王露露，吳萌萌，董靜，徐家根

(南京市口腔醫(yī)院、南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬口腔醫(yī)院藥學(xué)部，江蘇 南京 210008)

口腔鱗狀細(xì)胞癌(OSCC)是口腔癌最常見的病理類型，預(yù)后較差。盡管治療進(jìn)展，OSCC患者的五年生存率在過去10年只有約50%[1]。 OSCC的主要治療方法是手術(shù)切除、放療和化療，作為手術(shù)前后的輔助治療，可以抑制OSCC的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)[2]。平陽霉素(PYM)，從我國平陽縣土壤中的微生物鏈真菌產(chǎn)生的博來霉素的單一A5組分，臨床上已用于治療各種類型的癌癥，如頭頸部鱗狀細(xì)胞癌，皮膚癌和肺癌[3]。PYM的主要細(xì)胞毒作用為結(jié)合鐵和直接損傷DNA的能力[4]。然而，PYM的化學(xué)耐藥性已經(jīng)成為其治療OSCC的主要障礙。因此，迫切需要為OSCC治療找到新的更有效的用藥方案。穿心蓮內(nèi)酯(ANDRO)是從草本穿心蓮屬分離得到的雙環(huán)二萜內(nèi)酯。最近的研究報道稱ANDRO在多種人類癌細(xì)胞中發(fā)揮抗腫瘤作用[5-9]，并可增強(qiáng)常規(guī)化療藥的抗腫瘤作用。然而，ANDRO和PYM組合用于治療OSCC尚未有報道。本研究旨在評估ANDRO聯(lián)合PYM在體外對人類OSCC細(xì)胞凋亡的影響，并探討相關(guān)的分子機(jī)制。

1 材料和方法

1.1試劑和抗體ANDRO購自Sigma-Aldrich公司；PYM購自哈爾濱博萊通制藥有限公司； 天冬氨酸半胱氨酸蛋白酶-3(caspase-3)、caspase-8及caspase-9一抗購自武漢Proteintech公司；Bcl-2，Bax 購自Cell Signaling公司；山羊抗兔和兔抗小鼠IgG辣根過氧化物酶(HRP)二抗，GADPH一抗購自Santa Cruz 公司。MTT試劑盒購自碧云天生物技術(shù)有限公司。本研究起止時間為2015年1月至2017年4月。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)SCC-9人口腔鱗癌細(xì)胞株從美國菌種保藏中心(ATCC)獲得，常規(guī)培養(yǎng)于含有10%胎牛血清(浙江四季青)的DMEM / F-12(Invitrogen公司)中，放置在保持37 ℃的含5%二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱中。

1.3細(xì)胞活力測定通過MTT法測定細(xì)胞活力。將細(xì)胞以每孔104個細(xì)胞的密度接種到96孔板中。細(xì)胞貼壁后，用含有0.5 g·L-1MTT的200 mL新鮮DMEM / F-12培養(yǎng)基替換常規(guī)培養(yǎng)基，并在37 ℃環(huán)境下孵育4 h。棄去培養(yǎng)基后，將紫色甲臢結(jié)晶在37 ℃下溶于200 mL二甲亞礬(DMSO)中10 min。在酶標(biāo)儀上用490 nm波長測量吸光度。

1.4劃痕試驗細(xì)胞以5×105個細(xì)胞/孔的密度接種于6孔板中。使用200 μL移液管做劃痕，PBS沖洗3次去除刮除細(xì)胞。處理及培養(yǎng)24 h后在LEICA顯微鏡中對細(xì)胞進(jìn)行拍照，用LEICA LASV4.2軟件處理細(xì)胞圖像。

1.5流式細(xì)胞術(shù)分析將SCC-9細(xì)胞接種在6孔板中，貼壁生長后藥物處理24 h。收集懸浮細(xì)胞和貼壁細(xì)胞。將細(xì)胞重懸于500 μL緩沖液中。隨后加入5 μL Annexin V和5 μL PI，室溫下黑暗處孵育15 min。最后，在1 h內(nèi)通過流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞凋亡。

1.6蛋白質(zhì)免疫印跡(Westernblot)分析細(xì)胞用PBS沖洗2次，然后用含有PMSF的RIPA裂解物裂解30 min。將細(xì)胞裂解物在4 ℃下以12 000g離心10 min，收集上清液并儲存在-80 ℃冰箱里直至使用。在SDS-PAGE膠上加等量的蛋白質(zhì)(50 μg)，蛋白分離后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。在室溫下用含5%脫脂奶粉的TBST溶液將膜封閉2 h，4 ℃下與一抗孵育過夜。隨后將膜與HRP綴合的抗兔或抗小鼠IgG抗體室溫孵育2 h。ECL發(fā)光液顯示條帶，并由Kodak Molecular Imaging 軟件對條帶定量分析。

