舒必超，楊勇,，劉雪勇，蔣元利，向佐湘，胡龍興*

(1.湖南涉外經(jīng)濟(jì)學(xué)院高爾夫?qū)W院，湖南 長(zhǎng)沙410205；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院草業(yè)科學(xué)系，湖南 長(zhǎng)沙410128；3.湖南生物機(jī)電職業(yè)技術(shù)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙410127)

低溫是影響植物生長(zhǎng)發(fā)育主要的非生物因素之一。低溫脅迫常引起植物體內(nèi)O2·-和H2O2等活性氧急劇增加而導(dǎo)致膜系統(tǒng)遭到破壞，表現(xiàn)出受害癥狀，同時(shí)在一定逆境脅迫范圍內(nèi)，植物體存在清除活性氧(ROS)的酶保護(hù)系統(tǒng)(如SOD、POD、CAT 等) ，可通過其含量或活性的增加來保護(hù)細(xì)胞膜免于ROS的傷害，使植物在一定程度上忍耐、減緩或抵御逆境傷害[1]。光合作用是植物生長(zhǎng)發(fā)育的基礎(chǔ)，植物體內(nèi)的有機(jī)物質(zhì)和能量來源都是通過光合作用獲得。光合作用易受低溫脅迫影響，使光合性能變?nèi)酰参锷L(zhǎng)遲緩。低溫冷害來臨時(shí)常會(huì)引起部分氣孔關(guān)閉，使CO2流動(dòng)受阻，造成CO2供應(yīng)不足，進(jìn)而導(dǎo)致光合速率降低。因此，光合作用可以反映植物的生長(zhǎng)情況和抗逆境能力強(qiáng)弱[2]。

低溫常誘導(dǎo)一系列耐寒相關(guān)基因的表達(dá)，從而提高植物的耐低溫能力。植物抗寒能力的獲得，在分子水平上是植物對(duì)逆境產(chǎn)生迅速應(yīng)答、逆境信號(hào)在體內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)，由此調(diào)控應(yīng)答和抵御基因表達(dá)綜合作用的結(jié)果[3]。在植物體內(nèi)的低溫逆境信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中，CBF類轉(zhuǎn)錄因子在增強(qiáng)植物適應(yīng)和抵御低溫的能力中具有重要作用。CBF通過感受上游傳遞的低溫信號(hào)，并將信號(hào)向下游COR基因傳遞，而COR基因編碼的蛋白可直接或間接的激活下游多種編碼低滲物質(zhì)的基因表達(dá)，進(jìn)而增加可溶性糖，如蔗糖、果糖、葡萄糖、棉籽糖等的含量，增強(qiáng)植株的抗凍性[4]。另外，COR15a調(diào)控了編碼親水的LEA蛋白的表達(dá)，從而增強(qiáng)了植株忍耐脫水的能力，并且COR15a編碼蛋白是一種親水多肽，具有α-螺旋親水區(qū)，定位于葉綠體中，可直接作為抗凍多肽保持葉綠體被膜的結(jié)構(gòu)，防止冰凍低溫下葉綠體結(jié)構(gòu)的傷害[5]。

狗牙根(Cynodondactylon)是暖季型草坪草中使用最廣泛的草種之一，由于其具有植株低矮、草坪質(zhì)量?jī)?yōu)異、抗旱、耐踐踏等優(yōu)良特性而廣泛應(yīng)用于熱帶、亞熱帶及溫帶地區(qū)的公共綠地、運(yùn)動(dòng)場(chǎng)草坪、高爾夫球場(chǎng)、護(hù)坡草坪的建植[6]。溫度是影響狗牙根分布和生長(zhǎng)發(fā)育的重要環(huán)境因子，其最適生長(zhǎng)溫度為25～35 ℃，當(dāng)日均溫度≤12 ℃時(shí)生長(zhǎng)減緩，7～10 ℃時(shí)枯黃，隨后進(jìn)入休眠期[7]。由于狗牙根對(duì)低溫抵抗能力差，我國(guó)目前推廣應(yīng)用的狗牙根品種通常表現(xiàn)為在南方地區(qū)綠色期較短，在過渡帶地區(qū)易受到低溫傷害而出現(xiàn)死亡，在北方地區(qū)則不能安全越冬等問題，極大地降低了狗牙根的坪用價(jià)值和限制了狗牙根的推廣應(yīng)用[6-9]。因此，進(jìn)行抗寒機(jī)理的探索已成為狗牙根研究的重要內(nèi)容。此外，選育抗寒性強(qiáng)的狗牙根品種也成為新品種選育的最重要育種目標(biāo)之一。以往國(guó)內(nèi)外圍繞狗牙根抗寒性鑒定、自然低溫或?qū)嶒?yàn)室低溫處理對(duì)狗牙根草坪質(zhì)量、根形態(tài)特征、膜結(jié)構(gòu)、酶活性、蛋白合成、光合和呼吸、內(nèi)源激素和碳水化合物等生理生化過程的影響開展了較多的研究[6-12]，而對(duì)不同抗寒性狗牙根品種在不同低溫脅迫下抗氧化酶基因以及與抗寒性密切相關(guān)基因的表達(dá)差異缺乏探討。本研究以3個(gè)不同耐寒性的狗牙根品種為試驗(yàn)材料，探討梯度降溫處理下低溫脅迫對(duì)不同耐寒性狗牙根品種的生長(zhǎng)、光合作用、抗氧化酶活性及其基因表達(dá)、抗寒相關(guān)基因的表達(dá)差異變化及其與狗牙根抗寒性的關(guān)系，為不同抗寒性狗牙根品種的選擇、狗牙根在寒冷地區(qū)的栽培應(yīng)用及其抗寒育種提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

