肖雙凱,張江松,焦俊玥,趙逸彬,林咸明

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大鼠斑蝥酊天灸發(fā)泡的影響因素探討

肖雙凱,張江松,焦俊玥,趙逸彬,林咸明

(浙江中醫(yī)藥大學,杭州 310053)

探討大鼠斑蝥酊天灸發(fā)泡的相關影響因素。采用斑蝥酊刺激大鼠皮膚,觀察并統(tǒng)計斑蝥酊藥物濃度、藥物劑量、斑蝥酊貼藥時間、貼藥后是否加壓、是否重復加藥、大鼠發(fā)泡部位、室溫等方面的差異性。5% 200mL的斑蝥酊貼敷于SD大鼠項部兩耳后脊柱兩旁區(qū)域,并在2 h后重復給藥200mL 1次, 4 h后可以實現(xiàn)穩(wěn)定的天灸發(fā)泡。大鼠天灸穩(wěn)定發(fā)泡的影響因素以人為因素為主,包括藥物濃度、發(fā)泡部位、斑蝥酊貼藥時間、是否重復加藥、室溫。控制好人為因素可以提高SD大鼠天灸發(fā)泡模型制備的成功率和穩(wěn)定性。

發(fā)泡療法;灸法;斑蝥酊;大鼠

天灸是采用刺激性較強的中藥貼敷在皮膚特定穴位,使局部發(fā)熱、充血、發(fā)紅、發(fā)泡甚至化膿的一種外治方法[1]。目前,國內外關于天灸的動物實驗和臨床研究均因缺乏穩(wěn)定的大鼠天灸發(fā)泡模型而受到限制。斑蝥是天灸臨床和實驗中常用的發(fā)泡藥物,相對于傳統(tǒng)的白芥子發(fā)泡具有一定的優(yōu)勢[2]。筆者通過對斑蝥劑型的改良,不斷嘗試,終于探索出了一種穩(wěn)定的大鼠天灸發(fā)泡方法。同時,筆者經(jīng)過前期大量預實驗和查閱文獻,發(fā)現(xiàn)影響大鼠斑蝥酊天灸發(fā)泡的因素主要以人為因素為主,包括斑蝥酊藥物濃度、藥物劑量、貼藥時間、是否重復加藥、發(fā)泡部位及室溫等。為了提高該模型制備的成功率和穩(wěn)定性,本文從這些方面進行展開,以期為天灸的實驗研究提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與預處理

選用健康雄性清潔級Sprague-Dawley(SD)大鼠,體重為(250±10)g,購自浙江省實驗動物中心(許可證號SCXK浙2014-0001),由浙江中醫(yī)藥大學實驗動物中心飼養(yǎng)。飼養(yǎng)期間給予嚙齒類動物標準顆粒飼料及自由飲水。實驗過程中對動物的處置符合《關于善待實驗動物的指導性意見》[3]中相關規(guī)定。

實驗前應進行大鼠發(fā)泡區(qū)域的備皮。大鼠腹腔麻醉后,于項部兩耳后脊柱兩旁(相當于大椎穴處)等距離、等面積用薇婷脫毛膏脫毛4 cm2,用生理鹽水清潔,室溫控制在26℃,大鼠于恒溫臺上安置。

1.2 實驗試劑與藥物

斑蝥粉(華東醫(yī)藥公司,批號100722);95%乙醇(上海展云化工有限公司,批號20140412);5 cm×5 cm內圈1 cm新型PU防水空白膏藥貼(連云港三瑞醫(yī)療器械制造有限公司);PU防水膜(連云港三瑞醫(yī)療器械制造有限公司);薇婷脫毛膏(利潔時家化有限公司)。

1.3 斑蝥酊的配制及發(fā)泡藥貼的準備

1.3.1 斑蝥酊的配制

分別用5 g、10 g、20 g、30 g的生藥斑蝥粉浸泡于95%乙醇中,定容至100 mL,1周后過濾而成,放置在4℃冰箱保存,從而得到不同濃度的斑蝥酊,即5%斑蝥酊、10%斑蝥酊、20%斑蝥酊、30%斑蝥酊。

