武炳超，張歡，童磊，杜昭昌，胡家菱，陳燚，張新全，劉偉，黃琳凱

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)科學(xué)系，四川 成都 611130)

狼尾草屬(Pennisetum)隸屬禾本科黍亞科, 蒺藜亞族, 為一年生或多年生禾本科牧草, 主要分布于熱帶、亞熱帶和溫帶地區(qū), 全世界約140種, 多數(shù)原產(chǎn)于非洲[1]。我國人工栽培利用的品種主要有多年生的象草(P.purpureum)、一年生的美洲狼尾草(P.americanum)及二者之間的雜交種等。

象草，別名紫狼尾草。20世紀40年代初，我國的四川、廣東從印度、緬甸引入試種，后傳入湖南、江蘇、福建等地，目前我國南方各省均有栽培[2]。象草是一種莖稈粗高、含糖量大、粗蛋白和無氮浸出物含量高的優(yōu)良牧草[3]。1975年，廣東、廣西等地一些畜牧場大面積種植象草飼喂奶牛，取得良好成效[4]。象草因其生長速度快、適口性好、營養(yǎng)價值豐富等特點被多種家畜喜食，其多作為青刈飼料，也可以青貯或者調(diào)制干草[5]。象草不僅僅是一種優(yōu)良的牧草，它還是一種重要的生物質(zhì)能源植物。美國在20世紀80年代展開了將象草作為能源植物的研究工作，證明了其可以用于乙醇、沼氣和電能的生產(chǎn)[6-9]。除此之外，象草還通過其高大的植株、豐富的葉片、分蘗以及發(fā)達的根系保護了土表，發(fā)揮著重要的生態(tài)效益[10]。近年來，因其株型優(yōu)美、抗逆性強、管理粗放、維護費用低等特點，已成為一種新型的園林造景植物[11]。

目前我國的國審狼尾草品種中有6個是象草品種，其中4個為引進品種，品種資源匱乏已經(jīng)成為象草進一步育種和利用的障礙。象草為4倍體，有28條染色體[12]。由于不能形成花粉或者雌蕊發(fā)育不良，因而一般不結(jié)實或結(jié)實率低，種子活性低，生產(chǎn)多用種莖繁殖，種質(zhì)資源遺傳多樣性低，限制了其育種利用[13-14]。誘變育種技術(shù)作為一種有效創(chuàng)造新種質(zhì)的育種手段，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于植物育種研究中[15]。其中γ射線可以通過輻射能量使生物體內(nèi)各種分子產(chǎn)生電離和激發(fā)，形成自由原子或者基團，他們相互反應(yīng)并與周圍大分子核酸和蛋白質(zhì)起反應(yīng)，引起染色體結(jié)構(gòu)變異，主要為易位、倒位和缺失[16-17]。為了創(chuàng)制新的象草種質(zhì)資源，豐富象草種質(zhì)資源多樣性，本實驗用60Co-γ射線照射受體材料，對誘變系材料表型性狀變異進行初步研究，并輔以分子標記的方法比較誘變系與對照材料之間的遺傳差異，探究輻射誘變對象草遺傳變異的影響，并確定最適宜的輻射誘變劑量，為以后的誘變系選育和品種改良提供理論和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

種植在四川農(nóng)業(yè)大學(xué)成都崇州實驗基地的象草061023003,來自中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院牧草種質(zhì)基因庫，均為同一無性系擴繁所得，以保證所選材料遺傳背景相同。挑選長勢相近且健康的植株割取種莖，種莖標準為含有2～3個莖節(jié)。

1.2 試驗方法

1.2.1象草臨界劑量與半致死劑量確定 2016年4月，將待輻射的種莖送往四川省農(nóng)科院輻射中心，采用60Co-γ射線進行照射，在運送過程中通過灑水保持種莖濕潤以減弱缺水對種莖的傷害。結(jié)合以前的研究，本試驗共設(shè)置了3個劑量梯度：10、20和30 Gy，劑量率1 Gy·min-1，以沒有經(jīng)過輻射處理的材料作為對照。每個劑量梯度分別輻射66個種莖。將輻射后的種莖種植于四川農(nóng)業(yè)大學(xué)崇州實驗基地，莖稈傾斜插入土壤，以土壤覆蓋一個莖節(jié)為準，株距1 m，行距2 m，常規(guī)大田栽培管理，一個月后統(tǒng)計成活率。其中，存活率為50%時的劑量為半致死劑量，存活率為40%時的劑量為臨界劑量[18]。

