高飛，李秋菲，佘凡

(1.榆林市藥品檢驗(yàn)所，陜西 榆林 719000；2.陜西省食品藥品檢驗(yàn)所，陜西 西安 710061；3.楊凌示范區(qū)藥品檢驗(yàn)監(jiān)測(cè)評(píng)價(jià)中心,陜西 楊凌 712100)

四季抗病毒合劑是由魚腥草、桔梗、苦杏仁、菊花等11味中藥組成,清熱解毒、消炎退熱。主要用于上呼吸道感染、病毒性感冒、流感等病毒性感染疾患。四季抗病毒合劑為多劑量口服制劑，由于其在使用過(guò)程中存在多次打開包裝而被污染的風(fēng)險(xiǎn)，需要添加一定量的抑菌劑保證產(chǎn)品的正常儲(chǔ)存和使用，避免微生物生長(zhǎng)與繁殖[1-3]。如果藥物本身不具有充分的抗菌效力，那么應(yīng)根據(jù)制劑特性(如水溶液制劑)添加適宜的抑菌劑，以防止制劑在正常貯藏或使用過(guò)程中可能發(fā)生的微生物污染和繁殖使藥物變質(zhì)而對(duì)使用者造成危害，尤其是多劑量包裝的制劑。

抑菌劑(也稱防腐劑) 是一類防止或限制微生物生長(zhǎng)與繁殖的化學(xué)藥品,其主要作用是保證藥品品質(zhì),防止藥劑被微生物污染。所有的抑菌劑都有一定的毒性，制劑中抑菌劑的量應(yīng)為最低有效量。本試驗(yàn)自2016年6月至2017年1月采用適宜的方法對(duì)該產(chǎn)品進(jìn)行了3種配比濃度的抑菌劑效力進(jìn)行測(cè)試，篩選處方中所添加的抑菌劑是否安全有效。測(cè)試方法為《中國(guó)藥典》[4]2015版1121 抑菌效力檢查法，接種5種代表微生物，分別在d14、d28測(cè)試微生物存活情況，綜合評(píng)判所添加抑菌劑的抑菌效力。

1 儀器與試藥

1.1儀器MJ-系列真菌培養(yǎng)箱培養(yǎng)箱(上海一恒科技有限公司)；SPX-250生化培養(yǎng)箱(上海佳勝實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)； 超凈臺(tái)(上海錦屏儀器儀表有限公司)。

1.2培養(yǎng)基胰酪胨大豆瓊脂培養(yǎng)基(TSA) (生產(chǎn)批號(hào)140505)、胰酪胨大豆肉湯培養(yǎng)基(TSB) (生產(chǎn)批號(hào)130222)、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(SDA) (生產(chǎn)批號(hào)140312)、pH7.0 氯化鈉-蛋白胨緩沖液(生產(chǎn)批號(hào)140424) 均購(gòu)于北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司。培養(yǎng)基適用性檢查實(shí)驗(yàn)結(jié)果均符合中國(guó)藥典2015 年版要求。

1.3菌種金黃色葡萄球菌[CMCC(B)26003]、大腸埃希菌[CMCC(B)44102]、銅綠假單胞菌[CMCC(B)10104]、白色念珠菌[CMCC(F)98001]、黑曲霉[CMCC(F)98003]均源自中國(guó)醫(yī)學(xué)細(xì)菌保藏中心，驗(yàn)證試驗(yàn)所用的菌株均為第3代。

1.4供試品四季抗病毒合劑，陜西海天制藥，生產(chǎn)批號(hào)20150925。

2 方法與結(jié)果

2.1菌種制備接種金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌的新鮮培養(yǎng)物至胰酪胨大豆瓊脂斜面上，30～35 ℃培養(yǎng)18～24 h； 接種白色念珠菌至沙氏葡萄糖瓊脂斜面，20～25 ℃培養(yǎng)24～48 h；接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至沙氏葡萄糖瓊脂斜面，23～28 ℃培養(yǎng)5～7 d加入含0.05%聚山梨酯80 的0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫后制成每1 mL含孢子數(shù)107～108cfu 的菌懸液。

2.2抑菌劑濃度篩選該中藥產(chǎn)品成分主要為魚腥草、桔梗、苦杏仁、菊花、桑葉、荊芥、薄荷、蘆根、甘草、連翹、紫蘇葉。根據(jù)《藥用輔料手冊(cè)》收載[5]本品成分及包裝與所選抑菌劑無(wú)配伍禁忌。設(shè)定此口服液的防腐劑使用濃度分別為1#(苯甲酸鈉0.3%)； 2#(苯甲酸鈉0.3%+尼泊金乙酯0.04%)；3#(苯甲酸鈉0.3%+尼泊金乙酯0.05%)。產(chǎn)品組分及防腐劑添加情況見表1。