1.3.2 發(fā)泡藥貼的準備

稱取0.018 g棉球填充于PU防水空白膏藥貼的中央,輕輕按壓,以棉球剛好填充滿并且不高突于發(fā)泡藥貼的中心圈為度。

1.4 實驗方法

1.4.1 天灸發(fā)泡方法

上述準備工作完成后,用移液槍吸取200mL斑蝥酊均勻浸濕發(fā)泡藥貼中心棉球后,貼敷于大鼠待發(fā)泡區(qū)域。發(fā)泡藥貼四周貼膜應當均勻,防止藥物揮發(fā)。2 h后加200mL斑蝥酊1次,用PU防水膜密封覆蓋,每隔1 h觀察并記錄1次。待泡體大小不再繼續(xù)增加,立即收集泡液。從中間區(qū)域剪下PU防水膜,鑷子夾出棉球并沿著發(fā)泡藥貼的內側緣提起,觀察發(fā)泡情況。大鼠于恒溫臺上安置,待蘇醒后單籠飼養(yǎng),每日觀察1～2次。

1.4.2 相關影響因素

1.4.2.1 不同斑蝥酊藥物濃度

32只雄性SD大鼠麻醉、脫毛后,吸取200mL 4種濃度(5%斑蝥酊、10%斑蝥酊、20%斑蝥酊、30%斑蝥酊)的斑蝥酊均勻浸濕發(fā)泡藥貼中央棉球后,貼敷刺激。2 h后各加200mL相應濃度的斑蝥酊1次,密封覆蓋,4 h后統(tǒng)一收集泡液。觀察各組發(fā)泡率和泡體大小情況,從而篩選出影響發(fā)泡率的最佳斑蝥酊濃度。同時,每隔1 h觀察發(fā)泡情況,并詳細記錄,以明確不同貼藥時間對發(fā)泡的影響。其他條件均控制相同。

1.4.2.2 藥物劑量

48只雄性SD大鼠麻醉、脫毛后,按照上述濃度隨機分為4組(5%斑蝥酊、10%斑蝥酊、20%斑蝥酊、30%斑蝥酊),每組12只。每組按照不同劑量又分為3組,即低劑量(50mL)4只、中等劑量(100mL)4只和最大劑量(200mL)4只。分別吸取不同劑量、不同濃度的斑蝥酊均勻浸濕發(fā)泡藥貼中央棉球后,貼敷刺激。其他方法同上,2 h后同樣各加相應劑量、相應濃度的斑蝥酊1次,觀察各組發(fā)泡率情況,從而篩選出影響發(fā)泡的最佳斑蝥酊劑量。其他條件均控制相同。

1.4.2.3 重復給藥

選用16只雄性SD大鼠,分為單次給藥組與重復給藥組,每組8只。單次給藥組只在初次給予5%斑蝥酊刺激,后續(xù)不重復給藥;重復給藥組在初次給予5%斑蝥酊刺激后的2 h,重復給藥1次。觀察重復給藥與否對于斑蝥酊天灸發(fā)泡的影響。其他條件均控制相同。

1.4.3 貼藥時間

據(jù)上述方法篩選出斑蝥酊最佳濃度和劑量之后,以此觀察不同貼藥時間組(2 h、4 h、6 h、8 h、12 h、24 h)大鼠發(fā)泡泡體大小的變化,每組8只,從而選出最佳收取泡液的時間點。

1.4.4 發(fā)泡部位

選取15只SD大鼠,分為3組,分別取背部3處部位發(fā)泡,即大椎穴處、背部正中線處和背部中線兩側0.5 cm處,每組5只。發(fā)泡方法同上所述,2 h后需重復給藥1次。大鼠大椎穴定位參照《實驗針灸學》[4]中大鼠標準穴位圖譜定位及部分相關文獻[5]。其他條件均控制相同。觀察不同部位對大鼠天灸發(fā)泡的影響。

1.4.5 室溫

選取15只SD大鼠,分別在不同室溫條件下適應性喂養(yǎng)3 d,然后進行天灸發(fā)泡,分為根據(jù)不同室溫[較低溫度(16℃)、適宜溫度(26℃)和高溫(36℃)]分為3組,每組5只。其他條件均控制相同。觀察不同室溫環(huán)境對大鼠天灸發(fā)泡的影響。