2 結(jié)果

2.1ANDRO增強(qiáng)PYM對人OSCC細(xì)胞的抗增殖作用近年的研究已經(jīng)證實ANDRO和PYM單獨應(yīng)用都表現(xiàn)出了一定的抗腫瘤活性。本次實驗中，我們用MTT法檢測了不同濃度的ANDRO和5 μmol·L-1的 PYM在不同時間點單獨或聯(lián)合應(yīng)用對SCC-9細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果顯示在不同濃度的ANDRO和5 μmol·L-1PYM 作用下SCC-9細(xì)胞的生長受到了顯著的抑制，并呈現(xiàn)出時間和劑量依賴性。此外，用不同劑量的ANDRO和PYM組合對人OSCC細(xì)胞的增殖的影響顯著高于ANDRO或PYM單獨應(yīng)用。所有濃度組的ANDRO與PYM聯(lián)合對SCC-9細(xì)胞均具有顯著的協(xié)同抗增殖作用 (圖1)，特別是50 μmol·L-1ANDRO和5 μmol·L-1PYM的劑量組合，細(xì)胞增殖的抑制率為29.00%±4.32%，而相同劑量的PYM和ANDRO單獨顯示抑制率分別為14.66%±2.05%和18.33%±3.68%(圖2)。由于ANDRO(50 μmol·L-1)和PYM(5 μmol·L-1)的組合具有最佳的抑制細(xì)胞增殖協(xié)同能力，隨后所有的實驗將選擇這一劑量組合。

圖1 穿心蓮內(nèi)脂聯(lián)合平陽霉素對SCC-9細(xì)胞的抗增殖作用

圖2 穿心蓮內(nèi)脂聯(lián)合平陽霉素對SCC-9細(xì)胞的生長抑制作用

劃痕試驗結(jié)果顯示在ANDRO、PYM或兩者聯(lián)合作用24 h后，SCC-9細(xì)胞的遷徙能力同樣受到了顯著抑制(表1)。這些與MTT結(jié)果一致的數(shù)據(jù)表明，ANDRO對PYM的抗SCC-9細(xì)胞增殖、遷徙作用具有協(xié)同效應(yīng)。

表1 各組細(xì)胞凋亡率及遷徙能力的測定結(jié)果

注：與對照組相比，aP<0.01;與PYM或ANDRO組相比，bP<0.01

2.2ANDRO增強(qiáng)PYM誘導(dǎo)的SCC-9細(xì)胞凋亡

為了確定ANDRO對SCC-9細(xì)胞凋亡的敏感性，并檢測ANDRO是否可以增加PYM誘導(dǎo)的SCC-9細(xì)胞凋亡，我們通過AnnexinV-FITC和PI雙染色的流式細(xì)胞術(shù)來定量凋亡細(xì)胞。結(jié)果表明用PYM或ANDRO處理24 h后，細(xì)胞凋亡率分別為14.72%±0.85%，18.57%±0.86%，PYM和ANDRO均可誘導(dǎo)SCC-9細(xì)胞產(chǎn)生一定的凋亡，而PYM和ANDRO聯(lián)合誘導(dǎo)的凋亡細(xì)胞率顯著高于二者單獨應(yīng)用(31.32%±0.62%)，見表1。

2.3ANDRO/PYM聯(lián)合改變了BAX、Bcl-2蛋白的表達(dá)Western blot用于檢測凋亡相關(guān)蛋白BAX、Bcl-2的表達(dá)。結(jié)果表明在PYM、ANDRO或兩者聯(lián)合處理24 h后，Bcl-2蛋白的表達(dá)均呈現(xiàn)了不同程度的降低，而Bax的表達(dá)則有不同程度的升高。與單一應(yīng)用ANDRO或PYM相比，二者聯(lián)合應(yīng)用后細(xì)胞中Bcl-2蛋白表達(dá)顯著降低，而Bax表達(dá)顯著升高(圖3，表2)。

圖3 各組細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)

