魯海燕，張喜平

(內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院普外科，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010050)

隨著人口老齡化、飲食結(jié)構(gòu)、生活環(huán)境的變化以及其他因素的影響，乳腺癌近年來發(fā)病率呈明顯上升趨勢(shì)，已儼然成為女性患者尤其是老年女性群體最為常見的惡性腫瘤，且有發(fā)病年齡年輕化的趨勢(shì)[1-2]。腫瘤微環(huán)境是指包含內(nèi)皮細(xì)胞、免疫細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞和細(xì)胞間基質(zhì)等在內(nèi)的相互協(xié)同作用，從而利于腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移的特殊環(huán)境。研究證實(shí)，腫瘤微環(huán)境在腫瘤的病理生理過程中發(fā)揮著決定性的作用[3-5]。腫瘤微環(huán)境中的淋巴細(xì)胞反映出患者的免疫功能狀態(tài)以及對(duì)抗腫瘤的能力，研究證實(shí)Foxp3+Tregs是乳腺癌患者中無病生存時(shí)間和總生存率的獨(dú)立預(yù)測(cè)指標(biāo)，且與腫瘤分型有關(guān)，并能在腫瘤組織內(nèi)差異性分布，證實(shí)腫瘤微環(huán)境中免疫細(xì)胞與患者預(yù)后息息相關(guān)，因此可以作為腫瘤治療的重要手段[6-8]。香菇多糖具有免疫調(diào)節(jié)作用，對(duì)固有免疫和獲得性免疫均有調(diào)節(jié)作用，可以提高機(jī)體免疫力[9]。但目前其免疫調(diào)節(jié)機(jī)制尚不明確，在乳腺癌患者中研究也較少，因此本研究通過前瞻性納入接受新輔助化療的乳腺癌患者，探討香菇多糖對(duì)此類患者免疫功能以及腫瘤微環(huán)境中浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞的影響，以求為臨床提供相應(yīng)的理論支持。

1 資料與方法

1.1一般資料前瞻性納入自2015年1月至2016年10月內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院收治的乳腺癌患者。入組標(biāo)準(zhǔn)：①明確診斷為乳腺癌；②入組前4周未接受化療或放療；③年齡范圍為18～70歲；④預(yù)期壽命≥3月，ECOG評(píng)分≤2分；⑤知情并同意此研究。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他惡性腫瘤；②合并嚴(yán)重的心、肺、腎、肝臟功能障礙；③合并自身免疫性疾病或長(zhǎng)期應(yīng)用激素；④使用其它免疫調(diào)節(jié)劑；⑤研究期間放棄治療、失訪、轉(zhuǎn)院等。根據(jù)以上標(biāo)準(zhǔn)，研究期間共入組乳腺癌患者88例，采用隨機(jī)、對(duì)照、單盲的方法將患者分為觀察組和治療組，每組各44例患者。觀察組年齡(57.53±8.57)歲，年齡范圍為40～68歲；病理分型其中浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌30例，乳頭狀癌6例，單純癌5例，髓樣癌3例；雌激素受體陽性29例，孕激素受體陽性25例，人表皮生長(zhǎng)因子-2受體陽性20例；組織分化程度其中高分化的8例，中分化的20例，低分化的11例，不能判別分化程度5例。對(duì)照組年齡(58.69±9.35)歲，年齡范圍為43～70歲；病理分型其中浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌28例，乳頭狀癌8例，單純癌6例，髓樣癌2例；雌激素受體陽性27例，孕激素受體陽性23例，人表皮生長(zhǎng)因子-2受體陽性21例；組織分化程度其中高分化的7例，中分化的19例，低分化的14例，不能判別分化程度4例。兩組患者治療前一般臨床資料比較均差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)，見表1。本研究通過內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者或其家屬均知情同意并簽署知情同意書。

1.2治療方法所有患者入院均常規(guī)完善乳腺、淋巴結(jié)超聲，胸腹部CT等檢查，必要時(shí)行核磁共振，骨組織核素掃描等檢查。兩組患者均給予相同新輔助化療方案，每次化療前均常規(guī)檢查血常規(guī)、肝腎功能、心電圖等檢查以排除化療禁忌。新輔助化療方案為CAF方案化療：療程第1天和第8天靜脈注射環(huán)磷酰胺500 mg·m-2， 5-氟尿嘧啶500 mg·m-2，多柔比星50 mg·m-2為療程第1天使用。每21 d為1療程，術(shù)前共給予3～4個(gè)療程，每2～3療程結(jié)束時(shí)行影像學(xué)檢查評(píng)估療效。新輔助化療結(jié)束后行改良根治術(shù)，圍手術(shù)期給予營(yíng)養(yǎng)、血糖、血壓、內(nèi)環(huán)境、心肺功能支持等對(duì)癥治療。觀察組在此基礎(chǔ)上給予香菇多糖(天地欣，南京綠葉制藥有限公司，生產(chǎn)批號(hào)Z20080579)治療。用法用量：香菇多糖1 mg+5%葡萄糖注射液250 mL靜脈滴注，1周2次，患者非住院期間在社區(qū)衛(wèi)生院輸注。所有患者外周血免疫細(xì)胞檢測(cè)期間均未行分子靶向治療。

