(xì)胞，以每孔4×105個細(xì)胞接種于24孔板中，每孔體系1 mL，置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，分別加入樹皮和枝葉甲醇提取物(終質(zhì)量濃度0.625、2.5和10 μg·mL-1)、Gd-1(終濃度0.625、2.5和10 μmol·L-1)以及陽性藥DXM(終濃度2.5 μmol·L-1)；孵育1 h后，各組加入LPS至終質(zhì)量濃度為1 μg·mL-1，正常對照組不做任何處理，繼續(xù)孵育12 h，收集上清液，分別按TNF-α和IL-6酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測試劑盒說明書進(jìn)行檢測。

1.3 數(shù)據(jù)處理和分析

采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)分析軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)，應(yīng)用LSD (L) test檢測方差齊性，應(yīng)用Tamhane’s T2 (M) test檢測方差不齊性。

2 結(jié)果和分析

2.1 對RAW264.7細(xì)胞的活力及其產(chǎn)生NO的影響

白菊木樹皮和枝葉甲醇提取物(終質(zhì)量濃度0.39、1.56、6.25、25和100 μg·mL-1)以及Gd-1(終濃度0.39、1.56、6.25、25和100 μmol·L-1)與RAW264.7細(xì)胞共同孵育后細(xì)胞存活率較空白組未明顯降低，且空白組和處理組的細(xì)胞形態(tài)均良好，無明顯差異，未觀察到白菊木樹皮和枝葉甲醇提取物以及Gd-1在供試濃度下的細(xì)胞毒性。

終質(zhì)量濃度0.39、1.56、6.25、25和100 μg·mL-1白菊木樹皮和枝葉甲醇提取物與1 μg·mL-1LPS共培養(yǎng)時，對RAW264.7細(xì)胞毒性的半抑制濃度大于100 μg·mL-1，對細(xì)胞生長無明顯影響，Gd-1對細(xì)胞毒性的半抑制濃度為88.346 μmol·L-1，對細(xì)胞生長的影響較弱。據(jù)此確定安全給藥濃度范圍分別為：白菊木樹皮和枝葉甲醇提取物的質(zhì)量濃度低于50 μg·mL-1，Gd-1濃度低于50 μmol·L-1。

結(jié)果顯示：所有處理組均抑制NO產(chǎn)生，白菊木樹皮和枝葉甲醇提取物抑制NO產(chǎn)生的半抑制濃度分別為21.11和27.15 μg·mL-1。

2.2 對RAW264.7細(xì)胞產(chǎn)生ROS、TNF-α和IL-6的影響

結(jié)果(表1)顯示：模型對照組的ROS相對含量顯著(P<0.001)升高。與模型對照組相比，各處理組的ROS相對含量均有所降低，且2.5和10 μg·mL-1白菊木樹皮和枝葉甲醇提取物處理組顯著(P<0.01)降低。

與正常對照組相比，模型對照組的TNF-α和IL-6含量顯著(P<0.001)升高。與模型對照組相比，各處理組的TNF-α和IL-6含量均有一定程度降低，且高劑量組較顯著。

處理組Treatment groupROS相對含量/%ROS relative contentTNF-α含量/(pg·mL-1)TNF-α contentIL-6含量/(pg·mL-1)IL-6 contentNCK100.00±5.41 272.86±5.10 1.32±0.65 MCK226.67±28.32 ###1 163.21±25.84 ###588.50±11.34 ###2.5 μmol·L-1 DXM68.16±4.49***797.22±26.81***184.72±7.06***0.625 μg·mL-1 SP181.16±35.741 140.43±35.38545.00±23.98*2.5 μg·mL-1 SP82.61±3.28***1 110.84±13.75530.18±4.86**10 μg·mL-1 SP70.58±12.23***925.46±14.74**412.95±10.73***0.625 μg·mL-1 ZY185.82±21.081 089.81±5.77544.84±29.862.5 μg·mL-1 ZY89.33±6.26**1 086.27±29.42454.16±4.74***10 μg·mL-1 ZY90.91±4.32**965.06±41.10**356.26±8.84***0.625 μmol·L-1 Gd-1107.25±11.86**1 140.49±88.63519.75±26.52*2.5 μmol·L-1 Gd-193.26±10.42**1 135.91±27.29520.71±18.96*10 μmol·L-1 Gd-194.55±12.16**989.75±51.91**411.89±16.38***

1)NCK： 正常對照The normal control； MCK： 模型對照The model control； DXM： 地塞米松Dexamethasone； SP： 白菊木樹皮甲醇提取物Methanol extracts from barks ofGochnatiadecora(Kurz) A. L. Cabrera； ZY： 白菊木枝葉甲醇提取物Methanol extracts from branches and leaves ofG.decora. #： 與NCK組相比Compared with NCK group； *： 與MCK組相比Compared with MCK group. *** ，###：P<0.001； ** ：P<0.01； *：P<0.05.

3 討論和結(jié)論

LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞模型廣泛用于篩選潛在抗炎活性天然產(chǎn)物。該細(xì)胞受到LPS刺激后，能夠釋放ROS、TNF-α、IL-6及NO等炎癥遞質(zhì)，從而啟動抵抗炎癥反應(yīng)的功能[12-13]。NO是體內(nèi)一種重要的生理遞質(zhì)和化學(xué)信使，其過量產(chǎn)生會引起炎癥反應(yīng)和機(jī)體損傷，因此，能否抑制NO產(chǎn)生常作為評估待測藥物是否具有潛在的抗炎活性并值得進(jìn)一步研究的重要指標(biāo)。白菊木樹皮和枝葉甲醇提取物均可一定程度上抑制NO產(chǎn)生，而Gd-1抑制NO產(chǎn)生的效果更好，其抑制NO產(chǎn)生的半抑制濃度為2.58 μmol·L-1[6]。而對TNF-α、IL-6及NO而言，白菊木樹皮和枝葉甲醇提取物以及Gd-1的影響差異較小，且均為高劑量組效果最佳。總體上看，白菊木樹皮和枝葉提取物以及Gd-1均具有潛在的抗炎活性。Gd-1為對映-貝殼杉烷型二萜類成分，該類成分可作為目標(biāo)產(chǎn)物從白菊木樹皮與枝葉中進(jìn)行分離純化及活性研究。