本研究依據(jù)前期研究結(jié)果[13]，選擇采用了3個(gè)耐寒性不同的狗牙根品種，分別為運(yùn)動(dòng)百慕大(C.dactylon×C.trasvalensiscv. Tifsport)(耐寒性較強(qiáng))、天堂419(C.dactylon×C.trasvalensiscv. Tifway)(耐寒性較弱)和保定狗牙根(C.dactyloncv. Baoding)(耐寒性弱)。其中，保定狗牙根引自河北農(nóng)業(yè)大學(xué)，其他2個(gè)狗牙根品種引自湖南天泉生態(tài)草業(yè)工程有限公司。

1.2 田間試驗(yàn)與盆栽溫度處理方法

各狗牙根品種分別于2015年6月用草莖種植于湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)校內(nèi)教學(xué)實(shí)習(xí)基地。2015年9月，挖取成坪后的狗牙根草皮塊洗凈其根部泥土，種植于上口徑25 cm、下口徑15 cm、高20 cm的塑料盆中，栽培基質(zhì)為市售花土和河沙，按重量比1∶1混合均勻，每盆用土1.4 kg。每個(gè)品種種植4盆，共計(jì)20盆，放置于溫室大棚內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。

培養(yǎng)約45 d待根系和冠層基本建成后，將各盆栽材料轉(zhuǎn)入人工氣候箱中分別進(jìn)行梯度降溫處理：1)適溫處理。初始溫度30 ℃/25 ℃(晝/夜)處理7 d；2)亞適溫處理。經(jīng)初始處理后的材料再將氣候箱溫度降為18 ℃/12 ℃(晝/夜)處理7 d；3)冷害處理。初始和亞適溫處理后的材料再經(jīng)8 ℃/4 ℃(晝/夜)處理7 d；4)凍害處理。經(jīng)初始、亞適溫和冷害處理后的材料再轉(zhuǎn)入溫度為4 ℃/-4 ℃的生長(zhǎng)箱中處理48 h。人工氣候箱相對(duì)濕度設(shè)為65%～75%，12 h光照時(shí)間和12000 lx的光強(qiáng)。各處理設(shè)4次重復(fù)(4 盆)，在各梯度降溫處理結(jié)束時(shí)進(jìn)行冠層高度、葉綠素?zé)晒?Fv/Fm)和光合作用的測(cè)定，同時(shí)每盆取成熟狗牙根植株功能葉片混勻后，液氮速凍，保存于-80 ℃冰箱，用于各生理指標(biāo)和基因表達(dá)的測(cè)定分析。

1.3 測(cè)定項(xiàng)目與方法

1)生長(zhǎng)速率：降溫處理前將冠層修剪整齊并測(cè)定高度，然后在各梯度溫度處理結(jié)束時(shí)用直尺測(cè)定冠層高度，兩者之差再除以處理天數(shù)為生長(zhǎng)速率，單位為cm·d-1。

2)O2·-產(chǎn)生速率和H2O2含量測(cè)定：O2·-產(chǎn)生速率和H2O2含量參照Hu等[14]的方法測(cè)定。

3)抗氧化酶活性測(cè)定：采用pH 值7.8的磷酸緩沖液(PBS)提取酶液。根據(jù)Hu 等[14]的方法，用硫酸鈦法測(cè)定H2O2含量，羥胺氧化反應(yīng)法測(cè)定O2·-產(chǎn)生速率，氮藍(lán)四唑(NBT)光化還原法測(cè)定超氧化物歧化酶(SOD)活性，愈創(chuàng)木酚法測(cè)定過氧化物酶(POD)活性，過氧化氫還原法測(cè)定過氧化氫酶(CAT)活性，紫外吸收法測(cè)定抗壞血酸過氧化物酶(APX)活性。

4)葉綠素?zé)晒猓翰捎妹绹?guó)OPTI-sciences OS-5p 便攜式脈沖調(diào)制葉綠素?zé)晒鈨x測(cè)定葉片暗適應(yīng)30 min后的Fv/Fm值。