表1 產(chǎn)品組分及防腐劑添加情況

2.3方法適用性試驗(yàn)及結(jié)果判斷進(jìn)行抑菌效力檢查前，需對(duì)供試品的計(jì)數(shù)方法進(jìn)行驗(yàn)證，以確定該方法在防腐劑效力檢查時(shí)是否能有效檢測(cè)出供試品中所有試驗(yàn)菌 。選取抑菌濃度最高3#進(jìn)行方法適用性試驗(yàn)。

2.3.1供試液制備 取3#供試品10 mL，加 TSB至100 mL，制備成1∶10供試液。

2.3.2平皿計(jì)數(shù)方法 試驗(yàn)組 ：吸取1∶10供試液9.9 mL共5份，每份加入0.1 mL的試驗(yàn)菌懸液搖勻后，使加入后每1 mL供試液含菌量不大于100 cfu，分別從所有試驗(yàn)菌管中吸取1 mL注入直徑為90 mm的平皿中，細(xì)菌平皿中加入TSA，真菌平皿中加入SDA。供試品對(duì)照組 ：吸取4份1∶10供試液1 mL注入直徑為90 mm的平皿中，平行，其中兩個(gè)平板中注入TSA培養(yǎng)基中，另兩個(gè)注入SDA培養(yǎng)基，搖勻，測(cè)定供試品的本底菌數(shù)。菌液組：分別吸取5份9.9 mL pH7.0 氯化鈉-蛋白胨緩沖液，每份中加入與試驗(yàn)組相同的菌懸液后搖勻。從各菌液試管中吸取1 mL注入直徑為90 mm的平皿中測(cè)定。陰性對(duì)照組：以稀釋液替代供試品，同供試品對(duì)照組進(jìn)行試驗(yàn)。TSA平皿放入30～35 ℃培養(yǎng)3 d，SDA平皿放入20～25 ℃培養(yǎng)3～5 d。方法適用性結(jié)果見表2。

表2 3#樣品方法適用性回收率

結(jié)果表明,3#樣試驗(yàn)組金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、白色念珠菌、黑曲霉回收率均高于70%，滿足2015版藥典要求。最終建立的方法為平皿法取1∶10的供試液，每皿1 mL進(jìn)行計(jì)數(shù)，細(xì)菌計(jì)數(shù)采用TSA培養(yǎng)基，真菌計(jì)數(shù)采用SDA培養(yǎng)基。

2.4未添加抑菌劑樣品抑菌效力測(cè)試考察在未添加抑菌劑的情況下四季抗病毒合劑本身對(duì)微生物抑制或殺滅能力，根據(jù)結(jié)果，評(píng)估本品中加入抑菌劑的必要性[5]。

2.4.1方法 取未添加抑菌劑的樣品5瓶，分別接種金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、白色念珠菌、黑曲霉，使接種后供試液染菌量未105～106cfu·mL-1，充分混勻，模擬正常的使用條件20～25 ℃避光培養(yǎng)箱培養(yǎng)過(guò)程中，分別在d14、d28對(duì)供試品中存活的微生物進(jìn)行計(jì)數(shù)，同時(shí)取與樣品量相同的0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液5瓶，加入與上述樣品組相同的試驗(yàn)菌液，通過(guò)梯度稀釋，用平皿計(jì)數(shù)法進(jìn)行計(jì)數(shù)，細(xì)菌于30～35 ℃培養(yǎng)3～5 d，真菌于20～25 ℃培養(yǎng)5～7 d后計(jì)算樣品中所加試驗(yàn)菌菌數(shù)即初始(0時(shí))菌液濃度。并換算成Log值見表3。

為準(zhǔn)確計(jì)數(shù)d14、d28樣品所含微生物，應(yīng)按方法適用性試驗(yàn)進(jìn)行測(cè)試，3#方法適用性也適合未添加抑菌劑的本品，最低稀釋級(jí)為1∶10的供試液進(jìn)一步稀釋成1∶102、1∶103、1∶104等稀釋級(jí)，測(cè)試結(jié)果見表3。

2.4.2結(jié)果分析 金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌d14與初始值即0時(shí)比較下降的log值均<3.0；白色念珠菌、黑曲霉14 d與初始值比較下降的log值均<1.0。細(xì)菌和真菌不符合中國(guó)藥典2015版抑菌劑效力檢查的要求。四季抗病毒合劑本身并不具備充分的抗菌活性，為保證用藥按全，應(yīng)添加適宜抑菌劑。

