石秀蘭，陳 平 ，于得水，韓瑞宏，劉 萍

（1.仲愷農(nóng)業(yè)工程學院園藝園林學院，廣東 廣州 510225；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學草業(yè)學院，甘肅 蘭州 730070）

狼尾草屬（Pennisetum Rich.）牧草是我國南方地區(qū)主要種植的牧草資源，具有生長快速、生物量大、利用價值高及耐瘠、耐肥、適應性強等特點［1］，因此其應用范圍延伸到水土保持、環(huán)境綠化、觀賞和能源燃料、造紙等多個方面［2-4］。狼尾草屬育種受到國內(nèi)外學者的普遍重視，因此培育出不少新的狼尾草品種（系）。我國自1981年引進美洲狼尾草和象草雜交種取得巨大經(jīng)濟效益和生態(tài)效益后，也在狼尾草屬牧草引種馴化、雜交育種等方面取得了明顯進步。人工選擇以及環(huán)境等多因素的影響，使狼尾草屬牧草間易出現(xiàn)較大的遺傳分化［5］；植物遺傳距離和地理來源關系復雜化［6］，易導致育種工作者不能準確地鑒定種質(zhì)來源和父母本的歸屬。

近年來，利用RAPD和ISSR分子標記［7-11］對狼尾草屬牧草遺傳多樣性研究已有較多報道，為種質(zhì)資源的準確鑒定、親本的合理選配奠定了理論基礎。但由于穩(wěn)定性、操作難度和可重復性方面的局限影響了標記的準確性［12］。相關序列多態(tài)性擴增（sequence-related amplified polymorphism, SRAP）是以PCR為基礎的新型分子標記方法［13］。該標記方法因便捷、穩(wěn)定、高效等優(yōu)點被廣泛應用于指紋圖譜構建、遺傳多樣性分析、品種鑒定等方面［14-16］。姚法運等［17］利用SRAP技術分析了19份狼尾草資源間的遺傳關系，認為SRAP技術具有很好的應用價值。鑒于此，本研究以仲愷農(nóng)業(yè)工程學院選育的雜交狼尾草新品系1號、2號及生產(chǎn)中常用的狼尾草為研究對象，利用SRAP標記進行遺傳差異分析并構建指紋圖譜，以期為狼尾草新品種的鑒定提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試的狼尾草種質(zhì)材料共13份（表1）。選取長勢相近的植株，在相同葉位取樣，每株植株自下往上選取3片葉，同一植株不同莖均采取相同方法，目的是為了盡量選取相同植株上最嫩的葉片，以提高植物DNA活性，保持取樣方法一致。

1.2 基因組DNA提取

狼尾草基因組DNA提取參照于得水等［18］的方法，于0.8%瓊脂糖凝膠中進行電泳檢測。

1.3 SRAP-PCR擴增

參照文獻［19-21］的引物序列，選取正向引物6條、反向引物12條（表2），隨機組合成72對SRAP引物組合，對供試材料進行擴增。SRAP反應采用25 μL體系：10×buffer 2.5 μL、Mg2+1.75 mmol/L、dNTPs 0.26 mmol/L、引物0.15 μmol/L、Taq DNA聚合酶0.5 U、DNA 50 ng；PCR擴增程序：94℃預變性5 min；94℃變性1 min、35℃退火1 min、72℃延伸2 min，5個循環(huán)；94℃變性1 min、50℃退火1 min、72℃延伸2 min，35個循環(huán)；最后72℃延伸5 min，4℃保存［20-22］。擴增產(chǎn)物采用10%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳進行分離；參照Zhang等［23］的方法快速銀染檢測，在Vilber Lourmat CN1500凝膠成像系統(tǒng)中觀察拍照。

