高飛，李秋菲，佘凡

(1.榆林市藥品檢驗所，陜西 榆林 719000；2.陜西省食品藥品檢驗所，陜西 西安 710061；3.楊凌示范區(qū)藥品檢驗監(jiān)測評價中心,陜西 楊凌 712100)

四季抗病毒合劑是由魚腥草、桔梗、苦杏仁、菊花等11味中藥組成,清熱解毒、消炎退熱。主要用于上呼吸道感染、病毒性感冒、流感等病毒性感染疾患。四季抗病毒合劑為多劑量口服制劑，由于其在使用過程中存在多次打開包裝而被污染的風(fēng)險，需要添加一定量的抑菌劑保證產(chǎn)品的正常儲存和使用，避免微生物生長與繁殖[1-3]。如果藥物本身不具有充分的抗菌效力，那么應(yīng)根據(jù)制劑特性(如水溶液制劑)添加適宜的抑菌劑，以防止制劑在正常貯藏或使用過程中可能發(fā)生的微生物污染和繁殖使藥物變質(zhì)而對使用者造成危害，尤其是多劑量包裝的制劑。

抑菌劑(也稱防腐劑) 是一類防止或限制微生物生長與繁殖的化學(xué)藥品,其主要作用是保證藥品品質(zhì),防止藥劑被微生物污染。所有的抑菌劑都有一定的毒性，制劑中抑菌劑的量應(yīng)為最低有效量。本試驗自2016年6月至2017年1月采用適宜的方法對該產(chǎn)品進行了3種配比濃度的抑菌劑效力進行測試，篩選處方中所添加的抑菌劑是否安全有效。測試方法為《中國藥典》[4]2015版1121 抑菌效力檢查法，接種5種代表微生物，分別在d14、d28測試微生物存活情況，綜合評判所添加抑菌劑的抑菌效力。

1 儀器與試藥

1.1儀器MJ-系列真菌培養(yǎng)箱培養(yǎng)箱(上海一恒科技有限公司)；SPX-250生化培養(yǎng)箱(上海佳勝實驗設(shè)備有限公司)； 超凈臺(上海錦屏儀器儀表有限公司)。

1.2培養(yǎng)基胰酪胨大豆瓊脂培養(yǎng)基(TSA) (生產(chǎn)批號140505)、胰酪胨大豆肉湯培養(yǎng)基(TSB) (生產(chǎn)批號130222)、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(SDA) (生產(chǎn)批號140312)、pH7.0 氯化鈉-蛋白胨緩沖液(生產(chǎn)批號140424) 均購于北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司。培養(yǎng)基適用性檢查實驗結(jié)果均符合中國藥典2015 年版要求。

1.3菌種金黃色葡萄球菌[CMCC(B)26003]、大腸埃希菌[CMCC(B)44102]、銅綠假單胞菌[CMCC(B)10104]、白色念珠菌[CMCC(F)98001]、黑曲霉[CMCC(F)98003]均源自中國醫(yī)學(xué)細菌保藏中心，驗證試驗所用的菌株均為第3代。

1.4供試品四季抗病毒合劑，陜西海天制藥，生產(chǎn)批號20150925。

2 方法與結(jié)果

2.1菌種制備接種金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌的新鮮培養(yǎng)物至胰酪胨大豆瓊脂斜面上，30～35 ℃培養(yǎng)18～24 h； 接種白色念珠菌至沙氏葡萄糖瓊脂斜面，20～25 ℃培養(yǎng)24～48 h；接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至沙氏葡萄糖瓊脂斜面，23～28 ℃培養(yǎng)5～7 d加入含0.05%聚山梨酯80 的0.9%無菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫后制成每1 mL含孢子數(shù)107～108cfu 的菌懸液。

2.2抑菌劑濃度篩選該中藥產(chǎn)品成分主要為魚腥草、桔梗、苦杏仁、菊花、桑葉、荊芥、薄荷、蘆根、甘草、連翹、紫蘇葉。根據(jù)《藥用輔料手冊》收載[5]本品成分及包裝與所選抑菌劑無配伍禁忌。設(shè)定此口服液的防腐劑使用濃度分別為1#(苯甲酸鈉0.3%)； 2#(苯甲酸鈉0.3%+尼泊金乙酯0.04%)；3#(苯甲酸鈉0.3%+尼泊金乙酯0.05%)。產(chǎn)品組分及防腐劑添加情況見表1。