1.5 統(tǒng)計學方法

所有數(shù)據(jù)采用SPSS19.0軟件進行統(tǒng)計分析。符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差表示。多組間比較時,若方差齊采用單因素方差分析()-檢驗,方差不齊則用’-檢驗;組內前后比較采用重復測量資料的方差分析。以＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

因大鼠和人皮膚的差異性,目前尚無詳細的實驗性大鼠天灸發(fā)泡的文獻報道,筆者經(jīng)過多次反復實驗,發(fā)現(xiàn)泡體大小尚無法人為控制,最小可如粟米般,最大者可充滿整個發(fā)泡藥貼,泡體大小暫無明確的分類標準,需要進一步大樣本實驗進行重復驗證、歸類。故筆者暫擬以出現(xiàn)泡體即可作為發(fā)泡成功的標準。

2.1 不同斑蝥酊藥物濃度對發(fā)泡率以及泡體大小的影響

各組大鼠都有不同程度的發(fā)泡,低濃度組(5%斑蝥酊組和10%斑蝥酊組)發(fā)泡率整體高于高濃度組(20%斑蝥酊組和30%斑蝥酊組);低濃度組中5%斑蝥酊發(fā)泡率為87.5%,高于10%斑蝥酊組的75.0%;高濃度組中,20%斑蝥酊組發(fā)泡率和30%斑蝥酊組相同,均為62.5%。低濃度組發(fā)泡率高于高濃度組,尤其以5%斑蝥酊組成功發(fā)泡數(shù)最多,發(fā)泡率最高。提示斑蝥酊濃度因素對發(fā)泡有一定的影響,但不是決定性因素。實驗觀察到高濃度組極易出現(xiàn)燙傷樣疤痕,大鼠一般情況較差,低濃度組為更適合斑蝥酊天灸的濃度選擇。詳見表1。

表1 各組大鼠發(fā)泡率及泡體大小比較

2.2 藥物劑量對發(fā)泡的影響

本研究所選用的PU防水空白膏藥貼中心棉團的最大載藥量為200mL,若繼續(xù)加大給藥量,則發(fā)泡區(qū)域會全部被藥物浸濕,四周也會滲透蔓延,直接影響到發(fā)泡效果,對大鼠刺激性太強,故把200mL定義為最大斑蝥酊劑量。其次,設定梯度濃度,最小給藥劑量為 50mL,此時中心棉團只有小部分浸濕;中等給藥劑量為100mL,此時中心棉團大部分區(qū)域均浸濕,但并不充分。筆者發(fā)現(xiàn)不同斑蝥酊劑量對大鼠發(fā)泡有明顯影響,突出表現(xiàn)在各組給藥50mL時均不發(fā)泡;給藥100mL時,低濃度組(5%斑蝥酊組和10%斑蝥酊組)偶見少量發(fā)泡;給藥200mL時,低濃度組發(fā)泡普遍,均高于高濃度組。并且在低濃度組中,5%斑蝥酊組發(fā)泡效果始終高于10%斑蝥酊組,故筆者認為5% 200mL斑蝥酊是最適宜發(fā)泡的濃度和劑量,同時也觀察到結痂和劑量有直接關系,而與濃度關系不大,給藥200mL的各組均出現(xiàn)不同程度的結痂,但是給藥50mL和100mL各組均無結痂出現(xiàn)。詳見表2。

表2 各組同一部位不同斑蝥酊劑量發(fā)泡率比較 (只)

2.3 斑蝥酊貼藥時間對發(fā)泡的影響

在篩選出5% 200mL斑蝥酊后,筆者以此濃度和劑量觀察不同貼藥時間對發(fā)泡的影響,結果發(fā)現(xiàn)天灸1～2 h時,各組大鼠均無發(fā)泡。天灸3 h后,逐漸有少量大鼠天灸區(qū)域起泡。4 h是一個很重要的時間節(jié)點,天灸4 h前,大鼠只有少部分發(fā)泡或不發(fā)泡;天灸4 h后,大鼠普遍有發(fā)泡,且隨時間的增加,發(fā)泡泡體不會繼續(xù)增大。部分大鼠在原有泡體周圍,還有1～2處新增泡體出現(xiàn)。天灸24 h前后,泡液幾乎完全消失。故本研究以4 h作為統(tǒng)一收集泡液的時間點。詳見表3。