表1 供試狼尾草材料及產(chǎn)地

表2 SRAP-PCR引物序列

1.4 數(shù)據(jù)分析

根據(jù)電泳結果分析擴增條帶，參照文獻［20-21］方法，利用Quantity One軟件，以每個擴增片段出現(xiàn)或缺失計為“1”或“0”，計算引物多態(tài)性條帶百分率（多態(tài)性帶數(shù)/總帶數(shù)×100%）；利用NTSYS－pc2.10軟件進行Shonnon信息指數(shù)（I）、Nei's基因多樣性指數(shù)（H）、遺傳距離（GD）、相似系數(shù)（GSC）等參數(shù)的分析，采用UPGMA進行聚類分析，繪制聚類圖；構建13份狼尾草種質(zhì)材料的DNA指紋圖譜。

2 結果與分析

2.1 狼尾草SRAP標記的多態(tài)性

用72對SRAP引物對供試13份狼尾草材料進行PCR擴增，最終篩選出條帶清晰、多態(tài)性高的16對引物（表3）。從表3可以看出，16對引物擴增出278條清晰條帶，平均每對引物擴增17.37條清晰條帶，其中有218條具有多態(tài)性，多態(tài)性比率平均為78.42%，分布范圍為68.18%～88.89%，其中最高引物組合為F1R5（88.89%），最低引物組合為F5R10（68.18%）；不同引物組合條帶擴增數(shù)量有一定差異，其中引物組合為F3R5、F5R10條帶擴增數(shù)量最多（22條），最少的條帶擴增引物組合F1R1、F4R3（11條）；16對引物的擴增產(chǎn)物介于50～500 bp之間。引物組合F6R7擴增結果見圖1。

圖1 引物組合F6R7對狼尾草的擴增結果

表3 16對引物擴增條帶的多態(tài)性

2.2 13份狼尾草種質(zhì)遺傳多樣性

13 份狼尾草的遺傳相似度（GSC）為0.3776～0.9796，遺傳距離（GD）為0.0206～0.9740，說明各品種（系）間存在較大的遺傳差異。由表4可知，13份狼尾草材料中以皇竹草和矮生皇竹草的遺傳距離最近、為0.0206，遺傳相似度最高、為0.9796；以桂牧1號和多穗狼尾草的遺傳距離最遠、為0.974，遺傳相似度最小、為0.3776。

Nei's 基因多樣性指數(shù)（H）和Shonnon信息指數(shù)（I）是衡量遺傳變異最常用的兩個指標，13份狼尾草的平均H值為0.3306±0.1308，平均I值為0.5017±0.1587。不同品種狼尾草各基因位點遺傳多樣性程度存在較大差別，I最大值為0.6902，最小值為0；H最大值為0.4970，最小值為0。經(jīng)分析表明，狼尾草不同品種的遺傳多樣性較豐富，遺傳變異較大，說明SRAP標記能夠很好地揭示狼尾草種質(zhì)資源間的遺傳差異。

2.3 13份狼尾草屬植物的DNA指紋圖譜

在16對擴增帶型清晰、重演性好、多態(tài)性高的引物組合中，利用其中1對引物組合F6R7構建了13份狼尾草屬植物的DNA指紋圖譜（圖2）。由圖2可知，圖譜含有DNA多態(tài)性條帶109條，多態(tài)性位點17個，帶型間有明顯差異，可有效區(qū)分13份狼尾草材料并加以準確鑒定。

圖 2 13個狼尾草屬植物的DNA指紋圖譜

表4 狼尾草屬植物的的遺傳距離及遺傳相似度

2.4 13份狼尾草屬植物的聚類分析

根據(jù)相似系數(shù)矩陣按UPGMA法將13份狼尾草品種聚類，形成了13份種源的親緣關系聚類圖（圖3）。在遺傳相似度0.634處，將參試材料分為2大類：Ⅰ類包括雜交狼尾草、2份雜交狼尾草芽變系（雜交狼尾草1號、雜交狼尾草2號）及多穗狼尾草形成單獨分支；在相似度為0.884處，可分為2分支，雜交狼尾草及其2份芽變系聚為一類，多穗狼尾草單獨一類，其中雜交狼尾草2號芽變系的遺傳距離和雜交狼尾草原種更近些。Ⅱ類包括象草原品種、摩特矮象草及象草新品系、皇竹草及其矮生系、桂牧1號及3個地方品種單獨聚為一大類；在相似度為0.86處，可將Ⅱ類分為3個分支，皇竹草和其矮生系單獨聚為一類；桂牧1號、象草、江西象草湖光巖象草聚為一類，其中江西象草與桂牧1號的遺傳距離較近；摩特矮象草和象草新品系、華南象草聚為一類，其中摩特矮象草和象草新品系的遺傳距離相近聚為一類。