5)光合作用測(cè)定：在10:00-14:00，用Licor-6400光合儀測(cè)定狗牙根倒數(shù)第3片葉的凈光合速率，蒸騰速率和氣孔導(dǎo)度，測(cè)定條件設(shè)定為380 μmol·mol-1CO2，400 μmol·m-2·s-1的光照強(qiáng)度。

6)基因表達(dá)分析：采用Trizol試劑盒提取黑麥草葉片總RNA，用Nanodrop 2000檢測(cè)濃度和純度，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)完整性。根據(jù)Fermentas cDNA synthesis 試劑盒說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。參考TaKara 公司的SYBR System操作手冊(cè)，采用ABI 7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃ 5 s，52～55 ℃ 20 s，40個(gè)循環(huán)。每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)?；蛱禺愋砸餅镕/R，以Actin基因?yàn)閮?nèi)參，序列參考Hu等[15]的方法進(jìn)行合成(表1)。根據(jù)得到的CT值，利用2-ΔΔCT法，分別計(jì)算目標(biāo)基因在不同處理下的相對(duì)表達(dá)量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SAS for Window 9.0軟件進(jìn)行試驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)方差分析，采用單因素方差分析和Duncan多重比較檢驗(yàn)不同處理間的差異(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫對(duì)狗牙根生長(zhǎng)速率的影響

從表2可看出，在適溫條件下3個(gè)狗牙根品種間的生長(zhǎng)速率無顯著性差異，保持在2.0～2.2 cm·d-1。隨著生長(zhǎng)溫度的降低，3個(gè)狗牙根品種的生長(zhǎng)速率均顯著下降。在亞適溫條件下，運(yùn)動(dòng)百慕大、天堂419和保定狗牙根的生長(zhǎng)速率分別下降至適溫的73%，66%和60%，而溫度下降至冷害時(shí)，生長(zhǎng)速率則分別下降至適溫的25%，17%和11%。凍害溫度下，3個(gè)狗牙根品種均停止生長(zhǎng)，生長(zhǎng)速率為零。

表1 試驗(yàn)中所用基因及其引物序列Table 1 Genes and primers used in the experiment

F: 正向Forward; R: 反向Reverse.

表2 低溫脅迫對(duì)狗牙根生長(zhǎng)速率的影響Table 2 Effect of low temperature stress on growth rate in bermudagrass (cm·d-1)

注：同行中不同大寫字母表示同一品種在不同溫度處理下差異顯著，同列中不同小寫字母表示同一溫度處理下不同品種之間差異顯著(P<0.05)。下同。

Note: Means in a row followed by the different upper-case letters indicate significant difference among temperature treatments in a cultivars, values followed by the different lower-case letters in a column indicate significant difference among cultivars within a temperature treatment atP<0.05 level. The same below.

2.2 低溫脅迫對(duì)狗牙根葉綠素?zé)晒?Fv/Fm)的影響

從表3可知，隨著溫度的降低，3個(gè)狗牙根品種葉片的Fv/Fm值均呈下降趨勢(shì)，但不同耐寒性品種其Fv/Fm值下降程度不一樣。在適溫條件下，3個(gè)狗牙根品種葉片的Fv/Fm值無顯著性差異；在亞適溫條件下，運(yùn)動(dòng)百慕大的Fv/Fm值與天堂419間無顯著性差異，天堂419與保定狗牙根差異不顯著；當(dāng)溫度下降至冷害和凍害時(shí)，運(yùn)動(dòng)百慕大的Fv/Fm值均顯著高于天堂419和保定狗牙根兩個(gè)品種，但在冷害溫度時(shí)天堂419和保定狗牙根間無顯著性差異，當(dāng)溫度下降至凍害時(shí)天堂419的Fv/Fm值顯著高于保定狗牙根。

表3 低溫脅迫對(duì)狗牙根葉綠素?zé)晒獾挠绊慣able 3 Effect of low temperature stress on Fv/Fm in bermudagrass

2.3 低溫脅迫對(duì)狗牙根光合作用的影響

2.3.1對(duì)凈光合速率的影響 由表4可知，3個(gè)狗牙根品種葉片的凈光合速率(Pn)均隨著溫度的降低而顯著下降，但不同耐寒性品種其Pn下降程度不同。在亞適溫條件下，運(yùn)動(dòng)百慕大、天堂419和保定狗牙根的Pn分別下降至適溫對(duì)照的69%，56%和47%；溫度下降至冷害時(shí)，則分別下降至適溫的35%，21%和14%。在凍害溫度下，3個(gè)品種的凈光合速率則下降至0.6～1.7 μmol CO2·m-2·s-1，分別僅為適溫對(duì)照條件下的10%，6%和4%。在適溫條件下3個(gè)品種的凈光合速率無顯著差異，但在亞適溫、冷害和凍害條件下，運(yùn)動(dòng)百慕大顯著高于天堂419和保定狗牙根。