1.3觀察指標(biāo)及檢測(cè)方法一般臨床資料包括年齡、性別、病理分型、組織分化程度等。腫瘤組織切片后常規(guī)HE染色和免疫組化(IHC)染色，雌激素或孕激素≥1%定義為激素受體陽性；人表皮生長(zhǎng)因子-2受體檢測(cè)首先采用IHC初篩，IHC 0/1+診斷受體陰性，IHC3+診斷為受體陽性；IHC2+患者進(jìn)一步行熒光原位雜交法(FISH)檢測(cè)明確受體基因擴(kuò)增狀態(tài)以明確診斷。主要觀察指標(biāo)包括：腫瘤組織中淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)程度如CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、CD4+/CD8+T細(xì)胞比例等；外周血中CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞水平；血清白細(xì)胞介素-6(IL-6)、白細(xì)胞介素-10(IL-10)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(TGF-β1)濃度。腫瘤組織淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)情況：手術(shù)中留取腫瘤組織標(biāo)本，洗凈、剪碎、PBS制成細(xì)胞懸液，去碎片和細(xì)胞團(tuán)后取得細(xì)胞沉淀，分離淋巴細(xì)胞后加入單克隆抗體反應(yīng)30 min，使用Epics XL型流式細(xì)胞儀(Beckman，美國(guó))檢測(cè)CD4+和CD8+T細(xì)胞。外周血CD4+和CD8+T細(xì)胞：治療前及手術(shù)前留取外周血標(biāo)本，使用Epics XL型流式細(xì)胞儀(Beckman，美國(guó))檢測(cè)患者外周血中CD4+和CD8+T細(xì)胞。血清白細(xì)胞介素-2(IL-2)、IL-6、IL-10、TGF-β1濃度：治療前及手術(shù)前留取外周血標(biāo)本，離心后將血清凍存于-80 ℃冰箱，后集中采用Elisa法(云克隆，武漢)檢測(cè)。

表1 兩組一般資料比較

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件完成分析，兩組患者計(jì)量資料采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，組間計(jì)量資料采用配對(duì)樣本t檢驗(yàn)。分類資料采用χ2檢驗(yàn)。P<0.05被認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1兩組腫瘤組織淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)水平比較觀察組腫瘤組織微環(huán)境CD4+T細(xì)胞(21.56%±5.08% 比 23.95%±5.17%,t=2.187,P=0.031 )低于對(duì)照組；CD8+T細(xì)胞(29.52%±3.51% 比 27.47%±3.68%,t=2.673,P=0.009)高于對(duì)照組；CD4+/CD8+T細(xì)胞比例(0.72±0.12比 0.86±0.14,t=5.036,P=0.000)亦低于對(duì)照組，均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖1。

圖1 兩組患者腫瘤組織淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)水平比較

2.2兩組外周血淋巴細(xì)胞水平比較相比于對(duì)照組，觀察組治療后外周血CD4+T細(xì)胞水平明顯增加；CD4+/CD8+T細(xì)胞比例明顯增加。治療后觀察組和對(duì)照組外周血CD4+T細(xì)胞水平均明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

2.3兩組血清IL-6、IL-10、TGF-β1濃度比較治療前兩組血清IL-6、IL-10、TCG-β1濃度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。相比于對(duì)照組，觀察組治療后血清IL-6濃度明顯增高(P=0.002)；IL-10濃度明顯降低(P=0.004)；TGF-β1濃度明顯降低(P=0.024)。治療后觀察組和對(duì)照組外周血IL-6濃度均顯著降低，IL-10和TGF-β1濃度均明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