表1 產(chǎn)品組分及防腐劑添加情況

2.3方法適用性試驗及結(jié)果判斷進行抑菌效力檢查前，需對供試品的計數(shù)方法進行驗證，以確定該方法在防腐劑效力檢查時是否能有效檢測出供試品中所有試驗菌 。選取抑菌濃度最高3#進行方法適用性試驗。

2.3.1供試液制備 取3#供試品10 mL，加 TSB至100 mL，制備成1∶10供試液。

2.3.2平皿計數(shù)方法 試驗組 ：吸取1∶10供試液9.9 mL共5份，每份加入0.1 mL的試驗菌懸液搖勻后，使加入后每1 mL供試液含菌量不大于100 cfu，分別從所有試驗菌管中吸取1 mL注入直徑為90 mm的平皿中，細菌平皿中加入TSA，真菌平皿中加入SDA。供試品對照組 ：吸取4份1∶10供試液1 mL注入直徑為90 mm的平皿中，平行，其中兩個平板中注入TSA培養(yǎng)基中，另兩個注入SDA培養(yǎng)基，搖勻，測定供試品的本底菌數(shù)。菌液組：分別吸取5份9.9 mL pH7.0 氯化鈉-蛋白胨緩沖液，每份中加入與試驗組相同的菌懸液后搖勻。從各菌液試管中吸取1 mL注入直徑為90 mm的平皿中測定。陰性對照組：以稀釋液替代供試品，同供試品對照組進行試驗。TSA平皿放入30～35 ℃培養(yǎng)3 d，SDA平皿放入20～25 ℃培養(yǎng)3～5 d。方法適用性結(jié)果見表2。

表2 3#樣品方法適用性回收率

結(jié)果表明,3#樣試驗組金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、白色念珠菌、黑曲霉回收率均高于70%，滿足2015版藥典要求。最終建立的方法為平皿法取1∶10的供試液，每皿1 mL進行計數(shù)，細菌計數(shù)采用TSA培養(yǎng)基，真菌計數(shù)采用SDA培養(yǎng)基。

2.4未添加抑菌劑樣品抑菌效力測試考察在未添加抑菌劑的情況下四季抗病毒合劑本身對微生物抑制或殺滅能力，根據(jù)結(jié)果，評估本品中加入抑菌劑的必要性[5]。

2.4.1方法 取未添加抑菌劑的樣品5瓶，分別接種金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、白色念珠菌、黑曲霉，使接種后供試液染菌量未105～106cfu·mL-1，充分混勻，模擬正常的使用條件20～25 ℃避光培養(yǎng)箱培養(yǎng)過程中，分別在d14、d28對供試品中存活的微生物進行計數(shù)，同時取與樣品量相同的0.9%無菌氯化鈉溶液5瓶，加入與上述樣品組相同的試驗菌液，通過梯度稀釋，用平皿計數(shù)法進行計數(shù)，細菌于30～35 ℃培養(yǎng)3～5 d，真菌于20～25 ℃培養(yǎng)5～7 d后計算樣品中所加試驗菌菌數(shù)即初始(0時)菌液濃度。并換算成Log值見表3。

為準(zhǔn)確計數(shù)d14、d28樣品所含微生物，應(yīng)按方法適用性試驗進行測試，3#方法適用性也適合未添加抑菌劑的本品，最低稀釋級為1∶10的供試液進一步稀釋成1∶102、1∶103、1∶104等稀釋級，測試結(jié)果見表3。

2.4.2結(jié)果分析 金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌d14與初始值即0時比較下降的log值均<3.0；白色念珠菌、黑曲霉14 d與初始值比較下降的log值均<1.0。細菌和真菌不符合中國藥典2015版抑菌劑效力檢查的要求。四季抗病毒合劑本身并不具備充分的抗菌活性，為保證用藥按全，應(yīng)添加適宜抑菌劑。