表4 低溫脅迫對(duì)狗牙根凈光合速率的影響Table 4 Effect of low temperature stress on net photosynthetic rate (Pn) in bermudagrass (μmol CO2·m-2·s-1)

2.3.2對(duì)氣孔導(dǎo)度的影響 在適溫條件下，3個(gè)狗牙根品種葉片氣孔導(dǎo)度(Gs)無顯著差異(表5)。隨著溫度的降低，3個(gè)狗牙根品種葉片Gs均呈顯著下降趨勢(shì)，但下降程度差異較大，其中以保定狗牙根葉片Gs下降幅度最大，其次為天堂419，運(yùn)動(dòng)百慕大在3個(gè)品種中下降程度相對(duì)較小。在亞適溫條件下，運(yùn)動(dòng)百慕大、天堂419和保定狗牙根葉片Gs分別下降至適溫對(duì)照的56%，41%和32%；在冷害溫度下則分別下降至適溫對(duì)照的39%，25%和16%；當(dāng)溫度下降至零下后，運(yùn)動(dòng)百慕大、天堂419 和保定狗牙根葉片Gs急劇下降，分別僅為適溫的9%，7%和5%。

表5 低溫脅迫對(duì)狗牙根葉片氣孔導(dǎo)度的影響Table 5 Effect of low temperature stress on leaf stomotal conductance (Gs) in bermudagrass (mol H2O·m-2·s-1)

2.3.3對(duì)胞間CO2濃度的影響 由表6可知，在適溫、亞適溫和冷害條件下，3個(gè)狗牙根品種葉片的Ci隨著溫度的下降而降低，在凍害溫度下3個(gè)品種的Ci與對(duì)照相比則顯著上升。在適溫條件下3個(gè)狗牙根品種葉片的Ci無顯著性差異，但在亞適溫條件下，運(yùn)動(dòng)百慕大的Ci顯著高于天堂419和保定狗牙根；在冷害下，天堂419的Ci與運(yùn)動(dòng)百慕大和保定狗牙根差異不顯著，但運(yùn)動(dòng)百慕大的Ci顯著高于保定狗牙根。在亞適溫條件下，運(yùn)動(dòng)百慕大、天堂419和保定狗牙根的Ci分別下降至適溫對(duì)照的76%，68%和62%，溫度下降至冷害時(shí)3個(gè)品種的Ci則分別下降至適溫對(duì)照的64%，57%和48%。在凍害條件下，運(yùn)動(dòng)百慕大、天堂419和保定狗牙根的Ci則分別下升高了13.9%，17%和18.9%。

2.3.4對(duì)蒸騰速率的影響 由表7可知，3個(gè)狗牙根品種葉片Tr均隨著溫度的下降而降低，其中以保定狗牙根下降幅度最大，運(yùn)動(dòng)百慕大下降幅度最小，天堂419居中。在亞適溫條件下，運(yùn)動(dòng)百慕大、天堂419和保定狗牙根的Tr分別下降至適溫對(duì)照的61%，45%和43%，溫度下降至冷害時(shí)3個(gè)品種的Tr則分別下降至適溫對(duì)照的21%，13%和10%。當(dāng)溫度下降至凍害時(shí)，運(yùn)動(dòng)百慕大、天堂419和保定狗牙根的Tr分別下降至適溫對(duì)照的11%，7%和4%。

表6 低溫脅迫對(duì)狗牙根葉片胞間CO2濃度的影響Table 6 Effect of low temperature stress on leaf intercellular CO2 concentration (Ci) in bermudagrass (μmol CO2·mol-1)

表7 低溫脅迫對(duì)狗牙根葉片蒸騰速率的影響Table 7 Effect of low temperature stress on leaf transpiration rate (Tr) in bermudagrass (mmol H2O·m-2·s-1)

2.4 低溫脅迫對(duì)狗牙根葉片H2O2含量和O2·-產(chǎn)生速率的影響

由表8可知，隨著處理溫度的下降，3個(gè)狗牙根品種葉片的O2·-產(chǎn)生速率均顯著升高。在適溫條件下，O2·-產(chǎn)生速率在3個(gè)狗牙根品種中無顯著差異，但在亞適溫、冷害和凍害溫度下，保定狗牙根葉片的O2·-產(chǎn)生速率最高，運(yùn)動(dòng)百慕大葉片的O2·-產(chǎn)生速率最低，天堂419居中。

表8 低溫脅迫對(duì)狗牙根葉片O2·-產(chǎn)生速率的影響Table 8 Effect of low temperature stress on leaf O2·- production rate in bermudagrass (μmol·min-1·g-1 fresh weight)