2.5抑菌效力測(cè)定

2.5.1樣品組 無(wú)菌條件下吸取的供試品20 mL至原包裝瓶中，按照目標(biāo)菌的個(gè)數(shù)平行制備5份，將菌懸液各吸取0.1 mL加入其中，使其最終濃度細(xì)菌為106cfu·mL-1,真菌和酵母菌為105cfu·mL-1于旋渦振蕩儀上振蕩均勻。加菌量不得超過(guò)容器中樣品量的1%。將制備好的樣品置于20～25 ℃的培養(yǎng)箱中儲(chǔ)存，分別在d14和d28對(duì)供試品中存活的微生物進(jìn)行計(jì)數(shù)。

2.5.2菌液組 無(wú)菌條件吸取20 mL 0.9%氯化鈉溶液加入無(wú)菌玻璃瓶中，平行制備5份，將與樣品組相同量的目標(biāo)菌懸液加入其中，通過(guò)梯度稀釋，用平皿計(jì)數(shù)法進(jìn)行計(jì)數(shù)，細(xì)菌于30～35 ℃培養(yǎng)3～5 d，真菌于20～25℃培養(yǎng)5～7 d后，計(jì)算樣品中所加試驗(yàn)菌菌數(shù)即初始菌液濃度。并換算成log值見表4。

2.5.3存活菌數(shù)測(cè)定 分別在d14、d28將樣品于旋渦振蕩儀上振蕩均勻，無(wú)菌量取樣品1 mL用TSB通過(guò)梯度稀釋稀釋成1∶10的供試液，進(jìn)一步稀釋成1∶102、1∶103、1∶104等稀釋級(jí)進(jìn)行測(cè)定，置規(guī)定溫度規(guī)定時(shí)間培養(yǎng)，逐日觀察結(jié)果。根據(jù)菌落測(cè)定結(jié)果，計(jì)算1 mL樣品組各間隔時(shí)間的菌數(shù)，并換算成log值見表4。

分別計(jì)算1#、2#、3#樣品d14、d28與初始值比較減少log值及判斷標(biāo)準(zhǔn),結(jié)果見表5。

表3 四季抗病毒合劑本身抑菌效力檢查結(jié)果

表4 1#、2#、3#抑菌效力測(cè)試結(jié)果

表5 1#樣、2#樣、3#樣品d14、d28與初始值比較減少Log值及判斷標(biāo)準(zhǔn)

注：NI為未增加，是指對(duì)前一個(gè)測(cè)定時(shí)間，試驗(yàn)菌增加的數(shù)量不超過(guò)0.5log

2.5.4結(jié)果分析 1#樣、2#樣、3#樣d14存活的金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌菌數(shù)與接種的細(xì)菌菌數(shù)初始值的log值相比下降均>3.0；d14存活的白色念珠菌、黑曲真菌數(shù)與接種真菌菌數(shù)初始值的log值比較下降均>1.0；d28金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌細(xì)菌菌數(shù)log值與d14細(xì)菌菌數(shù)log值比較未增加，d28白色念珠菌、黑曲真菌數(shù)的log值與d14真菌菌數(shù)log值比較未增加。由此可以看出3個(gè)樣品的抑菌劑效力檢查符合中國(guó)藥典2015版的要求。

3 討論

抑菌劑效力測(cè)試至關(guān)重要，抑菌劑的量添加過(guò)少，會(huì)使微生物繁殖而引起污染，抑菌劑(尼泊金乙酯)[6]的量過(guò)大，會(huì)引起許多不適或過(guò)敏等變態(tài)反應(yīng)，因此，適量的添加抑菌劑顯得尤為重要，按照《中國(guó)藥典》2015年版四部1121(抑菌劑效力檢查法)口服制劑抑菌劑效力判斷標(biāo)準(zhǔn)，三個(gè)樣品均能滿足抑菌劑效能試驗(yàn)要求，但根據(jù)最小有效量添加的原則[7]，最終選擇 1#樣品，抑菌劑苯甲酸鈉濃度0.3%，為合理添加量。

四季抗病毒合劑根據(jù)需要加入適宜的防腐劑，不得影響成品的穩(wěn)定性，并避免對(duì)檢驗(yàn)產(chǎn)生干擾。苯甲酸屬于低級(jí)脂肪酸，在水溶液中很少電離，大部分保持分子態(tài)，對(duì)微生物的抑制主要是分子態(tài)，此種防腐劑在酸性條件下為佳。四季抗病毒合劑PH值4～6，屬于偏酸環(huán)境，添加苯甲酸能更好發(fā)揮抑菌效力。