（福建省產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)研究院國家加工食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心（福州），福建福州350000）

近年來，食品安全問題備受關(guān)注，其中食品接觸材料受致病菌污染也是引起食源性疾病的重要原因之一[1]。我國對食品接觸材料的定義為：在正常使用條件下，各種已經(jīng)或預(yù)期可能與食品或食品添加劑（以下簡稱食品）接觸、或其成分可能轉(zhuǎn)移到食品中的材料和制品，包括食品生產(chǎn)、加工、包裝、運(yùn)輸、貯存、銷售和使用過程中用于食品的包裝材料、容器、工具和設(shè)備，及可能直接或間接接觸食品的油墨、黏合劑、潤滑油等[2]。由此可見食品接觸材料范圍廣、種類多，不再是單純的食品容器和包裝材料，且與食品直接接觸，食品接觸材料中的致病菌可能會遷移入食品中。在監(jiān)測與檢測食源性致病菌方面，也急需建立針對食品接觸材料的特異性好且靈敏度高的快速檢測方法。

金黃色葡萄球菌、沙門氏菌和副溶血性弧菌是3種常見的食源性致病菌。傳統(tǒng)的微生物檢測和鑒定方法一般要經(jīng)過增菌、分離培養(yǎng)、生化試驗(yàn)和血清學(xué)鑒定等多個步驟，試驗(yàn)周期長，操作繁瑣。多重實(shí)時熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)是在熒光PCR技術(shù)基礎(chǔ)上增加多于兩對的引物和相應(yīng)的探針，實(shí)現(xiàn)在同一個反應(yīng)體系中對多個目標(biāo)序列的有效擴(kuò)增，并因其快速高效等優(yōu)點(diǎn)被應(yīng)用到致病微生物檢測工作中[3]。

本文參照相關(guān)文獻(xiàn)[4-5]，以金黃色葡萄球菌谷氨酰胺合成酶家族蛋白編碼基因gltS、沙門氏菌屬菌毛蛋白基因fimY和副溶血性弧菌毒力表達(dá)調(diào)控基因toxS為靶基因，建立檢測3種致病菌的多重實(shí)時熒光PCR方法，為建立和完善食品接觸材料中3種食源性致病菌快速檢測技術(shù)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

試驗(yàn)中所用菌株共6株，其中目標(biāo)菌株金黃色葡萄球菌（ATCC25923）、副溶血性弧菌（ATCC17802）：北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司；鼠傷寒沙門氏菌（CGMCC1.1174）：中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心；其余3種供試菌種表皮葡萄球菌（ATCC12228）、大腸埃希氏菌（ATCC25922）：北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司；創(chuàng)傷弧菌（ATCC27562）：廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。所有菌株均保存于福建省產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)研究院食品所微生物室菌種保藏庫。

1.1.2 食品接觸材料

食品接觸材料種類繁多，為了便于材料的高壓滅菌及人工制備細(xì)菌污染樣品，隨機(jī)抽取某食堂的清洗消毒后的不銹鋼餐具碗，標(biāo)記為食品接觸材料S。

1.1.3 主要試劑

細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、溶菌酶（50 mg/mL）：天根生化科技有限公司；10×PCR緩沖液、25 mmol/L MgCl2、10 mmol/L脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleotidetriphosphates，dNTPs）、TaqDNA 聚合酶（5U/μL）：上海生工生物工程股份有限公司。

腦心浸出液肉湯（brain heart infusion broth，BHI）、Baird-Parker瓊脂培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂（nutrient agar，NA）平板、緩沖蛋白胨水（bufferedpeptonewater，BPW）、7.5%NaCl肉湯、3%NaCl堿性蛋白胨水、硫代硫酸鹽-檸檬酸鹽-膽鹽-蔗糖瓊脂培養(yǎng)基（thiosulfate citrate bile salts sucrose agar culture medium，TCBS）：北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司；沙門氏菌顯色平板、金黃色葡萄球菌顯色平板、副溶血性弧菌顯色平板：法國科瑪嘉公司。