2.5抑菌效力測定

2.5.1樣品組 無菌條件下吸取的供試品20 mL至原包裝瓶中，按照目標(biāo)菌的個數(shù)平行制備5份，將菌懸液各吸取0.1 mL加入其中，使其最終濃度細菌為106cfu·mL-1,真菌和酵母菌為105cfu·mL-1于旋渦振蕩儀上振蕩均勻。加菌量不得超過容器中樣品量的1%。將制備好的樣品置于20～25 ℃的培養(yǎng)箱中儲存，分別在d14和d28對供試品中存活的微生物進行計數(shù)。

2.5.2菌液組 無菌條件吸取20 mL 0.9%氯化鈉溶液加入無菌玻璃瓶中，平行制備5份，將與樣品組相同量的目標(biāo)菌懸液加入其中，通過梯度稀釋，用平皿計數(shù)法進行計數(shù)，細菌于30～35 ℃培養(yǎng)3～5 d，真菌于20～25℃培養(yǎng)5～7 d后，計算樣品中所加試驗菌菌數(shù)即初始菌液濃度。并換算成log值見表4。

2.5.3存活菌數(shù)測定 分別在d14、d28將樣品于旋渦振蕩儀上振蕩均勻，無菌量取樣品1 mL用TSB通過梯度稀釋稀釋成1∶10的供試液，進一步稀釋成1∶102、1∶103、1∶104等稀釋級進行測定，置規(guī)定溫度規(guī)定時間培養(yǎng)，逐日觀察結(jié)果。根據(jù)菌落測定結(jié)果，計算1 mL樣品組各間隔時間的菌數(shù)，并換算成log值見表4。

分別計算1#、2#、3#樣品d14、d28與初始值比較減少log值及判斷標(biāo)準(zhǔn),結(jié)果見表5。

表3 四季抗病毒合劑本身抑菌效力檢查結(jié)果

表4 1#、2#、3#抑菌效力測試結(jié)果

表5 1#樣、2#樣、3#樣品d14、d28與初始值比較減少Log值及判斷標(biāo)準(zhǔn)

注：NI為未增加，是指對前一個測定時間，試驗菌增加的數(shù)量不超過0.5log

2.5.4結(jié)果分析 1#樣、2#樣、3#樣d14存活的金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌菌數(shù)與接種的細菌菌數(shù)初始值的log值相比下降均>3.0；d14存活的白色念珠菌、黑曲真菌數(shù)與接種真菌菌數(shù)初始值的log值比較下降均>1.0；d28金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌細菌菌數(shù)log值與d14細菌菌數(shù)log值比較未增加，d28白色念珠菌、黑曲真菌數(shù)的log值與d14真菌菌數(shù)log值比較未增加。由此可以看出3個樣品的抑菌劑效力檢查符合中國藥典2015版的要求。

3 討論

抑菌劑效力測試至關(guān)重要，抑菌劑的量添加過少，會使微生物繁殖而引起污染，抑菌劑(尼泊金乙酯)[6]的量過大，會引起許多不適或過敏等變態(tài)反應(yīng)，因此，適量的添加抑菌劑顯得尤為重要，按照《中國藥典》2015年版四部1121(抑菌劑效力檢查法)口服制劑抑菌劑效力判斷標(biāo)準(zhǔn)，三個樣品均能滿足抑菌劑效能試驗要求，但根據(jù)最小有效量添加的原則[7]，最終選擇 1#樣品，抑菌劑苯甲酸鈉濃度0.3%，為合理添加量。

四季抗病毒合劑根據(jù)需要加入適宜的防腐劑，不得影響成品的穩(wěn)定性，并避免對檢驗產(chǎn)生干擾。苯甲酸屬于低級脂肪酸，在水溶液中很少電離，大部分保持分子態(tài)，對微生物的抑制主要是分子態(tài)，此種防腐劑在酸性條件下為佳。四季抗病毒合劑PH值4～6，屬于偏酸環(huán)境，添加苯甲酸能更好發(fā)揮抑菌效力。