1.2.2植株表型性狀測定 等待存活的植株生長成熟后，對每個誘變系群體隨機選取15株進行形態(tài)指標測定。共測定6個指標，包括株高，分蘗數(shù)，莖節(jié)數(shù)，葉長，葉寬及莖粗。其中葉長、葉寬兩個指標選擇從下至上倒數(shù)第2片葉子進行測量，葉寬選擇葉片最寬處測量。除自然高度和分蘗數(shù)以外，其余指標均重復(fù)測量5次。

1.2.3SSR分子標記 3個誘變系群體選擇的植株同表型分析的植株，對每個存活材料隨機挑選2片健康的葉片，采用DNA提取試劑盒DNeasy Plant Mini kit (Qigene公司，美國)提取DNA。用分光光度計檢測DNA濃度，合格DNA樣品用TE稀釋至20 ng·μL-1。PCR反應(yīng)體系為15 μL，包括DNA 1.5 μL(20 ng·μL-1)，Taq酶0.3 μL，Master Mix 7.5 μL，上游引物和下游引物各0.6 μL(10 pmol·μL-1)，ddH2O 4.5 μL。PCR反應(yīng)程序為：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，58 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，共35個循環(huán)；最后72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。得到的擴增產(chǎn)物用8%聚丙烯酰胺凝膠在350 V電壓下電泳155 min，再用濃度為1 g·L-1的AgNO3染色15 min，顯影后照相保存。引物由本課題組象草轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)開發(fā)，序列交由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成。以3個誘變系群體中形態(tài)變化差異較大的單株DNA為模板，從50對SSR引物中篩選出20對多態(tài)性高、特異性強、條帶清晰的引物。

1.3 數(shù)據(jù)處理

對于形態(tài)指標采用Microsoft Excel 2007軟件處理實驗數(shù)據(jù)，采用統(tǒng)計分析軟件SPSS 19.0進行方差分析。對電泳得到的膠片進行標準化處理：在相同遷移位置，對穩(wěn)定且清晰的條帶進行統(tǒng)計，有帶記為“1”，無帶記為“0”，建立原始矩陣。根據(jù)表征矩陣，利用Excel 2007統(tǒng)計SSR擴增產(chǎn)物的條帶總數(shù)(total number of bands,TNB)和多態(tài)性條帶數(shù)(number of polymorphic bands,NPB)，計算多態(tài)性條帶所占的比率(percentage of polymorphic bands,PPB)和引物多態(tài)性信息含量(polymorphism information content,PIC)。使用Popgene 32軟件計算3個誘變系群體的基因多樣性、Shannon信息指數(shù)、多態(tài)性位點及多態(tài)性百分率,利用NTSYSpc 2.1(Version 2.10s)軟件計算遺傳相似系數(shù)(genetic similarity coefficient,GSC)并用Past 3繪制UPGMA聚類圖，以探究誘變系與對照材料間的親緣性。

2 結(jié)果與分析

2.1 象草輻射后存活率

經(jīng)過60Co-γ射線輻射后，得到3個誘變系群體，植株存活率隨著輻射劑量的增加而降低。當劑量為10 Gy時，存活植株數(shù)為62株，存活率為93.94%，輻射劑量為20 Gy時，存活植株數(shù)為49株，存活率為74.24%，而當劑量為30 Gy時，植株存活數(shù)為28株，存活率為42.42%，而對照組植株存活率為100%，預(yù)測30 Gy可能是象草的誘變適宜劑量。

