劉景玲，王夢涵，曹翠玲，段敏，周自云，*，梁宗鎖

（1.西北農(nóng)林科技大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，陜西楊凌712100；2.浙江理工大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，浙江杭州310018）

珊瑚樹（Viburnum odoratissimum）是忍冬科（Caprifoliaceae）莢蒾屬（Viburnum Linn.）植物，常綠灌木或小喬木，始載于《中國高等植物圖鑒》。珊瑚樹具有較強耐火性[1]和抗寒性[2]，對城市空氣中顆粒污染物滯塵量高，是廣受歡迎的綠化樹種[3]。已有研究表明珊瑚樹中主要含有二萜、三萜、黃酮、倍半萜等化合物[4-6]。其枝葉可入藥，有通經(jīng)活絡(luò)功效，主治風(fēng)濕痹痛、跌打腫痛、骨折[7]。長期以來，對珊瑚樹的研究主要集中在園林綠化、抗寒以及化學(xué)成分等方面。其天然產(chǎn)物和藥用價值未被充分開發(fā)，而關(guān)于珊瑚樹中原花青素的研究鮮見報道。

原花青素（proanthocyanidins，PC）是一種分子結(jié)構(gòu)特殊的生物類黃酮，由不同數(shù)量的兒茶素或表兒茶素縮合而成，是目前發(fā)現(xiàn)的效果最好的自由基清除劑之一，以高效、低毒、高生物利用率著稱，在食品、化妝品、醫(yī)藥等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛[8-10]。原花青素的提取方法主要有溶劑萃取法[11]、超聲輔助提取法[12-13]、酶法提取法[14]等。超聲波輔助提取原花青素具有時間短、操作簡單、提取率高等優(yōu)點而備受關(guān)注。趙春艷等[15]在山楂果中提取原花青素，采用微波法提取率是傳統(tǒng)方法的2倍。賈寶珠等[16]以香蕉皮為原料，分別采用溶劑提取法和超聲波輔助提取法對原花色素的提取工藝進行研究，結(jié)果表明超聲波輔助提取法的最佳提取時間僅為溶劑提取法的40%，得率和純度卻分別為溶劑提取法的1.5倍和1.6倍。

該課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，珊瑚樹韌皮部和葉片中富含原花青素（乙醇一次性提取率達到18.32%和18.59%），高于已有報道，張曉娟等[17]以超聲輔助提取葡萄皮中原花青素得率為8.02%；公云等[11]在茄皮中原花青素提取率為10.46%；趙文娟等[18]測得黑果枸杞原花青素提取率4.32%。因此，為了拓展珊瑚樹資源利用潛力，本研究擬以乙醇為提取劑，采用超聲波輔助提取法提取珊瑚樹葉片中原花青素，利用響應(yīng)面分析法篩選最優(yōu)工藝，以期為珊瑚樹葉中原花青素的進一步開發(fā)及利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

珊瑚樹：西北農(nóng)林科技大學(xué)校園。經(jīng)西北農(nóng)林科技大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院吳振海副教授鑒定為忍冬科莢蒾屬植物珊瑚樹。取新鮮完全展開的功能葉片，烘箱45℃烘干，粉碎后過80目篩，于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 儀器與試劑

UV-1700紫外-可見分光光度計：日本島津；SB25-12DTD超聲波清洗機：寧波新芝生物科技股份有限公司；HC-3618R離心機：安徽中科中佳科學(xué)儀器公司；乙醇、甲醇、鹽酸、硫酸、香草醛均為分析純：西隴化工股份有限公司；葡萄籽原花色素標(biāo)準(zhǔn)品（純度95%）：上海源葉生物科技有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 珊瑚樹葉片原花青素提取工藝流程

揀選成熟完整珊瑚樹葉片→烘干（45℃）→粉碎（過80目篩）→提取→離心→原花青素粗提液

選取完整的珊瑚樹成熟葉片，清水沖洗后檫干，置45℃烘箱中烘至恒重，再用粉碎機粉碎，過80目篩，得珊瑚樹葉片粉末。在超聲頻率40 kHz下，考察不同乙醇濃度（60%、70%、80%、90%、100%）、料液比[1 ∶10、1 ∶20、1 ∶30、1 ∶40、1 ∶50（g/mL）]、提取時間（20、30、40、50、60 min）對珊瑚樹葉片中原花青素提取率的影響。

