孫墨可 李曉薇 張曼 田娟 董玉迪

摘 要：比較2種DNA提取方法提取靈芝菌絲體基因組DNA之間的差異，分別用改良的CTAB法和TPS法提取10株菌絲體基因組DNA，用超微量紫外分光光度計(jì)測(cè)定和瓊脂糖凝膠電泳的方法進(jìn)行濃度及純度的測(cè)定。結(jié)果表明：利用改良的CTAB法提取靈芝菌絲體基因組DNA得到的濃度與純度較高，但耗費(fèi)時(shí)間較長(zhǎng)；利用TPS法提取的靈芝菌絲體基因組濃度與純度相對(duì)較低，但相對(duì)耗費(fèi)時(shí)間較短；這2種方法提取的基因組都可以用于后續(xù)的PCR擴(kuò)增反應(yīng)。

關(guān)鍵詞：靈芝；CTAB；TPS；基因組

中圖分類(lèi)號(hào) S567.31 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-7731（2018）21-0034-02

靈芝（Ganoderma lingzhi）是我國(guó)著名的食藥用真菌，有著悠久的歷史文化[1]。靈芝含有多糖、萜類(lèi)化合物、核苷、生物堿、氨基酸多肽、微量元素等多種活性成分?，F(xiàn)代藥理研究表明，靈芝具有保肝、抗腫瘤、抗HIV-1及HIV-1蛋白酶活性、抗組織胺釋放、抑制血管緊張素、抗氧化、調(diào)節(jié)免疫及延緩衰老的作用[2-6]。當(dāng)前對(duì)靈芝分子生物學(xué)研究不斷深入，如靈芝中的基因克隆與表達(dá)，轉(zhuǎn)化體系的建立等[7-9]。靈芝基因組的提取是進(jìn)行后續(xù)分子生物學(xué)研究的基礎(chǔ)，基因組DNA的質(zhì)量直接影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)的質(zhì)量，實(shí)驗(yàn)過(guò)程耗時(shí)少也是許多研究者的追求。CTAB是一種陽(yáng)離子去污劑，具有從低離子強(qiáng)度溶液中沉淀核酸與酸性多聚糖的特性[10]。TPS法是一種快速提取小量DNA的方法，最初用到水稻上。筆者利用CTAB法與TPS法分別提取靈芝基因組DNA以進(jìn)行比較，旨在為今后靈芝分子生物學(xué)方面的科研提供較適宜的DNA提取方法。

1 材料與方法

1.1 菌株 靈芝（G.lingzhi）由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)菌物研究所提供。取生長(zhǎng)在PDA培養(yǎng)基上的7～10d的靈芝菌絲10株，進(jìn)行靈芝基因組DNA的提取。

1.2 試劑與儀器 試劑：Tris-HCl，EDTA，KCl，氯仿，異戊醇，異丙醇，乙醇等。儀器：人工氣候培養(yǎng)箱（日本日立），電泳儀（JUNYI），離心機(jī)，凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)UVP），超微量紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（Thermo），電子天平（Denver）等。

1.3 方法

1.3.1 CTAB法提取靈芝基因組 CTAB法提取基因組步驟如下：1）將靈芝菌絲加液氮研磨成粉末狀；2）加入700μL的CTAB提取緩沖液，混勻（CTAB在65℃水浴預(yù)熱），每5min輕輕震蕩幾次，20min后放入離心機(jī)中12000r/min，離心15min；3）小心吸取上清液，加入等體積的酚：氯仿（各400μL）溶液，混勻，4℃，12000r/min，離心10min；4）小心吸取上清液，加入等體積的氯仿，混勻，4℃，12000r/min，離心10min；5）重復(fù)步驟（4）1～2次，以蛋白層不出現(xiàn)為止；6）取上清，-20℃沉淀1h，4℃，12000r/min，離心10min；7）棄去上清液，用70%乙醇洗滌沉淀2次；8）室溫下超凈臺(tái)干燥后，溶于50uLddH2O溶解DNA，于-20℃保存。用超微量紫外分光光度計(jì)測(cè)定和瓊脂糖凝膠電泳的方法進(jìn)行濃度及純度的測(cè)定。

1.3.2 TPS法提取靈芝基因組 TPS法提取靈芝基因組步驟如下：1）將靈芝菌絲加液氮研磨成粉末狀加入65℃預(yù)熱的TPS DNA提取液700uL，充分混勻；2）65℃水浴30min，期間顛倒混勻3～4次；3）加入氯仿/異戊醇/乙醇（體積比為20∶1∶4），混合搖勻，4℃，12000r/min，離心10min，轉(zhuǎn)移上清至新的離心管中；4）加入等體積的異丙醇，顛倒混勻，-20℃放置10min，4℃，12000r/min，離心10min，棄上清；5）加70%乙醇500uL洗滌沉淀，4℃，12000r/min，低速離心5min，棄上清，超凈臺(tái)吹干沉淀，加入50uLddH2O溶解DNA；6）置于-20℃保存。用超微量紫外分光光度計(jì)測(cè)定和瓊脂糖凝膠電泳的方法進(jìn)行濃度及純度的測(cè)定。

1.3.3 紫外分光光度計(jì)檢測(cè)DNA 取DNA樣品1μL，用超微量紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定DNA樣本在260nm和280nm的吸光度A，DNA純度以A260/A280的值確定，同時(shí)測(cè)定提取DNA的濃度。

1.3.4 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA 配制1%的瓊脂糖凝膠，取2μL DNA樣品，120V電泳25min，凝膠成像系統(tǒng)分析電泳結(jié)果，對(duì)提取DNA進(jìn)行完整性檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA濃度及純度 利用CTAB法和TPS提取出的靈芝基因組DNA分別用超微量紫外分光光度計(jì)測(cè)定（見(jiàn)表1），2種方法提取的DNA吸光度比值都符合標(biāo)準(zhǔn)。CTAB法提取的DNA濃度平均值為197.81μg/mL，TPS法提取的DNA濃度值平均為44.78μg/mL。CTAB法提取的DNA比TPS法提取的DNA濃度要高。

2.2 DNA完整性的測(cè)定 利用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA，檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖1，用凝膠成像系統(tǒng)分析電泳結(jié)果并成像，對(duì)提取DNA進(jìn)行完整性檢測(cè)。CTAB法DNA量較多，條帶清晰。TPS法提取的DNA量相對(duì)較少，但完整性很好，沒(méi)有降解。

3 結(jié)論

DNA的提取是進(jìn)行分子生物學(xué)研究的基礎(chǔ)[11]。在靈芝分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中，DNA提取大多數(shù)使用的是CTAB法。該方法程序復(fù)雜，從取樣到提取出基因組DNA，需要6～8h，但提取出的DNA質(zhì)量較高。TPS法是一種快速提取小量DNA的方法，最初用在水稻上。與CTAB法相比，TPS法簡(jiǎn)化了操作步驟，節(jié)省了時(shí)間，但提取出的DNA質(zhì)量相對(duì)較低，適合小量檢測(cè)應(yīng)用。2種方法各有利弊，可根據(jù)具體的條件選擇合適的方法。近年來(lái)，許多學(xué)者也相繼開(kāi)展了靈芝的分子生物學(xué)研究工作，因此提高靈芝基因組DNA提取方法，對(duì)于提高靈芝后續(xù)的分子生物學(xué)研究有重要的意義。

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（責(zé)編：徐世紅）