3 討論

近年來越來越多的研究證實(shí)，免疫在腫瘤患者的病理生理過程中起到了極為重要的作用，活化腫瘤患者機(jī)體免疫功能有可能成為抗腫瘤的有效治療手段[7,10-11]?，F(xiàn)有研究結(jié)果已經(jīng)證實(shí)，乳腺癌患者機(jī)體存在一定的免疫抑制，且研究表明其抑制程度越嚴(yán)重，整體臨床預(yù)后越差[12]。乳腺癌腫瘤細(xì)胞免疫耐受與腫瘤快速生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移息息相關(guān)，也是患者臨床預(yù)后惡化的重要因素[13]。細(xì)胞免疫在抗腫瘤作用中是最主要的執(zhí)行者，T淋巴細(xì)胞，自然殺傷細(xì)胞和巨噬細(xì)胞在腫瘤微環(huán)境中發(fā)揮著主要的抗腫瘤免疫應(yīng)答功能，而體液免疫通常起到協(xié)助作用[14]。在抗腫瘤細(xì)胞免疫中，活化的細(xì)胞毒性T細(xì)胞被認(rèn)為是最重要的效應(yīng)細(xì)胞，可通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡發(fā)揮作用，因此也被認(rèn)為是人體對(duì)抗腫瘤的防御最前線。細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞主要包括CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞，CD8+T細(xì)胞為主要效應(yīng)執(zhí)行細(xì)胞但其激活又依賴于CD4+T細(xì)胞所分泌的Th細(xì)胞因子[15]。白海亞和馬秀芬[16]研究發(fā)現(xiàn)CAF新輔助化療方案可以有效提高外周血CD3+、CD4+T細(xì)胞以及自然殺傷細(xì)胞數(shù)量，降低CD8+T細(xì)胞數(shù)量，增加CD4+/CD8+比例，與本研究結(jié)果基本一致，提示有效的新輔助化療方案在抑制腫瘤增殖同時(shí)可以改善患者免疫功能。

表2 兩組患者外周血淋巴細(xì)胞水平比較

注:與治療前對(duì)比，aP<0.05

表3 兩組患者外周血IL-6、IL-10、TGF-β1水平比較

注:與治療前對(duì)比，aP<0.05

此外，生物調(diào)節(jié)劑也是活化機(jī)體免疫功能從而發(fā)揮抗腫瘤作用的重要治療手段之一。香菇多糖是指從優(yōu)質(zhì)香菇子實(shí)體中提取出來的一種多聚葡糖，具有很強(qiáng)免疫調(diào)節(jié)能力和抗腫瘤活性，還具有抗氧化、降血脂、抗病毒等多種藥理功能，近年來在臨床中得到廣泛應(yīng)用[17]。向冬晴和洛若愚發(fā)現(xiàn)香菇多糖可以有效改善Ⅳ期宮頸癌化療患者T淋巴細(xì)胞免疫功能，提高化療效果并減輕化療不良反應(yīng)[18]。龍愛娥[19]也發(fā)現(xiàn)，香菇多糖可以增強(qiáng)老年卵巢癌患者中化療效果，并可以抑制實(shí)體瘤的生長(zhǎng)和有助于控制惡性腹水。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)香菇多糖可以有效降低腫瘤組織微環(huán)境中CD4+T細(xì)胞，同時(shí)上調(diào)CD8+T細(xì)胞比例，CD4+T細(xì)胞在腫瘤微環(huán)境中主要分化為調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，而抑制免疫系統(tǒng)對(duì)機(jī)體的殺傷作用，CD8+T細(xì)胞主要分化為細(xì)胞毒性T細(xì)胞，而殺傷腫瘤細(xì)胞，香菇多糖通過降低CD4+T細(xì)胞、提高CD+T細(xì)胞，進(jìn)而增強(qiáng)對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。

外周血中CD4+T細(xì)胞可根據(jù)其分泌細(xì)胞因子的不同分為Th1和Th2細(xì)胞，研究證實(shí)IL-6因子可刺激其向Th1細(xì)胞方向分化，而IL-10因子則刺激其向Th2方向分化[20-23]。當(dāng)Th1細(xì)胞下調(diào)而Th2上調(diào)，即所謂的Th1/Th2漂移往往會(huì)導(dǎo)致機(jī)體整體免疫功能下降，而Th1細(xì)胞具有抗腫瘤作用，因此也會(huì)降低機(jī)體抗腫瘤作用[24]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)香菇多糖可以有效降低血清IL-10和TGF-β1濃度，提高IL-6濃度，同時(shí)可以提高外周血CD4+T細(xì)胞水平和CD4+/CD8+細(xì)胞比例。TGF-β1可以調(diào)節(jié)細(xì)胞表型，抑制免疫細(xì)胞增殖、淋巴細(xì)胞分化和細(xì)胞因子差生，在細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化和免疫功能中具有重要的調(diào)節(jié)作用[25]，表明香菇多糖可以有效促進(jìn)乳腺癌患者細(xì)胞免疫向Th1漂移，增強(qiáng)機(jī)體對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。

綜上所述，香菇多糖可以有效改善乳腺癌患者機(jī)體免疫功能，調(diào)節(jié)腫瘤組織中浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞免疫狀態(tài)，但目前關(guān)于香菇多糖的抗腫瘤機(jī)制尚不明確，且目前研究多為單中心，小樣本觀察性研究，其在腫瘤中所發(fā)揮的確切作用仍需進(jìn)一步深入研究。