2.2 未輻射象草與誘變系群體材料的表型差異

在3個誘變系群體中分別隨機選取15株進行形態(tài)指標的測量，發(fā)現(xiàn)3個誘變系群體中均有一個或多個形態(tài)指標與對照組群體存在顯著或極顯著差異(表1)。其中，10 Gy誘變系群體中，僅有葉長一個指標與對照群體差異顯著；20 Gy誘變系群體中株高、葉長、葉寬3個形態(tài)指標與對照群體差異顯著，其中葉長和葉寬兩個指標均達到極顯著差異水平；30 Gy誘變系群體中，共有4個形態(tài)指標與對照群體差異顯著，其中株高和葉寬與對照群體差異極顯著。

進一步對3個群體各形態(tài)變異系數(shù)進行計算(表2)，結(jié)果表明，除了葉長外，其余形態(tài)變異系數(shù)均在30 Gy誘變系群體中最大，說明該群體是差異最明顯的誘變系群體。對3個群體中不同形態(tài)變異系數(shù)進行比較，發(fā)現(xiàn)在10 Gy群體中最容易發(fā)生變異的形態(tài)依次為葉長、分蘗數(shù)、莖節(jié)數(shù)；在20 Gy群體中，最容易發(fā)生變異的形態(tài)依次為莖節(jié)數(shù)、葉長、分蘗數(shù)；而在30 Gy群體中，依次為莖節(jié)數(shù)、分蘗數(shù)、葉長。由此可見，分蘗數(shù)、莖節(jié)數(shù)和葉長對60Co-γ射線最為敏感，容易在受到輻射后發(fā)生變異。

表1 不同劑量輻射誘變系形態(tài)變異Table 1 The morphological variation of mutants by different dose of radiation

注： *代表在0.05水平與對照差異顯著；**代表在0.01水平與對照差異極顯著。

Note: * and ** indicate significant differences at 0.05 and 0.01 levels, respectively.

表2 各誘變系不同形態(tài)指標的變異系數(shù)Table 2 The coefficient of variation of morphological in different mutants group (%)

2.3 SSR標記差異

2.3.1遺傳多樣性分析 篩選出的20對引物共擴增出116條清晰可見的條帶，擴增片段大小為50～300 bp(圖1)，其中多態(tài)性條帶91條，多態(tài)性條帶比率為78.45%。每對SSR引物擴增的條帶數(shù)為3～8條，平均條帶數(shù)為5.8條，多態(tài)性條帶數(shù)為1～8條，平均為4.6條。多態(tài)信息含量(PIC)在0.032～0.758，平均為0.273，其中引物c104424_g1的PIC最大，引物c106150_g1的PIC最小(表3)。對3個誘變系群體的基因多樣性、Shannon信息指數(shù)、多態(tài)性位點及多態(tài)性百分率進行比較(表4)，發(fā)現(xiàn)在30 Gy誘變系群體中的4項指標均高于另外兩個誘變系群體，說明30 Gy的60Co-γ射線較另外兩個劑量能引起更多的遺傳變異，更加豐富的基因多樣性。

圖1 引物c100123_g1擴增產(chǎn)物電泳圖Fig.1 The amplification product electrophoresis of primer c100123_g1 M代表Marker，A1～A7分別代表F10-41、F10-42、F10-43、F10-45、F10-49、F10-52、F10-54，B1～B6分別代表F20-40、F20-46、F20-47、F20-51、F20-53、F20-54，C1～C7分別代表F30-38、F30-39、F30-40、F30-41、F30-42、F30-43、F30-44，CK代表對照材料。M stands for Marker; A1-A7 represent F10-41、F10-42、F10-43、F10-45、F10-49、F10-52、F10-54, respectively; B1-B6 represent F20-40、F20-46、F20-47、F20-51、F20-53、F20-54, respectively; C1-C7 represent F30-38、F30-39、F30-40、F30-41、F30-42、F30-43、F30-44, respectively; CK stands for control material.