引物和探針：以金黃色葡萄球菌谷氨酰胺合成酶家族蛋白編碼基因gltS、沙門氏菌屬菌毛蛋白基因fimY和副溶血性弧菌毒力表達(dá)調(diào)控基因toxS為靶基因設(shè)計特異性引物和探針，見表1。各引物探針均由上海生工生物工程股份有限公司合成。

表1 引物和探針序列Table 1 Sequences of primers and probes

1.1.4 主要儀器

ABI 7500實(shí)時熒光定量PCR儀：美國Life Tech公司；Minispin臺式離心機(jī)：德國Eppendorf公司；IKAMS3 basic渦旋混合器：上海琪特分析儀器有限公司；SterilGARDⅢAdvance生物安全柜：美國Baker公司；HVE50高壓滅菌鍋：日本Hirayama公司。

1.2 方法

1.2.1 菌種培養(yǎng)及細(xì)菌DNA提取

所有菌株經(jīng)BHI肉湯活化及純化培養(yǎng)后取1 mL細(xì)菌純培養(yǎng)液或樣品增菌液，13 000 r/min室溫離心5 min，棄去上清，使用溶菌酶37℃處理1 h，用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取細(xì)菌DNA，以BHI培養(yǎng)基提取物為陰性對照。

取金黃色葡萄球菌、沙門氏菌和副溶血性弧菌經(jīng)BHI肉湯活化后的菌液用無菌生理鹽水梯度稀釋至10-6。分別取10-5、10-6稀釋液0.2 mL涂布于各自的選擇性平板培養(yǎng)計數(shù)，每種菌每個稀釋度涂布兩個平板。同時采用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取各個稀釋度的細(xì)菌DNA。

1.2.2 單重?zé)晒釶CR反應(yīng)

分別以金黃色葡萄球菌、沙門氏菌和副溶血性弧菌的基因組DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增。單重?zé)晒釶CR反應(yīng)體系：10×PCR Buffer 5 μL，25 mmol/L MgCl24 μL，10 mmol/L dNTPs 1 μL，10 μmol/L 上下游引物各 2 μL，探針1μL，5U/μLTaqDNA聚合酶1μL，模板DNA3μL，ddH2O補(bǔ)足至50 μL。反應(yīng)參數(shù)：94℃預(yù)變性10 min；94℃變性15 s，60℃退火并延伸60 s，45個循環(huán)，在每個循環(huán)的退火延伸階段收集熒光信號。所有PCR試驗(yàn)均以BHI培養(yǎng)基提取物為陰性對照，以無菌超純水為空白對照。

1.2.3 多重實(shí)時熒光PCR反應(yīng)的建立和優(yōu)化

以 50 μL 反應(yīng)體系中 10 × PCR Buffer 5 μL、25 mmol/L MgCl24 μL 和 10 mmol/L dNTPs 1 μL 為基礎(chǔ)，對3株目標(biāo)菌株的引物、探針和Taq DNA聚合酶的使用量進(jìn)行優(yōu)化，確認(rèn)最優(yōu)多重實(shí)時熒光PCR反應(yīng)體系。設(shè)立培養(yǎng)基提取陰性對照和無菌水空白對照。

1.2.4 特異性試驗(yàn)

將金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、副溶血性弧菌和其他3種供試菌種的基因組DNA提取液等量混合，依據(jù)1.2.3優(yōu)化后的體系進(jìn)行三重?zé)晒釶CR檢測，驗(yàn)證方法特異性。設(shè)立培養(yǎng)基提取陰性對照和無菌水空白對照。

1.2.5 靈敏度試驗(yàn)

以金黃色葡萄球菌、沙門氏菌和副溶血性弧菌各個稀釋度的細(xì)菌DNA提取液為模板分別進(jìn)行多重實(shí)時熒光PCR檢測，確定方法的靈敏度。設(shè)立培養(yǎng)基提取陰性對照和無菌水空白對照。

1.2.6 模擬陽性樣品檢測

將食品接觸材料S于121℃高壓蒸汽滅菌30 min，獲得無菌樣品，用于人工污染菌液。待材料表面干燥后，將金黃色葡萄球菌、沙門氏菌和副溶血性弧菌3種菌株培養(yǎng)液各取0.2 mL滴加到同一材料的食品接觸表面，輕輕轉(zhuǎn)動材料使菌液盡可能覆蓋與食物接觸的內(nèi)壁表面。