由表9可知，3個(gè)狗牙根品種葉片的H2O2含量均隨著溫度的下降而顯著升高，但升高程度不同。在亞適溫條件下，運(yùn)動(dòng)百慕大、天堂419和保定狗牙根葉片的H2O2含量分別升高至適溫對(duì)照的1.4，1.6和1.6倍；在冷害處理下，3個(gè)品種葉片的H2O2含量分別升高至適溫對(duì)照的2.1，2.9和3.5倍；當(dāng)溫度下降至凍害時(shí)，3個(gè)品種葉片的H2O2含量分別升高至適溫對(duì)照的3.4，4.6和4.9倍。

2.5 低溫脅迫對(duì)狗牙根抗氧化酶活性的影響

2.5.1對(duì)SOD活性的影響 從表10可以看出，隨著處理溫度的下降，運(yùn)動(dòng)百慕大葉片SOD活性呈顯著上升趨勢(shì)，在亞適溫、冷害和凍害條件下均顯著高于適溫對(duì)照，而天堂419和保定狗牙根葉片SOD活性在亞適溫下與適溫對(duì)照差異不顯著，在冷害和凍害條件下顯著高于適溫對(duì)照。在適溫和亞適溫處理?xiàng)l件下，3個(gè)狗牙根品種間葉片SOD活性無顯著差異，在冷害和凍害條件下，運(yùn)動(dòng)百慕大葉片SOD活性顯著高于天堂419和保定狗牙根，其中保定狗牙根的活性最低。

表9 低溫脅迫對(duì)狗牙根葉片H2O2含量的影響Table 9 Effect of low temperature stress on leaf H2O2 content in bermudagrass (μmol·mg-1 protein)

表10 低溫對(duì)狗牙根葉片SOD活性的影響Table 10 Effect of low temperature stress on leaf SOD activity in bermudagrass cultivars(U·min-1·mg-1 protein)

2.5.2對(duì)POD活性的影響 從表11可以看出，3個(gè)狗牙根品種葉片的POD活性均隨著處理溫度的下降而呈上升趨勢(shì)，其中以運(yùn)動(dòng)百慕大上升幅度更大，保定狗牙根上升幅度最小。在適溫和亞適溫處理?xiàng)l件下，3個(gè)狗牙根品種間葉片POD活性無顯著差異，在冷害條件下，運(yùn)動(dòng)百慕大葉片POD活性顯著高于保定狗牙根，但與天堂419無顯著差異，在凍害條件下，運(yùn)動(dòng)百慕大葉片POD活性顯著高于天堂419和保定狗牙根，其中保定狗牙根的活性最低。

表11 低溫對(duì)狗牙根葉片POD活性的影響Table 11 Effect of low temperature stress on leaf POD activity in bermudagrass cultivars (U·min-1·mg-1 protein)

2.5.3對(duì)CAT活性的影響 從表12可以看出，隨著處理溫度的下降，3個(gè)狗牙根品種的CAT活性均呈顯著升高趨勢(shì)。在適溫和亞適溫處理?xiàng)l件下，3個(gè)品種間葉片CAT活性無顯著性差異，但在冷害和凍害條件下，運(yùn)動(dòng)百慕大的CAT活性最高，保定狗牙根的CAT活性最低，天堂419居中。在亞適溫條件下，運(yùn)動(dòng)百慕大、天堂419和保定狗牙根葉片的CAT活性分別升高至對(duì)適溫對(duì)照的1.24，1.21和1.22倍，在冷害溫度下，3個(gè)品種的CAT活性分別升高至適溫對(duì)照的1.74，1.61和1.59倍，當(dāng)溫度下降至凍害時(shí)，3個(gè)品種的CAT活性分別升高至適溫對(duì)照的2.19，1.89和1.73倍。

2.5.4對(duì)APX活性的影響 從表13可以看出，隨著處理溫度的降低，3個(gè)狗牙根品種葉片的APX活性均呈上升趨勢(shì)，其中運(yùn)動(dòng)百慕大上升幅度最大。在冷害處理下，運(yùn)動(dòng)百慕大、天堂419和保定狗牙根葉片APX活性分別升高至適溫對(duì)照的1.39，1.31和1.48倍，當(dāng)溫度下降至凍害時(shí)，3個(gè)品種的APX活性分別升高至適溫對(duì)照的1.62，1.42和1.55倍。在適溫和亞適溫處理?xiàng)l件下，3個(gè)狗牙根品種間葉片APX活性無顯著差異，但是在冷害和凍害處理下，運(yùn)動(dòng)百慕大葉片APX活性顯著高于天堂419和保定狗牙根。

表12 低溫對(duì)狗牙根葉片CAT活性的影響Table 12 Effect of low temperature stress on leaf CAT activity in bermudagrass (U·min-1·mg-1 protein)

表13 低溫對(duì)不同狗牙根品種葉片APX活性的影響Table 13 Effect of low temperature stress on leaf APX activity in bermudagrass (U·min-1·mg-1 protein)