1.3.2 原花青素定量分析

利用改良的香草醛-鹽酸比色法[19]對原花青素進行定量分析。分別配制1 g/100 mL的香草醛-甲醇溶液及1 mol/L的鹽酸-甲醇溶液，臨用時將二者按體積比1∶1充分混勻，即制得比色工作液。稱取葡萄籽原花青素分析標(biāo)準(zhǔn)品，以甲醇溶解，配制成質(zhì)量濃度為0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、6.0 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液，然后分別取100 μL上述標(biāo)準(zhǔn)溶液，加入3 mL的比色工作液，混勻，室溫條件下反應(yīng)30 min，以甲醇調(diào)零，測定500 nm波長處的吸光度（A500nm）值，繪制 A500nm（Y）與葡萄籽原花青素標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度（X）的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1，得到回歸方程：Y=0.273 2X（R2=0.994），各樣品以同法測定，含量由回歸方程計算，然后計算原花青素提取率[20]。

圖1 原花青素標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of proanthocyanidins

1.3.3 單因素和響應(yīng)面設(shè)計試驗

在其他條件相同的條件下，分別研究乙醇濃度（60%、70%、80%、90%、100%），料液比[1 ∶10、1 ∶20、1 ∶30、1 ∶40、1 ∶50（g/mL）]和超聲時間（20、30、40、50、60 min）3個單因素對原花青素提取率的影響。在單因素試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken試驗設(shè)計原理，以原花青素提取率為響應(yīng)值，進行三因素三水平的響應(yīng)面分析。

1.3.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

采用Excel 2003和Design-Expert 8.0.6軟件進行數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 乙醇濃度對珊瑚樹葉中原花青素提取率的影響

在料液比1∶30（g/mL），超聲時間37 min條件下，考察不同乙醇濃度對原花青素提取率的影響見圖2。

圖2 乙醇濃度對原花青素提取率的影響Fig.2 Effcect of ethanol concentration on the extraction rate of proanthocyanidins

由圖2可知，隨著乙醇濃度增加原花青素提取率增加，90%乙醇濃度下提取率達到最大值18.59%，100%濃度乙醇提取率最低。這可能與原花青素極性有關(guān)，因此選擇90%作為最佳乙醇提取濃度。

2.1.2 料液比對珊瑚樹葉中原花青素提取率的影響

圖3 料液比對原花青素提取率的影響Fig.3 Effcect of solid-liquid ratio on the extraction rate of proanthocyanidins

料液比對原花青素提取率的影響見圖3。如圖3所示，珊瑚樹葉中原花青素提取率隨料液比變化呈現(xiàn)先增加后減少趨勢，表明溶劑量較小時候原花青素提取不完全，在料液比1∶30（g/mL）條件下原花青素提取率最高，隨后溶劑量增加原花青素提取量降低，因此選擇料液比1∶30（g/mL）作為最適料液比條件。

2.1.3 超聲時間對珊瑚樹葉中原花青素提取率的影響

珊瑚樹葉中原花青素提取率隨超聲時間變化如圖4所示。

圖4 超聲時間對原花青素提取率的影響Fig.4 Effcect of ultrasonic time on the extraction rate of proanthocyanidins

呈現(xiàn)先增加后減少的變化趨勢，這可能是因為時間短原花青素未能充分提取，而時間過長導(dǎo)致原花青素酚羥基結(jié)構(gòu)破壞，提取率反而下降，因此，選取40 min作為超聲提取原花青素的最佳時間。

2.2 響應(yīng)面試驗結(jié)果及分析

2.2.1 響應(yīng)面試驗設(shè)計與結(jié)果分析

根據(jù)單因素試驗所確定的各因素水平，進行Box-Benhnken中心組合的試驗設(shè)計，試驗因素和水平設(shè)計如表1所示。

表1 響應(yīng)面試驗因素及水平Table 1 Variables and levels of response surface design

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，根據(jù)Design-Expert 8.0.6軟件的Box-Behnken設(shè)計響應(yīng)面試驗，其中1號～12號為析因點，13號～17號為零點，是區(qū)域的中心點，用來估計試驗誤差。珊瑚樹葉原花青素提取率為響應(yīng)值，響應(yīng)面試驗設(shè)計方案及結(jié)果見表2。

表2 原花青素提取得率響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 Design and results of response surface analysis for the optimization of extraction conditions of PC

2.2.2 模型的建立與顯著性分析

利用Design-Expert 8.0.6軟件，建立提取溶液乙醇濃度、液料比及超聲時間三因子數(shù)學(xué)回歸模型為：R1=15.32-4.73×A-0.60×B+0.23×C+0.005×AB+0.53×AC+0.27×BC-4.60×A2-0.21×B2-0.53×C2