2.4 是否重復給藥對發(fā)泡的影響

對于重復加藥方法的確定,本研究發(fā)現(xiàn)單純1次給于200mL的5%斑蝥酊并不能發(fā)泡,這可能是由于斑蝥酊經(jīng)過皮膚滲透逐漸吸收之后,發(fā)泡藥貼中心棉團逐漸干燥,剩余斑蝥酊劑量不足,不能起到持續(xù)性的皮膚表面刺激。故本研究經(jīng)過進一步嘗試,在天灸2 h時加藥1次,保證了持續(xù)性的藥物刺激,最終獲得了穩(wěn)定的發(fā)泡。本研究還發(fā)現(xiàn),在首次貼藥刺激2 h后只用加斑蝥酊1次即可穩(wěn)定發(fā)泡,不需要加藥多次。多次加藥對大鼠皮膚有直接的損傷,會造成大鼠皮膚發(fā)紅、潰爛,同時大鼠會出現(xiàn)明顯的狂躁多動等不良情況。詳見表4。

表3 天灸不同時間大鼠發(fā)泡及泡體大小比較

表4 不同給藥次數(shù)大鼠發(fā)泡率比較 (只)

2.5 不同部位發(fā)泡的差異性

通過前期預實驗,筆者發(fā)現(xiàn)大鼠背部可以實現(xiàn)發(fā)泡,而腹部不發(fā)泡。本研究在前期預實驗的基礎上又發(fā)現(xiàn)大鼠背部尤其以項部兩耳后脊柱兩旁區(qū)域發(fā)泡多見(相當于大椎穴處附近),而背部其他區(qū)域很少發(fā)泡或不發(fā)泡。突出表現(xiàn)在大椎穴處發(fā)泡情況良好,發(fā)泡率≥80.0%;背部中線最高點發(fā)泡數(shù)量較少,發(fā)泡率為40.0%;背部中線最高點兩側0.5cm(相當于膀胱經(jīng)處)只有一處發(fā)泡,發(fā)泡率為20.0%。這考慮和大椎穴處附近區(qū)域皮膚薄嫩,表皮層疏松、局部皮膚不易被大鼠抓撓以及不易隨著大鼠的活動而受到壓迫和牽拉有關。故本研究認為大椎穴處附近為適合大鼠發(fā)泡的部位。這3處部位也模擬了臨床中大椎穴天灸、督灸以及膀胱經(jīng)穴位天灸,具有一定的臨床依據(jù)。詳見表5。

表5 不同部位、相同斑蝥酊劑量大鼠發(fā)泡率比較 (只)

2.6 不同室溫大鼠天灸發(fā)泡的差異性

表6 不同室溫大鼠發(fā)泡率比較 (只)

通過對3組不同溫度下天灸發(fā)泡情況的觀察統(tǒng)計,筆者發(fā)現(xiàn)溫度對發(fā)泡沒有直接的影響。較低溫度(16℃)的發(fā)泡率較其他兩組稍低,但各組比較差異無統(tǒng)計學意義(＞0.05)。詳見表6。

3 討論

目前,國內外天灸的動物實驗研究主要以研究天灸血清為主[6],但是并不發(fā)泡[7],這與動物和人類皮膚的差異性、發(fā)泡方法、發(fā)泡藥物和發(fā)泡材料的選擇等諸多因素有關,也在一定程度上限制了天灸的動物實驗研究。筆者發(fā)現(xiàn),天灸發(fā)泡的影響因素包括人為因素和非人為因素。其中,人為因素主要包括藥物濃度、發(fā)泡部位、溫度、貼藥時間以及是否多次加藥;非人為因素主要包括大鼠周齡、大鼠性別等。通過對以上因素進行對比研究,筆者認為人為因素在大鼠斑蝥酊天灸發(fā)泡中占主導,尤其以藥物濃度、劑量和重復加藥為主。5% 200mL的斑蝥酊貼敷于大鼠項部兩耳后脊柱兩旁區(qū)域,并在2 h后重復給藥200mL 1次,4 h后可以實現(xiàn)穩(wěn)定天灸發(fā)泡,這是關鍵環(huán)節(jié)。在此基礎上,筆者也對室溫、大鼠周齡和大鼠品系等因素進行了對比,發(fā)現(xiàn)均無明顯差異性,對大鼠天灸發(fā)泡也均無直接影響。另據(jù)文獻報道,性別差異可加速炎癥反應的消退[8],故本研究統(tǒng)一采用雄性SD大鼠發(fā)泡,這是為了防止雌激素對發(fā)泡的影響。