2.4ANDRO/PYM聯(lián)合激活了caspase凋亡途徑中相關(guān)蛋白的活性為了進(jìn)一步確定誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的相關(guān)分子機(jī)制，我們檢測了caspase相關(guān)蛋白的表達(dá)。如圖3所示，與對照組相比， ANDRO/ PYM聯(lián)合處理24 h后，SCC-9細(xì)胞中caspase-9、caspase-3被激活。與單一應(yīng)用ANDRO或PYM相比， caspase-9、caspase-3的活性顯著增強(qiáng)。然而，caspase-8的表達(dá)在四組中幾乎沒有變化(表2)。以上結(jié)果表明，caspase-9依賴的內(nèi)源性線粒體途徑參與了ANDRO / PYM誘導(dǎo)的SCC-9細(xì)胞凋亡。

表2 各組細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的測定結(jié)果

注：與對照組相比，aP<0.05，bP<0.01；與PYM或ANDRO組相比，cP<0.05，dP<0.01

3 討論

與單藥治療癌癥相比，聯(lián)合用藥具有延緩物耐藥性、降低毒副作用、提高治療效果的優(yōu)點。最近研究表明，ANDRO，一種二萜類內(nèi)酯，具有抗炎、免疫調(diào)節(jié)和抗菌等多種生物活性[10]，已被用于治療炎癥、流感、腹瀉等感染[11]。同時，ANDRO對多種人類癌細(xì)胞有顯著的抑制增殖作用，ANDRO聯(lián)合常規(guī)化療藥物在人結(jié)腸癌細(xì)胞、卵巢癌[12]、HeLa和HepG2細(xì)胞[13]中具有協(xié)同抗腫瘤作用。然而，關(guān)于ANDRO對PYM在人類OSCC細(xì)胞中的療效的影響了解甚少。在本研究中，我們證實了ANDRO與PYM聯(lián)合激活了caspase-9及下游的caspase-3活性，表明兩者聯(lián)合可以通過caspase-9依賴的內(nèi)源性線粒體途徑顯著抑制人類OSCC細(xì)胞SCC-9的增殖，促進(jìn)了細(xì)胞凋亡。我們的研究結(jié)果表明：(1)ANDRO抑制SCC-9的生長，并增強(qiáng)了PYM對SCC-9細(xì)胞的毒性作用;(2)ANDRO / PYM聯(lián)合對誘導(dǎo)SCC-9細(xì)胞的凋亡具有協(xié)同效應(yīng);(3)ANDRO/PYM可通過caspase-9依賴的線粒體途徑誘導(dǎo)SCC-9細(xì)胞的凋亡。

迄今為止，已知存在兩種主要的凋亡途徑：一種是caspase-8激活的外源性途徑，另一種是caspase-9激活的內(nèi)在途徑。內(nèi)在的線粒體途徑包括通過激活不同底物誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[14]。外源信號通路涉及死亡受體介導(dǎo)的相互作用，銜接蛋白FADD的募集及與caspase-8相關(guān)聯(lián)以形成死亡誘導(dǎo)信號傳導(dǎo)復(fù)合物(DISC)?；罨腸aspase-8直接激活caspase-3，隨后激活PARP蛋白。內(nèi)在的線粒體途徑通常涉及線粒體跨膜電位的喪失和細(xì)胞色素C從膜間隙釋放到胞質(zhì)溶膠中。細(xì)胞色素C進(jìn)而激活A(yù)paf-1以及caspase-9，形成凋亡抑制因子，導(dǎo)致caspase-9的活化，從而激活caspase-3[15]。在我們的研究中，我們用MTT、劃痕試驗證實了ANDRO可增強(qiáng)PYM抑制SCC-9細(xì)胞增殖的能力。此外，我們的研究結(jié)果表明，ANDRO與PYM的聯(lián)合以協(xié)同方式誘導(dǎo)SCC-9細(xì)胞凋亡，與Bax的上調(diào)，Bcl-2的下調(diào)及caspase 9，caspase 3和PARP的活化相關(guān)。然而，四組中caspase-8的表達(dá)沒有顯著差異。

總之，我們的研究數(shù)據(jù)表明，ANDRO可通過caspase-9介導(dǎo)的內(nèi)源性線粒體凋亡途徑，增強(qiáng)PYM在體外抑制OSCC細(xì)胞的增殖，促進(jìn)OSCC細(xì)胞的凋亡。因此，ANDRO和PYM的聯(lián)合治療可能成為OSCC治療的新方法。下一步需進(jìn)行動物實驗來驗證體外實驗的結(jié)果。