2.6 低溫脅迫對(duì)狗牙根基因表達(dá)的影響

2.6.1對(duì)抗氧化酶基因表達(dá)的影響 由圖1可以看出，低溫誘導(dǎo)了3個(gè)狗牙根品種葉片抗氧化酶基因的上調(diào)表達(dá)，且隨著處理溫度的下降，其表達(dá)水平呈上升趨勢(shì)，但不同品種上調(diào)表達(dá)的幅度不同，其中在運(yùn)動(dòng)百慕大中上調(diào)表達(dá)幅度最大。在亞適溫和冷害溫度處理?xiàng)l件下，除了POD酶基因外，運(yùn)動(dòng)百慕大葉片SOD、CAT和APX酶基因的表達(dá)水平均顯著高于天堂419和保定狗牙根；在凍害溫度處理下，運(yùn)動(dòng)百慕大葉片SOD、POD、CAT和APX酶基因的表達(dá)水平均顯著高于天堂419和保定狗牙根，而保定狗牙根葉片SOD和APX酶基因表達(dá)量又顯著低于天堂419。

2.6.2對(duì)耐寒相關(guān)基因表達(dá)的影響 由圖2可知，低溫脅迫誘導(dǎo)了3個(gè)狗牙根品種葉片LEA,CBF1和COR基因的表達(dá)量顯著上調(diào)，且隨著處理溫度的下降，其表達(dá)水平均呈顯著上升趨勢(shì)，尤其是在耐寒性較強(qiáng)的運(yùn)動(dòng)百慕大中上調(diào)表達(dá)幅度更大。在亞適溫、冷害和凍害處理下，運(yùn)動(dòng)百慕大葉片LEA基因的表達(dá)量顯著高于天堂419和保定狗牙根，但天堂419和保定狗牙根間無顯著差異；在亞適溫和凍害處理下，運(yùn)動(dòng)百慕大葉片的CBF1基因表達(dá)水平顯著高于另外2個(gè)品種，并且天堂419的表達(dá)水平顯著高于保定狗牙根，但在冷害處理下，CBF1基因的表達(dá)水平在運(yùn)動(dòng)百慕大和天堂419間無顯著差異，但都顯著高于保定狗牙根；在亞適溫、冷害和凍害處理下，運(yùn)動(dòng)百慕大葉片COR基因的表達(dá)量顯著高于天堂419和保定狗牙根，但在亞適溫和冷害條件下天堂419和保定狗牙根間無顯著差異，而在凍害條件下，天堂419葉片COR基因的表達(dá)水平顯著高于保定狗牙根。

圖2 低溫脅迫對(duì)狗牙根葉片LEA, CBF1和COR基因表達(dá)的影響Fig.2 Effect of low temperature stress on the expression levels of LEA, CBF1 and COR genes in leaves of bermudagrass

3 討論

3.1 低溫對(duì)狗牙根光合生理的影響

光合作用既是植物生長(zhǎng)發(fā)育的基礎(chǔ)，也是所有生物的能量來源。植物的光合作用是低溫對(duì)植物影響的主要生理過程之一[16]，而光合作用的各個(gè)環(huán)節(jié)包括光能吸收、氣體交換、碳同化過程等最易受低溫脅迫的影響[17]。因此，在一定程度上光合作用的高低反映了植株生長(zhǎng)勢(shì)的大小和抗逆性的強(qiáng)弱[18]。本研究結(jié)果表明，隨著處理溫度的降低，3個(gè)狗牙根品種的Pn、Ci、Gs和Tr均顯著下降，但是在運(yùn)動(dòng)百慕大中下降較為緩慢，而在保定狗牙根中下降較快，表明低溫脅迫影響了狗牙根的光能吸收、氣體交換、碳同化等光合作用過程，造成光合作用原料(CO2)供給不足, 產(chǎn)物運(yùn)輸受阻, 凈光合速率(Pn)降低,植株生長(zhǎng)勢(shì)減弱，而且耐寒性較強(qiáng)的品種在低溫下能維持相對(duì)較高的光合作用，這與在茄子(Solanummelongena)、番茄(Lycopersiconesculentum)、玉米(Zeamays)、西瓜(Citrulluslanatus)、黃瓜(Cucumissativus)等作物中的研究結(jié)果一致[19-22]。在亞適溫和冷害處理下，3個(gè)狗牙根品種的Pn皆隨著Ci的下降而降低，表明Pn的下降由氣孔因素引起，而在凍害處理下，Pn顯著下降而Ci卻顯著升高，表明Pn的下降不是由氣孔因素造成，而可能是由葉綠體結(jié)構(gòu)破損、光合酶活性和CO2同化速率降低等非氣孔因素導(dǎo)致，以造成氣孔關(guān)閉及胞間CO2的積累，這與國(guó)內(nèi)外有關(guān)研究結(jié)論類似[21-25]。該現(xiàn)象可能與低溫脅迫程度有關(guān), 輕度和中度低溫脅迫導(dǎo)致光合速率降低的原因是氣孔限制, 重度低溫脅迫導(dǎo)致凈光合速率降低的原因?yàn)榉菤饪滓蛩叵拗啤?/p>