用1 mL無菌生理鹽水濕潤10張2.0 cm×2.5 cm（5 cm2）滅菌濾紙片（總面積為 50 cm2）[6]。選擇材料與食物接觸的內(nèi)壁表面，貼上10張濕潤的滅菌濾紙片。30 s后取下，置于相應(yīng)的液體培養(yǎng)基內(nèi)，37℃增菌18 h～24 h，用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取細(xì)菌DNA，依據(jù)1.2.3優(yōu)化后的體系進(jìn)行三重?zé)晒釶CR檢測，并設(shè)立培養(yǎng)基陰性對照和無菌水空白對照。

2 結(jié)果與分析

2.1 單重實(shí)時熒光PCR

金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、副溶血性弧菌的單重?zé)晒釶CR擴(kuò)增，結(jié)果見圖1至圖3。由圖1～圖3可知，金黃色葡萄球菌、沙門氏菌和副溶血性弧菌的單重?zé)晒釶CR擴(kuò)增效果良好。3對引物探針的退火溫度基本一致，擴(kuò)增片段長度差異不大，擴(kuò)增效率較好，適合構(gòu)建多重實(shí)時熒光PCR體系。

2.2 多重實(shí)時熒光PCR

圖1 金黃色葡萄球菌的單重?zé)晒釶CR擴(kuò)增圖Fig.1 A single real-time PCR assay of Staphylococcus aureus

3株目標(biāo)菌的三重?zé)晒釶CR擴(kuò)增結(jié)果見圖4。通過試驗(yàn)比較，3對引物探針之間不會產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增，可構(gòu)建三重?zé)晒釶CR體系。對體系進(jìn)行優(yōu)化后確定最佳反應(yīng)體系為：10×PCR Buffer 5 μL，25mmol/L MgCl24 μL，10 mmol/L dNTPs 1 μL，10 μmol/L 上下游引物各 1.5 μL，探針各 1 μL，5 U/μL Taq DNA 聚合酶1.5 μL，模板 DNA 3 μL，ddH2O 補(bǔ)足至 50 μL。反應(yīng)參數(shù)：94℃預(yù)變性10 min；94℃變性15 s，60℃退火并延伸60 s，45個循環(huán)，在每個循環(huán)的退火延伸階段收集熒光信號。

圖2 沙門氏菌的單重?zé)晒釶CR擴(kuò)增圖Fig.2 A single real-time PCR assay of Salmonella

圖3 副溶血性弧菌的單重?zé)晒釶CR擴(kuò)增圖Fig.3 A single real-time PCR assay of Vibrio parahaemolyticus

2.3 特異性試驗(yàn)

3株目標(biāo)菌的多重實(shí)時熒光PCR的特異性檢測結(jié)果見圖5。根據(jù)優(yōu)化后的多重實(shí)時熒光PCR方法，同時擴(kuò)增金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、副溶血性弧菌、表皮葡萄球菌、大腸埃希氏菌和創(chuàng)傷弧菌6種基因組DNA，結(jié)果顯示金黃色葡萄球菌、沙門氏菌和副溶血性弧菌3株目標(biāo)菌有擴(kuò)增曲線，而表皮葡萄球菌、大腸埃希氏菌和創(chuàng)傷弧菌3株非目標(biāo)菌無擴(kuò)增曲線，證明該方法具有良好的特異性。

2.4 靈敏度試驗(yàn)

3株目標(biāo)菌的多重實(shí)時熒光PCR靈敏度檢測結(jié)果見圖6至圖8。金黃色葡萄球菌、沙門氏菌和副溶血性弧菌經(jīng)平板計數(shù)，菌液濃度分別為4.8×107、6.2×107、4.4×107CFU/mL，以 1×107CFU/mL 為起始進(jìn)行 10 倍系列稀釋，共7個稀釋度，以各個稀釋度的細(xì)菌DNA提取液為模板進(jìn)行多重實(shí)時熒光PCR檢測。結(jié)果顯示金黃色葡萄球菌、沙門氏菌和副溶血性弧菌的PCR檢測靈敏度均達(dá)到103CFU/mL。