2.3.2遺傳相似性及SSR標記位點差異分析 根據(jù)SSR引物擴增出的條帶，計算各誘變系群體與對照材料之間的遺傳相似系數(shù)。從表5中可知，對照材料與誘變系材料之間的遺傳相似系數(shù)在0.3793～0.9741，平均值為0.8565。3個誘變系群體與對照材料的遺傳相似系數(shù)有一定差異，在10 Gy誘變系群體中，遺傳相似系數(shù)在0.8017～0.9655，平均為0.8856；在20 Gy誘變系群體中，遺傳相似系數(shù)為0.7069～0.9741，平均為0.8563；在30 Gy群體中，遺傳相似系數(shù)為0.3793～0.9655，平均為0.8276。說明30 Gy誘變系群體與對照材料遺傳差異最大，發(fā)生的變異最多。在所有的誘變系材料中，F(xiàn)30-41與對照材料的遺傳相似系數(shù)最小，為0.3793，該材料與對照材料的遺傳差異最大，而F20-44與對照材料的遺傳相似系數(shù)最大，為0.9741，說明與對照材料的遺傳差異最小，親緣性最近。

表3 20對SSR引物序列及其擴增結(jié)果Table 3 20 SSR primers used in this study and their amplification results

表4 3個誘變系群體基于SSR標記的多態(tài)性分析Table 4 Polymorphism analysis of three mutants based on 20 SSR

表5 誘變系與對照材料間的遺傳相似系數(shù)Table 5 The genetic similarity coefficient between mutants and control materials

注：編號“F數(shù)字1-數(shù)字2”的數(shù)字1是輻射劑量，數(shù)字2是植株編號。下同。

Note: ID: “F number 1- number 2”, where number 1 is the dose of60Co-γ and number 2 is the plants’ number. The same below.

表6 對照材料與誘變系間的SSR標記差異Table 6 The difference of SSR markers between the base material and its mutants

圖2 誘變系的UPGMA聚類圖Fig.2 UPGMA dendrogram of mutants

根據(jù)擴增條帶， 對誘變系材料和對照材料間的差異位點數(shù)進行統(tǒng)計(表6)。發(fā)現(xiàn)在10 Gy誘變系材料與對照材料間的差異位點數(shù)在4～23個，平均13.3個；20 Gy誘變系材料與對照材料間的差異位點數(shù)在3～34個，平均16.7個；而30 Gy誘變系材料與對照材料間的差異位點數(shù)在4～66個，平均為19.3個。其中F30-41差異位點數(shù)達到66個，差異位點百分率為56.9%，說明該材料與對照材料間的遺傳差異最大。其次是F30-39，差異位點數(shù)達到65個，差異位點百分率為56.0%；而F20-44僅有3個差異位點，差異位點百分率為2.6%，說明該材料與對照材料間的遺傳差異最小。該結(jié)果與遺傳相似性分析結(jié)果一致，均說明當象草莖稈受到30 Gy的60Co-γ射線輻射時，更易引起變異。

圖3 突變體F30-39Fig.3 Mutants F30-39

2.4 UPGMA聚類分析

進一步對輻射后誘變系材料進行非加權(quán)平均法(UPGMA)聚類分析，以進一步探究不同輻射劑量所得誘變系材料與對照材料之間的親緣關(guān)系。以所得條帶原始矩陣構(gòu)建親緣關(guān)系系統(tǒng)樹(圖2)。由圖可見，所有材料可分為兩類，F(xiàn)30-39(圖3)與F30-41聚為一類且與對照材料遺傳距離最遠，說明它們的變異程度最大。而F20-44與對照材料聚為一類，說明幾乎沒有發(fā)生變異。而其他誘變系材料在不同距離與對照材料分開，說明其受到60Co-γ射線照射后，均產(chǎn)生不同程度的變異。

3 討論

不同的物種以及不同部位輻射對60Co-γ射線的敏感性不同，因此篩選最適宜的誘變劑量是輻射誘變育種的基礎(chǔ)。王文恩等[19]使用60Co-γ射線輻射野牛草(Buchloedactyloides)干種子，初步確定了促進野牛草干種子萌發(fā)的適宜輻射劑量為100～150 Gy，而日本結(jié)縷草(Zoysiajaponica)干種子輻射育種的半致死劑量為480 Gy[20]。以象草種莖為輻射材料進行誘變的報道較少，采用3個劑量的60Co-γ射線對象草種莖進行輻射，發(fā)現(xiàn)30 Gy誘變系群體的存活率為42.42%，接近臨界劑量的存活率，故推測30 Gy為象草種莖輻射誘變的適宜劑量。