光抑制是植物普遍存在的現(xiàn)象，發(fā)生光抑制時(shí)過剩的光能會(huì)對(duì)葉片光合機(jī)構(gòu)造成傷害，致使Fv/Fm下降[26]。葉綠素?zé)晒鈪?shù)Fv/Fm常被用作研究逆境脅迫對(duì)植物造成傷害程度的重要指標(biāo)[27]。Fv/Fm值的高低可反映PSⅡ原初光能轉(zhuǎn)換效率的快慢，其值降低表明植物受到光抑制，且低溫處理下變化幅度越小說明植株耐低溫能力越強(qiáng)[28]。何勇等[29]研究結(jié)果表明，低溫弱光下辣椒幼苗光合作用減弱，最大光化學(xué)效率下降，且隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，降幅逐漸增大。樊治成等[30]對(duì)西葫蘆(Cucurbitapepo)進(jìn)行低溫處理，結(jié)果表明，不同品種西葫蘆的Fv/Fm與溫度呈極顯著負(fù)相關(guān)，并且溫度越低恢復(fù)能力越差，F(xiàn)v/Fm可作為西葫蘆品種抗冷性篩選的鑒定指標(biāo)。本試驗(yàn)結(jié)果表明，隨著溫度的下降，3個(gè)狗牙根品種葉片F(xiàn)v/Fm呈下降趨勢(shì)，表明低溫脅迫使狗牙根葉片光系統(tǒng)Ⅱ(PSⅡ)活性中心受損，抑制了光合作用的原初反應(yīng)，這與Hu 等[15]、楊猛等[21]、侯偉等[22]、陳梅等[31]、Carrasco等[32]和莫億偉等[33]所得的研究結(jié)果一致。Fv/Fm隨著低溫脅迫程度的增加而顯著降低，但在相同低溫處理下運(yùn)動(dòng)百慕大>天堂419>保定狗牙根，因此可判斷保定狗牙根對(duì)低溫相對(duì)較敏感，葉片PSⅡ受損較嚴(yán)重，耐寒較弱，而運(yùn)動(dòng)百慕大下降幅度相對(duì)較小，耐寒性則較強(qiáng)，天堂419居中，這與在玉米[28]、甘蔗(Saccharumofficinarum)[34]、南瓜(Cucurbitamoschata)[35]、茶樹(Camelliasinensis)[36]、煙草(Nicotianatabacum)[37]等植物的研究結(jié)果一致。

3.2 低溫對(duì)狗牙根抗氧化酶活性及其基因表達(dá)的影響

在正常生長(zhǎng)條件下，植物體內(nèi)的活性氧(reactive oxyen species, ROS)產(chǎn)生與清除處于動(dòng)態(tài)平衡而不會(huì)導(dǎo)致植物細(xì)胞膜受到傷害。但是在逆境條件下這種平衡常被打破，產(chǎn)生大量的活性氧而造成細(xì)胞膜脂過氧化反應(yīng)，導(dǎo)致膜系統(tǒng)損傷和細(xì)胞氧化[38]。植物為保護(hù)自身免受ROS的傷害，體內(nèi)存在著超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)和抗壞血酸過氧化物酶(APX)等內(nèi)源抗氧化防護(hù)系統(tǒng)，使體內(nèi)活性氧保持動(dòng)態(tài)平衡，從而減輕或緩解逆境傷害[39]。本研究顯示，在低溫處理?xiàng)l件下，3個(gè)狗牙根品種葉片中的H2O2含量以及O2·-產(chǎn)生速率均隨著處理溫度的降低而顯著升高，表明低溫對(duì)狗牙根植株細(xì)胞造成了氧化傷害，而葉片的SOD、POD、CAT和APX基因的表達(dá)水平和酶活性均隨著處理溫度的降低而逐漸升高，表明低溫和活性氧的產(chǎn)生誘導(dǎo)了細(xì)胞內(nèi)抗氧化防御的增強(qiáng)，以清除過多的ROS；但是在3個(gè)狗牙根品種中，運(yùn)動(dòng)百慕大葉片的ROS較低，而SOD、POD、CAT和APX基因的表達(dá)水平和酶活性較高，表明在狗牙根中抗氧化防御系統(tǒng)的強(qiáng)弱與其耐寒能力顯著相關(guān)，這與孫宗玖等[7]對(duì)4份來自全國(guó)不同區(qū)域的狗牙根在-25～0 ℃低溫處理下的研究結(jié)果類似，抗寒性強(qiáng)的植株內(nèi)具有較高的抗氧化酶活性。但是，目前對(duì)低溫下植物抗氧化酶活性的研究結(jié)論存有差異。周艷虹等[40]研究結(jié)果表明，黃瓜幼苗在低溫處理后SOD、POD活性上升，彭金光等[41]研究認(rèn)為，低溫增加了耐性西瓜品種SOD、POD等酶活性，而敏感性品種抗性酶活性呈先增后減的變化趨勢(shì)。Back等[42]研究表明，短期的低溫鍛煉會(huì)使植物體內(nèi)SOD、POD等酶活性升高，有利于植株在經(jīng)受更低溫度或更長(zhǎng)時(shí)間的低溫脅迫時(shí)維持較高的抗寒力。徐田軍等[43]研究表明，輕度脅迫(低溫脅迫2～3 d)使玉米幼苗SOD、POD活性上升, 而CAT的活性呈下降的趨勢(shì)，重度脅迫(低溫脅迫7 d)，玉米幼苗SOD、POD、CAT的活性呈顯著下降的趨勢(shì)。這些在低溫下抗氧化酶活性的變化差異可能與植物種類、耐性、處理溫度、脅迫程度等不同有關(guān)。