圖4 多重實(shí)時熒光PCR擴(kuò)增圖Fig.4 Multiplex real-time PCR assay

圖5 多重實(shí)時熒光PCR的特異性檢測結(jié)果Fig.5 The specificity of multiplex real-time PCR assay

圖6 金黃色葡萄球菌多重實(shí)時熒光PCR的靈敏度檢測結(jié)果Fig.6 The sensitivity of multiplex real-time PCR for detecting Staphylococcus aureus

圖7 沙門氏菌多重實(shí)時熒光PCR的靈敏度檢測結(jié)果Fig.7 The sensitivity of multiplex real-time PCR for detecting Salmonella

圖8 副溶血性弧菌多重實(shí)時熒光PCR的靈敏度檢測結(jié)果Fig.8 The sensitivity of multiplex real-time PCR for detecting Vibrio parahaemolyticus

2.5 食品接觸材料模擬陽性樣品的檢測

食品接觸材料S經(jīng)高壓滅菌后人工污染致病菌模擬陽性樣品，其多重實(shí)時熒光PCR檢測結(jié)果見圖9。結(jié)果顯示3株目標(biāo)菌的擴(kuò)增曲線良好，特異性強(qiáng)，與預(yù)期相符，說明在檢測食品接觸材料中的金黃色葡萄球菌、沙門氏菌和副溶血性弧菌3種致病菌方面，本方法具有較好的特異性和實(shí)用性。

3 結(jié)論與討論

目前針對食品接觸材料中致病菌檢測的研究較少，本研究成功建立了食品接觸材料中金黃色葡萄球菌、沙門氏菌和副溶血性弧菌3種致病菌的多重實(shí)時熒光PCR檢測方法，具有良好的特異性，檢測靈敏度均達(dá)到103CFU/mL，熒光信號不會互相干擾。

現(xiàn)行的食品微生物檢測國家標(biāo)準(zhǔn)為分離培養(yǎng)法，該傳統(tǒng)方法相對成熟，假陽性率低，但檢測步驟包括前增菌、選擇性增菌、菌落分離、生化鑒定等步驟，檢測周期一般需要3 d～7 d，檢測靈敏度相對也較低[7-10]。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，基于PCR技術(shù)的多種檢測方法也得到了廣泛應(yīng)用，其中多重實(shí)時熒光PCR技術(shù)采用多對引物和相應(yīng)的探針在同一反應(yīng)中能同時擴(kuò)增出多個目標(biāo)序列，應(yīng)用至食源性致病菌的檢測方面快捷高效，針對性強(qiáng)，國內(nèi)外已有不少相關(guān)研究[11-15]。但也有文獻(xiàn)報道，多重PCR技術(shù)可能出現(xiàn)假陽性結(jié)果或交叉擴(kuò)增現(xiàn)象，這可能是由于樣品中含有大量死菌或干擾檢驗(yàn)的復(fù)雜成分[16-17]。在實(shí)際操作中，食品接觸材料中的致病菌含量并不是很高，因此無論是傳統(tǒng)培養(yǎng)法還是PCR法檢測都需要增菌過程，去除因樣品中的死菌或特殊成分造成的影響，提高檢測準(zhǔn)確率[18]。此外，在檢驗(yàn)工作中可以將多重實(shí)時熒光PCR法與傳統(tǒng)培養(yǎng)法相結(jié)合，對于PCR陽性樣品進(jìn)行病原菌分離培養(yǎng)和生化鑒定等驗(yàn)證，排除假陽性結(jié)果，對于PCR陰性樣品則可以直接判定。

因此，應(yīng)用多重實(shí)時熒光PCR法檢測食品接觸材料中的食源性致病菌是行之有效的，未來還可針對更多食品接觸材料相關(guān)的致病菌建立多重實(shí)時熒光PCR快速檢測方法，并隨著其他檢測技術(shù)的更新?lián)Q代得到更廣泛的應(yīng)用[19]。