本實驗中涉及的人為因素相對較多,由于大鼠斑蝥酊天灸發(fā)泡不是單一因素所主導,而是由藥物濃度、劑量和重復加藥這3個關鍵因素共同作用的結果。只控制其中1個因素,均無法實現(xiàn)天灸發(fā)泡。故筆者在實驗方案的設計方面,以其中1個因素進行對比,其他因素保持同時存在并且條件相同。逐一對這3個因素進 行全面對比后,綜合得出了最終的關鍵因素。其他次要因素,包括發(fā)泡部位和室溫等,都是在這3個關鍵因素完全確立的基礎上進行的對比。

同時,筆者另一項實驗觀察了不同時間點發(fā)泡區(qū)域皮膚組織病理學和泡液改變,發(fā)現(xiàn)發(fā)泡伴隨著棘層的肥厚和松解,而且基底層細胞也有缺失,這與相關文獻報道相吻合[9-10]。故筆者認為天灸發(fā)泡可能通過影響局部皮膚樹突狀細胞來發(fā)揮作用。在天灸發(fā)泡液的研究方面,筆者結合相關文獻[11],認為泡液中樹突狀細胞同樣發(fā)揮著重要作用。樹突狀細胞在皮膚和泡液中都有分布,筆者認為它可能作為天灸后皮膚和泡液免疫炎癥反應研究新的結合點,有待于進一步試驗驗證。

此外,在斑蝥酊的有效藥理成分方面,筆者通過前期預實驗,用斑蝥素代替斑蝥酊,在大鼠皮膚卻沒有出現(xiàn)發(fā)泡的效果,這可能與人類和大鼠皮膚的差異性有關。故筆者認為很可能是以斑蝥素為主的成分刺激了皮膚而起到發(fā)泡的效果,但并不單純是斑蝥素這單一成分。斑蝥素確有肝腎毒性,經(jīng)查閱相關文獻可知,斑蝥酊天灸發(fā)泡是一種以斑蝥素為主要成分的發(fā)泡刺激,它可以對大鼠肝腎造成一定的損傷,可考慮是造模本身對動物的不良反應[12-15]。但對比上述文獻記載,筆者認為無論是參考小鼠或大鼠斑蝥的用量情況,本實驗中所選擇5%的斑蝥酊濃度是在安全劑量以內,且5%的斑蝥酊不會造成大鼠死亡,一般情況均良好。本實驗選擇斑蝥作為發(fā)泡刺激源,主要是結合了臨床上斑蝥的發(fā)泡是在皮膚上形成類似燙傷后透亮的水泡,而白芥子的發(fā)泡是貼敷部位皮膚出現(xiàn)紅腫,高出周圍皮膚,卻無類似燙傷后透亮的水泡。這種現(xiàn)象的產(chǎn)生可能與斑蝥素、白芥子甙生成的硫代異氰酸對羥芐酯對皮膚刺激作用的層次不同有關[16-18]。筆者相信,大鼠天灸后穩(wěn)定發(fā)泡的出現(xiàn),會對天灸泡液成分的研究及其與體液的相關性研究提供一定的基礎,也會在一定程度上推動天灸的動物實驗研究進程。

[1] 劉瓊,方劍喬.天灸療法的實驗研究進展[J].針灸臨床雜志,2006,22(1):51-54.

[2] 鐘珊,吳曦,梁繁榮.天灸的作用機理和展望[J].西部中醫(yī)藥,2012,25(3):93-96.