3.3 低溫對(duì)狗牙根耐寒相關(guān)基因表達(dá)的影響

CBF(C-repeat binding factor)轉(zhuǎn)錄因子家族在植物低溫信號(hào)通路中發(fā)揮重要作用[44]。在低溫信號(hào)傳遞過程中，CBF是感受上游信號(hào)并將外界低溫信號(hào)向下游傳遞的重要信號(hào)傳遞體。在低溫馴化過程中，CBF1基因的表達(dá)受到低溫條件的快速誘導(dǎo)，超表達(dá)某些CBF1基因家族成員，可使其調(diào)控的下游基因表達(dá)增強(qiáng)，植株的抗低溫能力得到改善[45]。低溫下可溶性糖的積累，提高了細(xì)胞的滲透勢(shì)，有利于細(xì)胞的滲透調(diào)節(jié)和保護(hù)膜結(jié)構(gòu)的完整性與穩(wěn)定性，從而提高了抗寒性。本研究結(jié)果顯示，低溫誘導(dǎo)了CBF1、COR和LEA基因在3個(gè)狗牙根品種葉片中的上調(diào)表達(dá)，并且表達(dá)水平隨溫度的降低而顯著增加，表明CBF1、COR和LEA基因的表達(dá)水平與受脅迫程度密切相關(guān)，并且在耐寒的運(yùn)動(dòng)百慕大中表達(dá)水平更高，而在前期的研究中發(fā)現(xiàn)低溫下果聚糖、果糖和蔗糖等可溶性糖含量顯著升高且在耐寒性強(qiáng)的狗牙根中更明顯[13]，表明低溫誘導(dǎo)CBF1、COR和LEA基因的表達(dá)可直接或間接地激活下游多種編碼糖合成基因的表達(dá)，進(jìn)而增加可溶性糖的含量，從而增強(qiáng)了植株的抗凍性[46]。迄今, 對(duì)CBF1作用的下游基因研究以COR基因較多。同時(shí)，COR15a調(diào)控編碼親水的LEA蛋白的表達(dá)，以增強(qiáng)植株抵抗冰凍低溫下葉綠體結(jié)構(gòu)的傷害[47]。本研究結(jié)果顯示，低溫脅迫下，也誘導(dǎo)了COR和LEA基因在3個(gè)狗牙根品種葉片中的上調(diào)表達(dá)，而且在運(yùn)動(dòng)百慕大中的表達(dá)水平顯著高于另外兩個(gè)品種，同時(shí)運(yùn)動(dòng)百慕大在低溫下具有較高的葉綠素含量、Fv/Fm和光合作用，表明低溫誘導(dǎo)COR和LEA基因的顯著上調(diào)表達(dá)有助于減輕低溫對(duì)植物葉綠體結(jié)構(gòu)的破壞，從而緩解因低溫而造成的光抑制和光合作用的降低，從而增強(qiáng)了植株的抗凍性[46]。

4 結(jié)論

低溫脅迫下狗牙根草坪質(zhì)量、生長(zhǎng)速率、Fv/Fm和光合作用顯著下降，葉片MDA和H2O2含量及O2·-產(chǎn)生速率顯著升高，其中在耐寒性弱的保定狗牙根中升高程度更大；狗牙根葉片抗氧化酶活性及抗氧化酶基因的表達(dá)水平隨著處理溫度的下降而顯著升高，其中在運(yùn)動(dòng)百慕大中更為明顯；狗牙根CBF1、COR和LEA基因表達(dá)量隨著溫度的下降而顯著升高，尤其是在耐寒狗牙根運(yùn)動(dòng)百慕大中更為顯著。低溫誘導(dǎo)的抗氧化酶和耐寒相關(guān)基因的上調(diào)表達(dá)，增強(qiáng)了細(xì)胞內(nèi)的抗氧化防御，有助于狗牙根植株維持較高的光合作用和細(xì)胞膜穩(wěn)定性，延緩葉片的衰老，從而提高了狗牙根的抗寒能力。