對二次方程進行方差分析見表3。

結(jié)果表明：A、B、AC、A2、C2因素對原花青素提取率影響顯著，表明這3個因素對原花青素提取率均有影響；其中乙醇濃度和超聲時間的交互作用也會對原花青素提取率有顯著影響。進一步分析方程方差可知，二次多項的回歸項P值＜0.000 1，差異極顯著（P＜0.01），失擬項 P 值為 0.360 7，不顯著（P＞0.05）。所以該模型的擬合度較高，可以用于對二次回歸方程的相應(yīng)值進一步預(yù)測；此外，該模型的決定系數(shù)R2=0.996 3，表明預(yù)測值與真實值有較高的相關(guān)性；而變異系數(shù)C.V.=2.98，說明試驗可操作性較好。R2=0.966 9和R2Adj=0.991 6說明模型可以解釋99.16%響應(yīng)值的變化，只有總變異的0.84%不可以用此模型解釋，說明該模型的擬合度較好。

表3 二次回歸方程方差分析Table 3 Analysis of variance the regression model

綜上述分析可知，此模型可以用來分析和預(yù)測珊瑚樹葉片中原花青素提取率的真實情況。3種因子對原花青素提取率的影響程度為：A＞B＞C，即乙醇濃度＞料液比＞超聲時間。

2.2.3 響應(yīng)面交互作用分析

響應(yīng)面曲面圖直觀地反映乙醇濃度、料液比和超聲時間對原花青素提取率的影響如圖5～圖7所示。

對比圖5～圖7，乙醇體積分數(shù)對原花青素提取率影響最大，表現(xiàn)為圖5、圖6的曲面較陡；其次是液料比；超聲時間表現(xiàn)為響應(yīng)面相對較為平緩，說明其對原花青素提取率影響較小。響應(yīng)面圖投影面為等高線圖，等高線的形狀可反映出各因素交互作用的強弱，由等高線形狀分析，除乙醇濃度與超聲時間的交互因素較強外（圖6），其余各因素間的交互作用不強，表現(xiàn)為其等高線橢圓形狀不明顯，這與回歸方程的方差分析結(jié)果相一致。

圖5 乙醇濃度和料液比對珊瑚樹原花青素提取影響的響應(yīng)面圖與等高線圖Fig.5 The response surface plot and contour plot for extracting the PC from the Viburnum odoratissimum under alcohol concentration and solid-liquid ratio

圖6 乙醇濃度和超聲時間對珊瑚樹原花青素提取影響的響應(yīng)面圖與等高線圖Fig.6 The response surface plot and contour plot for extracting the PC from the Viburnum odoratissimum under alcohol concentration and the ultrasonic time

圖7 超聲時間和料液比對珊瑚樹原花青素提取影響的響應(yīng)面圖與等高線圖Fig.7 The response surface plot and contour plot for extracting the PC from the Viburnum odoratissimum under the ultrasonic time and solid-liquid ratio

2.2.4 最優(yōu)工藝條件及驗證試驗

為驗證響應(yīng)面法所得結(jié)果的可靠性，對模型優(yōu)化的工藝條件進行驗證。選擇工藝參數(shù)：乙醇濃度85%、料液比1∶40（g/mL）、超聲時間37 min，進行試驗3次，3次驗證試驗原花青素提取率平均值為16.92%，RSD值為1.29%，且與模型預(yù)測值16.98%非常接近，說明方程與真實試驗情況擬合較好，試驗得到的優(yōu)化參數(shù)是穩(wěn)定可靠的。

3 結(jié)論

以響應(yīng)面分析法對珊瑚樹葉中原花青素進行超聲輔助提取工藝優(yōu)化，擬合了乙醇濃度、料液比、超聲時間三個因素對原花青素提取率影響的回歸模型，分析認為各因素對提取率的影響大小順序為：乙醇濃度＞料液比＞超聲時間。得到最佳工藝參數(shù)為：乙醇濃度 85%，料液比 1 ∶40（g/mL）、超聲時間 37 min。在此條件下，原花青素提取率為16.92%，與預(yù)測值接近，其相對誤差為1.29%，說明試驗優(yōu)化得到的技術(shù)參數(shù)可靠。該條件下得到的原花青素提取率16.92%介于單因素試驗中乙醇濃度80%的提取率（14.16%）和90%的提取率（18.59%）之間，也印證了乙醇濃度是影響提取率的最重要因素的結(jié)論。采用超聲輔助提取珊瑚樹葉中的原花青素，提取率高，操作簡單，為珊瑚樹葉中原花青素的進一步開發(fā)利用提供依據(jù)。