[3] 史曉萍,宗阿南,陶鈞,等.《關于善待實驗動物的指導性意見》的研究[J].中國醫(yī)科大學學報,2007,36(4): 493.

[4] 郭義.實驗針灸學[M].北京:中國中醫(yī)藥出版社,2008: 415.

[5] 李辭容,華興邦,周浩良,等.豚鼠針灸穴位圖譜的研制[J].上海針灸雜志,1992,11(2):28-30.

[6] 劉犇.天灸血清對糖尿病大鼠空腹血糖和CD4+、CD8+T細胞影響的研究[D].新疆醫(yī)科大學,2009:3-4.

[7] 孫德利,方劍喬,陳華德,等.天灸對環(huán)磷酰胺大鼠b-內啡肽含量的影響[J].中國中醫(yī)藥科技,2001,8(5): 279-280.

[8] Rathod KS, Kapil V, Velmurugan S,. Accelerated resolution of inflammation underlies sex differences in inflammatory responses in humans[J]., 2017, 127(1):169-182.

[9] 劉妞.天皰瘡的皮膚病理學[D].鄭州大學,2016:12- 13.

[10] Bertaux B, Prost C, Heslan M,. Cantharide acantholysis: endogenous protease activation leading to desmosomal plaque dissolution[J]., 1988, 118(2):157-165.

[11] 鄒曉軍,劉惠萍,程濤,等.流式細胞術檢測斑蝥酊劑發(fā)泡液中的成分研究[J].中藥材,2007,30(7):823-825.

[12] 鄒建軍,張勝強,馮瑞祥.斑蝥素毒性及其藥(毒)動力學研究[J].中國藥科大學學報,2002,33(5):393-396.

[13] 范瀟婷,于睿鵬,董瑞娟,等.斑蝥素及去甲斑蝥素對小鼠毒性靶器官的影響[J].中國實驗方劑學雜志,2017, 23(15):118-123.

[14] 楊辛欣,潘雪,李超英,等.降低中藥斑蝥刺激性的實驗研究[J].長春中醫(yī)藥大學學報,2015,31(4):688-690.

[15] 劉文吉.“天灸”對大鼠肝纖維化的防治效應研究[D].北京中醫(yī)藥大學,2015:33-34.

[16] 吳志強,張劍勇,陶加平,等.藥物加天灸發(fā)泡法治療類風濕性關節(jié)炎細胞因子影響的臨床研究[J].中醫(yī)學報, 2013,28(6):915-917.

[17] 張新怡,吳莉,劉智艷,等.天灸治療肺氣虛寒型變應性鼻炎臨床觀察[J].上海針灸雜志,2014,33(10):906- 909.

[18] 袁禮,鐘思雨,夏新華.斑蝥素的研究現(xiàn)狀[J].中醫(yī)藥導報,2017,23(3):79-82.

Study of the Influencing Factors in the Formation of Blisters in Cantharides Tincture Vesiculation Moxibustion in Rats

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,310053,

To study the influencing factors in the formation of blisters in cantharides tincture vesiculation moxibustion in rats.The skin of rats was stimulated by cantharides tincture. The differences in cantharides tincture concentrations, doses, treatment duration, with or without compression after the application, whether or not a repetitive application, blister area and room temperature were observed and counted.With application of 5% cantharides tincture 200mL to the Sprague-Dawley (SD) rats in the bilateral areas near by the spine and behind the ears, and a repeated application 2 h later at the same dose, stable formation of blisters could be achieved 4 h later.For vesculation moxibustion in rats, human factors are the main factors that influence the stable formation of blisters, including medicine concentrations, blister area, application duration of cantharides tincture, whether or not a repetitive application and room temperature. Good control of human factors can enhance the success rate and the stability of SD rat model of vesiculation moxibustion.

Blistering therapy; Moxibustion; Cantharides tincture; Rats

1005-0957(2018)11-1310-05

R2-03

A

10.13460/j.issn.1005-0957.2018.11.1310

2018-06-03

“十三五”浙江省中醫(yī)藥(中西醫(yī)結合)重點學科建設計劃(2017-XK-A18)

肖雙凱(1989—),男,2015級碩士生,Email:379691025@qq.com

林咸明(1966—),男,教授,Email:linxianming66@126.com