圖 3 13份狼尾草屬植物的UPGMA聚類結果

3 討論

3.1 13份狼尾草種質(zhì)聚類分析與品種實際來源的一致性

雜交狼尾草與其兩個芽變系（雜交狼尾草1號和2號）的遺傳距離分別為0.1423和0.0524。從分子水平上證明了仲愷農(nóng)業(yè)工程學院選育的雜交狼尾草1號和2號來源的準確性，與陳平等［7］RAPD標記的結果正好相符。由華南農(nóng)業(yè)大學選育的象草新品系及其源種摩特矮象草的遺傳距離為0.0852，也印證了解新明等［8］RAPD標記的相關結論。皇竹草及其矮生系的遺傳距離最近為0.0206，相似度為98%，說明皇竹草矮生系的變異程度未達到以新品種的形式推廣種植，或許是由于其種植條件不同而造成皇竹草植株的矮化，推廣的地理位置不同而形成的植物適應性表現(xiàn)。桂牧1號和地方品種江西象草的遺傳距離為0.0311，可由此推斷江西象草有可能是廣西的桂牧1號引種至江西后形成的一個適應當?shù)貧夂驐l件的地方品種，或者是由于天然雜交而導致的樣品不純。湖光巖雜交象草與桂牧1號、江西象草的遺傳距離相似，也可能是引種至當?shù)睾笮纬傻牡胤叫缕贩N。桂牧1號是由美洲狼尾草和象草雜交后代F1回交所得。象草在整個遺傳育種過程中出現(xiàn)過2次，其遺傳基因也占據(jù)較大比例，象草與桂牧1號聚為一類，地方品種江西象草和湖光巖象草與源種象草聚為一類。華南象草于1960年從印尼引進，在華南各地大量繁殖，進而成為野外散生的地方品種，是我國最早引進的牧草種質(zhì)，其后代不斷與其他狼尾草屬植物雜交導致基因序列改變，造成植物形態(tài)和生長習性與其源種差異顯著，它與摩特矮象草的遺傳距離較近（GD=0.1782），說明本地散生的華南象草與摩特矮象草有著某種遺傳關系。

3.2 SRAP標記對狼尾草新品種鑒定的可行性

Budak等［24］以野牛草為材料，運用不同標記方法研究，產(chǎn)生的多態(tài)性SRAP為95%、ISSR為81%、RAPD為79%和SSR為87%，認為SRAP標記好于其他幾種標記。Ferrio等［25］認為SRAP標記重復性好于RAPD，相比AFLP操作更簡單，更貼近植物種源進化史和形態(tài)變異，所用引物沒有物種特異性，尤其在研究背景缺乏的條件下優(yōu)勢明顯。對于自然變異后代來說，由于與其親本基因和形態(tài)的相似性，運用常規(guī)方法難以區(qū)分它們，甚至一些分子手段也不能將其完全區(qū)分［26］。狼尾草受環(huán)境條件影響易發(fā)生變異，本研究中，雜交狼尾草及其芽變系（雜交狼尾草1號和雜交狼尾草2號），摩特矮象草及其變異系（象草新品系），它們之間遺傳距離特別近，但是運用SRAP方法依然能夠清晰地鑒別出它們之間的差異。本研究也表明，利用SRAP引物建立的13份狼尾草屬品種的指紋圖譜，可以用于鑒定紛繁復雜的狼尾草屬不同變異系的品種（系）。姚運法等［17］的研究也證明了SRAP在狼尾草屬牧草品種間鑒定及分析遺傳關系方面具有很好的應用價值。可見，SRAP標記對狼尾草屬不同品種鑒定是可行的。