象草不僅可以為草食動物提供大量優(yōu)質(zhì)牧草[21]，還具有一定的觀賞效果[22]。對輻射誘變系與對照材料表型性狀進行測定和分析是發(fā)現(xiàn)新品系的基礎(chǔ)。曾捷等[23]用60Co-γ射線輻射扁穗牛鞭草(Hemarthriacompressa)后，發(fā)現(xiàn)75%的誘變系葉片變小、株高變矮、莖變細。張彥芹等[24]也通過利用60Co-γ射線輻射高羊茅(Festucaelata)分化苗，得到了葉片變小、變細的高羊茅突變體。對狗牙根(Cynodondactylon)進行輻射誘變后，發(fā)現(xiàn)草層高度顯著降低，并且顯著影響了葉寬、葉長及節(jié)間直徑和密度[25]。本試驗發(fā)現(xiàn)3個誘變系群體的株高、莖節(jié)數(shù)、莖粗、葉長及葉寬等形態(tài)指標與對照材料相比，均有一個或多個指標顯著或極顯著減小，其中分蘗數(shù)、莖節(jié)數(shù)和葉長對60Co-γ射線最敏感，變異系數(shù)較高。此結(jié)果與前人研究結(jié)果基本一致，輻射誘變更傾向于產(chǎn)生植株變小的突變體[23-24]。其中，F(xiàn)10-42和F10-49的株高和莖節(jié)數(shù)均大于對照材料，是將來進行牧草育種的有潛力的新種質(zhì)。

SSR標記是共顯性分子標記，多態(tài)性豐富、易于鑒別基因型，被認為是最好的研究群體遺傳變異的分子標記之一[26]。例如黃婷等[27]利用SSR標記對6個多花黑麥草(Loliummultiflorum)品種進行遺傳差異分析并對品種進行有效的鑒定。本試驗通過篩選得到的20對SSR引物，對3個誘變系群體與對照材料的遺傳差異進行了鑒定，發(fā)現(xiàn)30 Gy誘變系群體的基因多樣性為0.36，Shannon信息指數(shù)為0.51，多態(tài)性位點89個，多態(tài)位點百分率76.72%，遺傳相似系數(shù)為0.8276，差異位點數(shù)19.3個,均大于10和20 Gy誘變系群體，表明該劑量更易產(chǎn)生豐富的遺傳變異。對所有誘變系群體進行UPGMA聚類分析，發(fā)現(xiàn)F30-39和F30-41聚為一類，與對照材料距離最遠，說明其遺傳差異最大，而其他材料也與對照材料不同程度的分開，說明不同劑量的60Co-γ射線均有可能產(chǎn)生突變體。甘蔗(Saccharumofficinarum)品種桂糖22號就是由60Co-γ射線輻射誘變育成的[28]。劉天增等[29]利用輻射誘變方法篩選海濱雀稗(Seashorepaspalum)突變體。甜菜(Betavulgaris)的耐旱突變體也是由輻射得到的，并且用ISSR分子標記進行了鑒定[30]。秦家友等[31]利用SSR標記對玉米(Zeamays)輻射誘變系進行遺傳差異研究，發(fā)現(xiàn)誘變系與基礎(chǔ)材料間存在真實的遺傳差異，本研究結(jié)果與此一致。本研究的結(jié)果僅僅鑒定了不同誘變系群體與對照材料之間分子水平上的遺傳差異，確定了最適宜象草種莖輻射的60Co-γ射線劑量，對于突變體的突變原因以及可能發(fā)生突變的基因的鑒定還有待進一步深入研究。

4 結(jié)論

不同劑量的60Co-γ射線均可誘導(dǎo)象草發(fā)生變異，其中分蘗數(shù)、莖節(jié)數(shù)和葉長對60Co-γ射線最為敏感，容易發(fā)生突變。結(jié)合不同劑量輻射誘變系表型及遺傳變異的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)30 Gy的誘變效率最高，可作為最適宜象草種莖輻射誘變的劑量。同時發(fā)現(xiàn)兩個顯著矮小化的突變體F30-39和F30-41，可為象草后續(xù)育種及基因挖掘研究提供材料。